Biyofilm İlişkili Hedefleme

Bu prosedürün genel amacı, bir canlılık boyası kullanarak antibiyotik duyarlılık testi yapmak amacıyla, 96 kuyucuklu plaka formatında, kapağa takılı pinler üzerinde bakteriyel biyofilmleri kolay ve tekrarlanabilir şekilde büyütmektir. Bu yöntem, sıklıkla in vivo enfeksiyon durumlarını daha iyi temsil eden biyofilmle ilişkili hücreler üzerindeki aktiviteleri inceleyerek, antibiyotik keşfi ve geliştirme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, önceden oluşturulmuş biyofilmleri üç aşamalı bir deney düzeneğinde kolayca test edebilme ve yaygın bir canlılık boyası kullanarak inhibisyonu belirleyebilme yeteneğidir.

Başlamak için, besin açısından zengin bir ortamda biyofilm üreten organizmadan bir kültür yetiştirin. Bir gliserol stokundan Staphylococcus aureus Newman suşunu 10 mililitre Muller-Hinton ortamına inoküle edin. S.aureus ile yapılan tüm işlemleri eldiven kullanarak ve bir biyogüvenlik kabini içerisinde gerçekleştirin.

Rotalı çalkalayıcıda 37 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin. Hesaplanan kültür hacmini bir santrifüj tüpüne ekleyin ve 10.000 G'de bir dakika boyunca döndürerek hücreleri çöktürün. Biyofilm inokulumunu hazırlamak için harcanmış büyüme ortamını aspire edin ve hücre peletini 20 ml CRPMI içinde yeniden süspanse edin. 200 µL çok kanallı pipet kullanarak, 25 ml'lik bir rezervuardan her birine 125 µL inokulumu alt plakanın A'dan G'ye kadar olan sıralarının her bir kuyucuğuna ekleyin.

Sterilite kontrolü olarak H sırasındaki her kuyuya 125 µL steril CRPMI besiyeri doldurun. Pim kapagını alın ve pimler aşağı bakacak şekilde plaka tabanının üzerinde tutun. Münferit pimleri ilgili kuyularla dikkatlice hizalayın.

Plaka ile pimler arasında fiziksel temastan kaçının. Hizalama tamamlandıktan sonra, kapağı dikkatlice aşağı indirin. Buharlaşmayı önlemek için kapağı parafin film ile plakaya sabitleyin ve sızdırmaz plastik bir torbaya yerleştirerek sıkıca kapatın.

Buharlaşmayı en aza indirmek için torbadaki hava hacmini mümkün olduğunca düşük tutun. Plakayı, %5 Karbondioksit inkübatöründe, çalkalamadan 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. Biyofilm challenge gününde, taze bir 96 kuyucuklu plak alın ve B'den H'ye kadar olan satırların her bir kuyucuğuna oda sıcaklığına getirilmiş 100 µL CRPMI ekleyin. Dört adet test bileşiğini, istenen final konsantrasyonun 2 katı olacak şekilde, 1,0 mL CRPMI içerisinde ayrı ayrı seyreltin.

A1-A3 kuyucuklarına 200 µL bileşik 1, A4-A6 kuyucuklarına 200 µL bileşik 2, A7-A9 kuyucuklarına 200 µL bileşik 3 ve A10-A12 kuyucuklarına 200 µL bileşik 4 ekleyin. Test bileşiklerini çok kanallı bir pipet kullanarak seri olarak seyreltin.

100 µL'yi A sırasından B sırasına aktararak başlayın ve karıştırın. Bu şekilde, kuyucuktan kuyucuğa 100 µL aktarmaya devam edin. Her aktarma işleminden sonra karıştırın ve F sırasına geldiğinizde durun. Karıştırma işleminden sonra, F sırasındaki 100 µL'yi bir atık kabına boşaltın.

G ve H sıralarına herhangi bir sıvı aktarmayın. Son olarak, final hacmini 200 µL'ye getirmek için çok kanallı bir pipet kullanarak plakanın her kuyucuğuna 100 µL CRPMI ekleyin. Biyofilm başlatma plakasıyla aynı boyutlardaki kuyucuklara sahip taze ve steril bir 96 kuyucuklu plakaya 200 µL fosfat tamponlu salin ekleyin. Ardından, inkübe edilmiş biyofilm başlatma plakasındaki plastik torbayı ve parafin filmi çıkarın.

Peglerin plaka tabanıyla temas etmemesine dikkat ederek kapağı doğrudan yukarı doğru kaldırın, çünkü bu durum biyofilme zarar verebilir. Sonraki OD600 analizi için alt kısmı saklayın. Peg kapağını PBS içeren plakanın üzerine yerleştirerek planktonik hücreleri yıkayın.

Pinleri beş saniye boyunca daldırın. Pinleri PBS'den çıkarın ve pinlerin kuyucuk kenarlarına çarpmamasına dikkat ederek bir kez daha daldırın. Durulanan pinli kapağı challenge plakasına yerleştirin.

Peglerin alt plaka ile gereksiz temasından kaçının; aksi takdirde biyofilm zarar görecek ve bu durum tutarsız sonuçlara yol açacaktır. Plakayı parafin film ile kapatın ve daha önce olduğu gibi kapatılabilir plastik bir torbaya yerleştirin. Plakayı, çalkalamadan, %5 Karbondioksit inkübatöründe 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin.

Biyofilm başlatma plağının alt kısmını alın ve her kuyucuktaki bakterileri çok kanallı bir pipet kullanarak yeniden süspanse edin. H satırındaki sterilite kontrolleri dışındaki tüm kuyucuklarda büyüme gerçekleştiğini doğrulamak için uygun bir mikroplaka okuyucu ile OD600 değerini ölçün. Resazurin dönüşümünü tespit etmek için inkübasyon odasına sahip ve kinetik floresan okumaları yapabilen bir plaka okuyucu kullanın. 530 nanometre eksitasyon ve 590 nanometre emisyon kullanarak 24 saatlik bir kinetik floresan ölçümü ayarlayın.

Hazne sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın ve plakanın her 20 dakikada bir okunmasını sağlayın. Plaka okuyucuyu, üretici talimatlarına uygun olarak plakanın altından ölçüm yapacak şekilde ayarlayın. Çok kanallı bir pipetle steril bir 96 kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna 200 µL PBS ekleyerek plakayı yıkamaya hazırlayın.

Ardından, 20 mL CRPMI besiyerine 0,8 mg/mL resazurin stok çözeltisinden 400 µL ekleyerek, nihai konsantrasyonu 16 µg/mL resazurin olacak şekilde biyofilm geri kazanım besiyerini hazırlayın. Daha sonra, çok kanallı bir pipet yardımıyla taze bir 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 150 µL biyofilm geri kazanım besiyeri ekleyin. Challenge plakasını inkübatörden biyogüvenlik kabinine taşıyın ve plastik torbayı ve sızdırmazlık filmini dikkatlice çıkarın.

Challenge plakasının peg kapağını çıkarın ve daha önce yaptığınız gibi planktonik hücreleri PBS ile durulayın; challenge plakasının tabanını sonraki OD600 analizi için saklayın. Durulama işleminden sonra, peg kapağı biofilms geri kazanım ortamı içeren plaka tabanına yerleştirin. Çevresel kuyucukların tabanını tıkamadığınızdan emin olarak plakanın kenarını parafin film ile sarın.

Plakayı sarar sarmaz plaka okuyucuya yerleştirin ve önceden oluşturulmuş resazurin-kinetik protokolünü başlatarak 24 saatlik bir süre boyunca kinetik okuma yapın. Challenge sırasında meydana gelmiş olabilecek veya gelmemiş olabilecek planktonik hücrelerin büyümesini miktarlandırmak için, tüm challenge plaka tabanının OD600 değerini bir mikroplaka okuyucu kullanarak okuyun. Burada, bileşik konsantrasyonlarını titre etmek için iki tam dilüsyon kullanan bir challenge plakasının örnek düzeni gösterilmektedir.

Geliştirilen biyofilmler neocuproine veya onun bakır kompleksi ile işleme tabi tutuldu. 24 saat sonra challenge plak tabanının OD600 okumaları, 1.25 micromolar veya üzerindeki konsantrasyonlarda, tek başına neocuproine'in aksine, neocuproine bakır kompleksinin işlenmiş biyofilmlerden canlı hücrelerin kopmasını ve ardından büyümesini engellediğini ortaya koydu. Ardından, ilgili biyofilmler resazurin testi ile analiz edildi.

Birden fazla plak paralel olarak çalıştırılıyorsa, 24 saat sonra yapılan görsel inceleme hızlı bir evet-hayır yanıtı sağlar. Resazurin, canlı biyofilmlerin bulunduğu kuyucuklarda pembeye döner, ancak biyofilm ortadan kaldırıldığında mavi kalır. Resazurin dönüşümünün kinetik okuması, burada gentamisin ile gösterildiği gibi, biyofilm canlılığı üzerindeki konsantrasyona bağlı etkileri ortaya çıkarabilir.

Boya dönüşümünün başlangıcındaki konsantrasyona bağlı gecikme, biyofilmin canlılığındaki azalmanın bir göstergesidir. Bu prosedürü uygularken, pimlerin kuyucukların kenarlarına çarpmamasına dikkat etmek önemlidir.