Biyofilm İlişkili Hedefleme Staphylococcus aureus Resazurin Tabanlı İlaç-duyarlılık Deneyi

Bu prosedürün genel amacı, bir canlılık boyası kullanılarak antibiyotik duyarlılık testi için kapağa bağlı mandallar üzerinde 96 oyuklu bir plaka formatında bakteriyel biyo filmleri kolayca ve tekrarlanabilir bir şekilde büyütmektir. Bu yöntem, genellikle invivo enfeksiyon durumlarını daha iyi temsil eden biyofilm ile ilişkili hücreler üzerindeki aktiviteleri keşfederek antibiyotik keşfi ve geliştirme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, orta üç parçalı bir tahlilde önceden oluşturulmuş biyofilmlere kolayca meydan okuma ve ortak bir canlılık boyası kullanarak inhibisyonu belirleme yeteneğidir.

Başlamak için, besin açısından zengin bir ortamda biyofilm üreten bir organizma kültürü oluşturun. Staphylococcus aureus suşu Newman'ı bir gliserol sapından 10 mililitre Muller-Hinton ortamında aşılayın. S.aureus'un kullanımıyla ilgili tüm işleri eldivenlerle ve bir biyo-güvenlik kabini içinde gerçekleştirin.

Döner bir çalkalayıcı üzerinde 37 santigrat derecede 16 saat inkübe edin. Hesaplanan kültür hacmini bir santrifüj tüpüne ekleyin ve 10.000'de bir dakika döndürerek hücreleri pelet haline getirin Gs.To biyofilm aşısını hazırlayın, harcanan büyüme ortamını aspire edin ve hücre peletini 20 mililitre CRPMI'de yeniden süspanse edin. 200 mikrolitrelik çok kanallı bir pipet kullanarak, 25 mililitrelik bir rezervuardan, alt plakanın A'dan G'ye kadar olan sıralarının her birine 125 mikrolitre aşı ekleyin.

Sterilite kontrolü olarak H sırasının her bir kuyucuğuna 125 mikrolitre steril CRPMI ortamı doldurun. Mandal kapağını alın ve mandallar aşağı bakacak şekilde plaka tabanının üzerinde tutun. Tek tek mandalları ilgili kuyucuklarıyla dikkatlice hizalayın.

Plaka ve mandallar arasında fiziksel temastan kaçının. Hizalandıktan sonra kapağı dikkatlice aşağı indirin. Buharlaşmayı önlemek için kapağı plakaya parafin film ile kapatın ve sıkıca kapatarak sızdırmaz bir plastik torbaya koyun.

Buharlaşmayı en aza indirmek için torbadaki hava hacmini mümkün olduğunca düşük tutun. Plakayı 37 santigrat derecede 48 saat boyunca çalkalamadan %5'lik bir Karbondioksit inkübatörde inkübe edin. Biyofilm yarışmasının yapıldığı gün, 96 oyuklu yeni bir plaka alın ve oda sıcaklığına dengelenmiş 100 mikrolitre CRPMI, B'den H'ye kadar olan sıraların her birine ekleyin.

A200-A1 kuyularına 3.200 mikrolitre bileşik, A2-A4 kuyularına mikrolitre bileşik 3.200, A7-A6.200 kuyularına mikrolitre bileşik 9 ekleyin. Ve A10-A12 kuyularında 200 mikrolitre bileşik 4. Test bileşiklerini çok kanallı bir pipet kullanarak seri olarak seyreltin.

100 mikrolitreyi A sırasından B satırına aktararak başlayın ve karıştırın. Bu şekilde 100 mikrolitreyi kuyudan kuyuya aktarmaya devam edin. Her aktarımdan sonra karıştırın ve F satırında durun. Karıştırdıktan sonra, F sırasından 100 mikrolitreyi bir atık kabına atın.

Son olarak, son hacmi 200 mikrolitreye getirmek için çok kanallı bir pipet kullanarak plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre CRPMI ekleyin. 200 mikrolitre fosfat tamponlu salini, biyofilm başlatma plakasınınkiyle aynı boyutlara sahip oyuklara sahip taze, steril, 96 oyuklu bir plakaya ekleyin. Ardından, plastik torbayı ve parafin filmi inkübe edilmiş biyofilm başlatma plakasından çıkarın.

Biyofilme zarar verebileceğinden, mandallar ile plaka tabanı arasındaki temastan kaçınarak kapağı düz bir şekilde yukarı kaldırın. Sonraki OD600 analizi için alt kısmı saklayın. Peg kapağını PBS içeren plakaya yerleştirerek planktonik hücreleri durulayın.

Mandalları beş saniye boyunca batırın. Onları PBS'den kaldırın ve çivileri kuyu kenarlarına çarpmamaya dikkat ederek bir kez daha daldırın. Durulanmış mandal kapağını meydan okuma plakasına yerleştirin.

Biyofilme zarar vereceği ve tutarsız sonuçlara yol açacağı için mandallar ve alt plaka arasında gereksiz temastan kaçının. Plakayı parafin film ile kapatın ve daha önce olduğu gibi sızdırmaz bir plastik torbaya koyun. Plakayı sallamadan, 37 santigrat derecede 24 saat boyunca% 5 Karbondioksit inkübatörde inkübe edin.

Biyofilm başlatma plakasının altını alın ve çok kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuktaki bakterileri yeniden süspanse edin. H satırındaki sterilite kontrolleri dışındaki tüm kuyucuklarda meydana gelen büyümeyi doğrulamak için OD600'ü uygun bir mikroplaka okuyucu ile ölçün. Bir inkübasyon odası ile donatılmış ve resazurin dönüşümünü tespit etmek için kinetik floresan okumaları alabilen bir plaka okuyucu kullanın. 530 nanometre uyarma ve 590 nanometre emisyon kullanarak 24 saatlik kinetik floresan ölçümü ayarlayın.

Oda sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın ve plakanın her 20 dakikada bir okunmasını sağlayın. Plaka okuyucuyu, üreticinin talimatlarına göre plakanın altından ölçülecek şekilde ayarlayın. Çok kanallı bir pipet ile steril 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 mikrolitre PBS ekleyerek plakayı yıkamaya hazırlanın.

Daha sonra, 20 mililitre CRPMI ortamına mililitre başına 400 mikrolitre 0.8 miligram resazurin stok çözeltisi ekleyerek, miliilitre resazurin başına 16 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar biyofilm geri kazanım ortamı hazırlayın. Daha sonra, 96 oyuklu yeni bir plakanın her bir oyuğuna çok kanallı bir pipetle 150 mikrolitre biyofilm geri kazanım ortamı ekleyin. Meydan okuma plakasını inkübatörden bir biyo-güvenlik kabinine aktarın ve plastik torbayı ve sızdırmazlık filmini dikkatlice çıkarın.

Peg kapağını meydan okuma plakasından çıkarın ve daha önce olduğu gibi PBS'deki planktonik hücreleri durulayın, sonraki OD600 analizi için meydan okuma plakasının altını tutun. Durulamadan sonra, peg kapağını biyofilm geri kazanım ortamını içeren plakanın tabanına yerleştirin. Plakanın yan tarafını parafin film ile sarın, çevre kuyucuklarının dibini tıkamamaya dikkat edin.

Plakayı sardıktan hemen sonra, plaka okuyucuya yerleştirin ve daha önce yapılmış resazurin-kinetik protokolünü başlatarak 24 saatlik bir süre boyunca kinetik bir okuma başlatın. Meydan okuma sırasında meydana gelebilecek veya gelmeyebilecek planktonik hücrelerin büyümesini ölçmek için, bir mikroplaka okuyucu kullanarak tüm meydan okuma plakası tabanının OD600'ünü okuyun. Burada, bileşik konsantrasyonlarını titre etmek için iki tam seyreltme kullanan bir meydan okuma plakasının örnek bir düzeni gösterilmektedir.

Yetiştirilen biyofilmler neocuproin veya bakır kompleksi ile muamele edildi. 24 saat sonra meydan okuma plakası tabanının OD600 okumaları, neocuproine bakır kompleksinin, ancak tek başına neocuproine değil, 1.25 mikromolar veya daha yüksek konsantrasyonlarda tedavi edilen biyofilmlerden canlı hücrelerin dökülmesini ve ardından büyümesini önlediğini ortaya koydu. Karşılık gelen biyofilmler daha sonra resazurin testi ile test edildi.

24 saat sonra görsel inceleme, birden fazla plaka paralel olarak çalıştırılıyorsa hızlı, evet-hayır yanıtı sağlar. Resazurin, canlı biyofilmlere sahip kuyucuklarda pembeye döner, ancak biyofilm yok edildiğinde mavi kalır. Resazurinin dönüşümünün kinetik bir okuması, burada gentamisin ile gösterildiği gibi, biyofilm canlılığı üzerindeki konsantrasyona bağlı etkileri ortaya çıkarabilir.

Boya dönüşümünün başlangıcındaki konsantrasyona bağlı gecikme, biyofilmin canlılığında bir azalmanın göstergesidir. Bu prosedürü denerken, mandalları kuyuların kenarına çarpmamayı unutmamak önemlidir.