Name: miRNA kullanarak Meme Kanseri Dokularındaki miRNA İfade Klinikopatolojik Analizi In Situ Melezleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Öğrenin meme kanserinde miRNA in situ hibridizasyonu ile mikro RNA lokalizasyonunu tespit etmeyi. Bu yöntem, tümör baskılayıcı rolleri anlamak için klinikopatolojik analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NIH hibesi (5R01 CA178386-03) ve HC'ye USC ASPIRE-1 hibesi tarafından desteklenmiştir. El yazması konusundaki yardımları için Vrushab Gowda'ya teşekkür ederiz.

Bu çalışma Kurumsal Gözden Chonnam Ulusal Üniversitesi Hwasun Hastanesi Yönetim Kurulu ve Güney Carolina Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Meme kanseri ve eşleşen bitişik normal meme doku oluşan TMA örnekleri Chonnam Ulusal Üniversitesi Hwasun Hastanesi, Kore Biobank Ağının bir üye Biobank tarafından temin edildi. 1. Solüsyon Hazırlama <ol><li> DNaz ve RNaz içermeyen su 1 L hazırlayın. diethylpyrocarbonate (DEPC) arıtılmış su kullanan tüm kimyasal çözümler olun. DEPC 500 ul su ile 1 L tedavi ve oda sıcaklığında 3 saat inkübe edilir. DEPC inaktive su Otoklav. Dikkat: karsinojen bilindiğinden DEPC teneffüs etmeyin. </li><li> DEPC arıtılmış su kullanılarak 10x PBS 1x PBS hazırlayın. </li><li> 20x SSC (NaCl 175.3 g ve 800 ml su içinde sodyum sitrat 88.2 g çözülür hazırlanması HCI 14 N çözelti bir kaç damla 7.0 pH ayarlamak ve wat 1 L ses seviyesini ayarlamakER),% 4 paraformaldehit,% 95 etanol,% 80 etanol DEPC işlenmiş su ile. </li><li> 8 trietanolamin ilave edildi ve DEPC ile muamele edilmiş su 590 ml HCI 1.05 ml ilave edilir ve asetilasyonu için asetik anhidrid 1.5 ml ilave ediniz. </li><li> tampon maddesi içinde 50 ug / ml proteinaz K hazırlama (50 mM Tris-HCI, DEPC pH 8.0 su muamele edilmiş). </li><li> formamid 500 ul 20x SSC 250 ul, 50x Denhardt çözeltisi, 100 uL, t-RNA 12.5 ul, ringa sperm DNA&#39;sı 2.5 ul, RVC 30 ul, bloke reaktif ve 50 ul 0.02 g oluşan hibridizasyon tamponu hazırlayın DEPC su. taze hazırlayın. </li></ol> 2. Meme Doku Bölümler <ol><li> Mikrotom ile 5 mikron formalin ile fikse parafine gömülü bölümleri kesmek ve slayt 14 şarj etmek bölüm uygulayın. Not: Burada kullanılan meme dokusu Kore Biobank Network önceden hazırlanmıştır. </li></ol> 3. Doku Hazırlanması <ol><li> fro parafin kaldır10 dakika boyunca, taze ksilen Coplin kavanoza 2x her bir slayt daldırarak doku m ve GKD 2 O etanol (% 100,% 95 ve% 80) ve azalan konsantrasyonlarda 5 dakika inkubasyon doku bölümü rehidrasyonu Davlumbaz bu adımı gerçekleştirin. </li><li> DEPC doku 5 dakika arıtılmış su bırakın. Bu noktada hidrofobik bariyer kalemle doku bölümünde etrafında sınırları yapmak. </li><li> PBS ile yıkama, ardından 15 dakika boyunca% 4 PFA doku çözmek. </li><li> PBS ile yıkama, ardından 10 dakika boyunca% 0.3 Triton X-100 / PBS doku bırakın. </li><li> 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 50 ug / ml Proteinaz K çözeltisi ile örnek inkübe edin. Daha sonra PBS ile bir yıkama ve ardından, oda sıcaklığında 5 dakika için, trietanolamin ve asetik anhidrid ile doku bölümleri inkübe edin. Hiçbir PBS yıkama Proteinaz K tedavisi ve trietanolamin / asetik anhidrit tedavisi arasında gereklidir. </li></ol> 4. Melezleme <ol><li> İyice ve incu doku yıkayınOda sıcaklığında 2 ila 3 saat için hibritleme tampon maddesi ile asitleme doku kesiti. Tipik 120 ul hibridizasyon tamponu doku bölümünü karşılamak için yeterli olduğunu. </li><li> Seyreltik 5&#39;-DIG 120 ul hibridizasyon çözeltisi içinde 3 uM nihai konsantrasyona kadar LNA etiketlenmiş prob. stok konsantrasyonu genellikle 40 ng / | il olduğu için, 120 ul hibridizasyon tamponu stok 3 ul ilave et ve 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;de karışım inkübe edin. </li><li> nemli bir oda içinde 54 ° C&#39;de (Tm) prob gece boyunca doku bölümü inkübe edin. Tipik 120 ul bir bölüm karşılamak için yeterlidir. İki ıslak kağıt havlu kullanılarak nem oluşturun. odasının ideal boyutu 8 inç 10 inç. </li><li> Not: Tm Farklı miRNA için farklı olabilir. 54 ° C miR-489 için söz olduğunu. </li></ol> 5. sıkılık yıkama <ol><li> 7 dakika boyunca 5x SSC ile doku yıkayın (melezleme aşamasından sonra, RNaz ücretsiz koşullar artık gerekli vardır). </li><li> doku kesiti wit yıkayın57 ° C &#39;de iki kez 7 dakika süre ile H, 1x SSC. </li><li> 57 ° C &#39;de, 7 dakika için 0,2 X SSC ile doku kesiti yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 0,2 X SSC ile doku kesiti yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca PBS içinde doku kesiti inkübe edin. </li></ol> 6. Engelleme <ol><li> (Tampon PBS 18 m 2 mi FBS, Tween-20, 10 ul BSA 3 ul bloke yapmak için. Mağazası 4 ° C&#39;de tampon bloke nemli bir oda içinde, 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloke edici tampon ile doku kesiti inkübe ° C). </li></ol> 7. Birincil Antikor Kuluçka ve Kalkınma <ol><li> bloke edici tampon içinde 300, anti-DIP-AP antikor ve gece boyunca 4 ° C &#39;de antikor ile doku kesiti inkübe: 1 seyreltin. </li><li> Her biri 5 dakika (geliştirme kiti tarafından sağlanan tampon maddesi) için, yıkama tamponu ile 3 kez bölümleri yıkayın. </li><li> CY-3 floresan ışık üretir alkalin fosfataz için bir ticari kit ile doku bölümü geliştirin. </li> &lt;li&gt; 5 dakika boyunca yıkama tamponu ile bölüm yıkayın. Yıkama tamponu ile 5 dakika yıkama ve ardından, 5 dakika boyunca 2.5 ng / ml Hoechst boya, 100 ul Leke bölümü. </li><li> üreticinin protokolüne göre bir tampon montaj bölümüne monte edin. Doku Bölüm başına 15 ul kullanın ve doku ile aşırı montaj çözümü silin silin. sızıntı önlemek için şeffaf tırnak cilası ile slayt mühür. </li><li> 10X objektif yani toplam büyütme kullanarak bölüm floresan mikroskop gözlemleyin 100X olduğunu. </li></ol>

<ol><li>Shah, N. R., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+pathogenesis+of+breast+cancer%3A+Implications+in+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment.</a> World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).</li>
<li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-185+suppresses+tumor+proliferation+by+directly+targeting+E2F6+and+DNMT1+and+indirectly+upregulating+BRCA1+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).</li>
<li>Ye, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+miR-375+induces+trastuzumab+resistance+in+HER2-positive+breast+cancer+by+targeting+IGF1R%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R.</a> BMC Cancer. 14, 134(2014).</li>
<li>Oneyama, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+downregulation+of+mTOR%2FFGFR3+controls+tumor+growth+induced+by+Src-related+oncogenic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways.</a> Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).</li>
<li>McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+breast+cancer%3A+the+potential+of+miRNA+for+diagnosis+and+treatment+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring.</a> Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).</li>
<li>Quesne, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+prognostic+associations+of+miR-205+and+let-7b+in+breast+cancer+revealed+by+in+situ+hybridization+analysis+of+micro-RNA+expression+in+arrays+of+archival+tumour+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue.</a> J Pathol. 227, 306-314 (2012).</li>
<li>Fernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-340+inhibits+tumor+cell+proliferation+and+induces+apoptosis+by+targeting+multiple+negative+regulators+of+p27+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer.</a> Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).</li>
<li>Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-224+upregulation+and+AKT+activation+synergistically+predict+poor+prognosis+in+patients+with+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-146+up-regulation+predicts+the+prognosis+of+non-small+cell+lung+cancer+by+miRNA+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization.</a> Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+in+situ+hybridization+for+formalin+fixed+kidney+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues.</a> J Vis Exp. , e50785(2013).</li>
<li>Ucar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-212+and+miR-132+are+required+for+epithelial+stromal+interactions+necessary+for+mouse+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development.</a> Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).</li>
<li>Nuovo, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+microRNAs+in+paraffin+embedded%2C+formalin+fixed+tissues+and+the+co-localization+of+their+putative+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets.</a> Methods. 52, 307-315 (2010).</li>
<li>Kierzek, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+locked+nucleic+acid+residues+on+the+thermodynamic+properties+of+2%27-O-methyl+RNA%2FRNA+heteroduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes.</a> Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+miR-182+and+miR-503+cooperatively+targets+FBXW7%2C+contributing+to+the+malignant+transformation+of+colon+adenoma+to+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma.</a> J Pathol. 234, 488-501 (2014).</li>
</ol>

Açıklanacak bir şey yok.

Bu çalışmanın amacı, in situ hibridizasyon miRNA kullanarak meme kanseri dokularında MiRNA ekspresyon seviyesini belirlemek için yapıldı. Deneyde, tüm koşullar meme kanseri dokusu için optimize olduğu not edilmelidir. Ayrıntılı optimizasyon diğer doku tipleri için gerekli olabilir. Bütün çözeltiler DEPC su ile yapılmalıdır ve kaplar DEPC işlenmiş, su ile durulandı ve daha sonra otoklavlanmalıdır kullanılır. Hatta hafif RNaz kirlenme deney nihai sonucu etkileyebilir. MiRNA çok kısa bir dizisi olduğu için, hedef ...

Meme kanseri dünya genelinde kadın nüfusu etkileyen en yaygın maligniteler arasında yer alıyor. Meme kanseri 1.3 milyon vaka dünya çapında 1,2 yılda bildirilmektedir. Tümör hücreleri, geleneksel biyolojik homojen ve yüksek proliferatif olarak kabul edilmiş olmasına rağmen, meme kanseri genetik ve klinik heterojen olduğunu belirgin hale gelmiştir. Yaygın antikanser ilaçlara direnç kanser ilerleme ve mesafe metastazı 3 onun kolaylaştırılması yoluyla hastaların çoğunluğunda mortaliteye neden ilerlemiş meme kanserlerinin bir özelliğidir. MikroRNA&#39;lar (miRNA&#39;ların) mRNA translasyonunu bloke veya mRNA bozulmasını 4 aracılık gen ekspresyonunu düzenleyen yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda küçük RNA molekülleri sınıfıdır. 2.000 &#39;den fazla farklı miRNA&#39;lar kadar insan hastalıkları 5 ile bağlantılı olan, insanları tespit edilmiştir. çalışmalar artan bir dizi havE miRNA&#39;lar onkojenlerin ve tümörleri giderici olarak işlev görebilir ve genellikle tümör 6 düzensiz olduğunu göstermiştir. miRNA&#39;lar kuvvetle tümör hücre hareketi, invazyon ve metastaz 7 olanlarla birlikte hücre döngüsü ilerlemesinin, yaşlanma, apoptoz ve otofaji önemli regülatörleri kontrol ederek birincil tümörogenez tüm etkileyebilir. Aberrant miRNA ifade aynı zamanda sahne, farklılaşma, prognozu ve adjuvan tedavi 8 yanıt olarak klinik etkileri ile ilişkili olmuştur. Özellikle, miR-146 ifadesi akciğer kanserli hastalarda 9 kötü prognoz ile ilişkilidir arttı. Başka bir çalışmada, miRNA let7b kayıp sentezleme Sonuç olarak, zayıf yaşama 6, habis fenotipler ile bağlantılı ve göstermiştir. miRNA&#39;lar ifade eden hücrelerin ve yapı türlerini anlamak olduğunu mekaniğini anlamak önemli bir parçası geçtiği miRNA ifade etkisi hücrede değişiklikler veDoku 10 fenotip. stromal hücrelerde salgılandığı bulunmuştur belirli miRNA&#39;ların epitel hücreleri tarafından alınır ve özel olarak hedef doğrultusunda hareket edilir. Aynı şekilde, miR-212 ve miR-132 meme bezi gelişimi sırasında 11 duktal büyümesi için gerekli epitel-stromal etkileşimleri stroma tarafından salgılanan ve regüle edilir. Bu çalışmanın genel amacı in situ hibridizasyon miRNA ile meme kanseri dokularında miRNA ifade algılamak için ayrıntılı bir protokol açıklamaktır. Biz meme kanseri hasta örneklerinde miRNA 489 ifadesinin seviyelerini analiz etmek için tüm şartları optimize ettik. Bu amaçla, işaretlenmiş DIG eden deneyde nükleik asit (LNA) prob kilitli kullanılır. Bunu nükleotid bazı, yani, bir LNA modifikasyonu sahip 2 &#39;, oksijen atomu ve 4&#39; de hibridizasyon sonrası &quot;yerine kilitli&quot; kalacak şekilde nükleotidi giderir riboz omurga karbon atomu bağlayan bir metilen köprüsü. Bunun bir sonucu olarak, çok daha zorhibridize kompleksi 12,13 denatüre etmek için.

<table><tbody><tr><td>ELF-97</td><td>Yaşam Teknolojisi&nbsp;</td><td>E6604</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhard't&nbsp;</td><td>Yaşam teknolojisi&nbsp;</td><td></td><td></td>750018</tr><tr><td>t-RNA</td><td>Roche</td><td>109541</td><td>DEPC suyunda Sulandırılır</td></tr><tr><td>Ringa Balığı Sperm DNA'sı</td><td>Promega&nbsp;</td><td>D1815</td><td></td></tr><tr><td>Roche Engelleme&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>RVC</td><td>Fisher</td><td>50-812-650</td><td>Kullanmadan önce 16.1 RCF'de döndürün ve süpernatan alın.</td></tr><tr><td>miR-489 probu&nbsp;</td><td>Exiqon</td><td>38599-01</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen BSA</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>711454</tr><tr><td>Primer antikor-anti DIG</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11093274910</tr><tr><td>Dietil Pirokarbonat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>1609478</td><td></td></tr></tbody></table>

mirna kullanarak meme kanseri dokularındaki mirna İfade klinikopatolojik analizi<em&gt; in situ</em&gt; melezleme

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Bu makalede, digoksigenin etiketli bir LNA (Kilitli Nükleik Asit) probu ile in situ hibridizasyon kullanılarak meme kanseri dokusunda miRNA tespiti için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Prob, anti-DIG alkalin fosfataz antikorları tarafından tanındı ve daha sonra floresan sinyalleri üreten alkalin fosfataz substratı kullanılarak geliştirildi. Burada, meme kanseri hastalarından alınan dokularda miR-489 ekspresyonunu analiz etmek için miRNA in situ hibridizasyon (MISH) tekniğini kullandık. Bu teknik, bireysel doku örneklerinde ilgilenilen miRNA'nın lokalizasyonunu tespit edebilir. Bu teknik, tümör dokusunda istenen miRNA'nın ekspresyonunu bitişik normal dokudaki ekspresyonla karşılaştırmak ve bu miRNA'yı eksprese etmekten sorumlu spesifik yapıları tanımlamak için kullanılabilir. Bu teknik, kanser gelişiminde spesifik miRNA'nın rolü gibi bazı klinik soruları yanıtlamada çok yararlı olabilir. Sonuçlarımız, meme epitel hücrelerinin, bitişik tümör hücrelerinden önemli ölçüde daha yüksek miR-489 seviyeleri eksprese ettiğini göstermektedir.

İnsan göğüs kanseri dokusu miRNA 489 ekspresyonunu belirlemek için kullanılmıştır. Meme bezi kanalı ve epitel hücreler bitişik iki hastada tümör dokusunda (Şekil 1A ve 1B) önemli ölçüde daha yüksek MiRNA-489 seviyelerini ifade bulunmuştur. Bu açıkça miRNA 489 ifadesi miRNA 489 tümör baskılayıcı aktivite düşündüren, tümör dokusunda kayıp olduğunu göstermektedir. daha da aynı hastadan alınan, bu sonuçlar, tümör dokusu ve bitişik normal doku doğrulamak için...

Burada, miRNA in situ hibridizasyon kullanarak meme kanseri hasta örneklerinde miRNA ekspresyonunu tespit etmek için bir protokol sunuyoruz.

miRNA kullanarak Meme Kanseri Dokularındaki miRNA İfade Klinikopatolojik Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

Bu Mikro RNA In Situ Hibridizasyonunun genel amacı, ilgilenilen Mikro RNA'nın meme kanseri dokusundaki lokalizasyonunu tespit etmektir. Böylece elde edilen bulgular, meme kanseri alanındaki temel soruları yanıtlayabilir; örneğin, ilgilenilen mikro RNA'nın belirsiz bir rolü mü olduğu yoksa bir tümör baskılayıcı mı olduğu gibi.Bu tekniğin temel avantajı, meme kanseri dokusundaki ilgili hücresel nükleizasyonu tespit edebilmesidir. Önceden hazırlanmış meme dokusu kesitlerinden parafini uzaklaştırarak doku hazırlığına başlayın. Lamları, taze Ksilen içeren bir Coplin kavanozuna onar dakikadan iki kez daldırın.Doku kesitini, çift distile su içerisinde azalan etanol konsantrasyonlarında beşer dakikalık inkübasyonlarla yeniden hidrate edin. Ardından, dokuyu beş dakika boyunca dietilpirokarbonat veya DEPC ile işlem görmüş suda bekletin. Doku suyun içindeyken, doku kesitinin etrafını hidrofobik bir bariyer kalemle çevreleyin.DEPC daldırmadan sonra, dokuyu 15 dakika boyunca %4 PFA ile fikse edin. Fiksasyon işlemini PBSyla yıkama ile takip edin. Ardından, dokuyu on dakika boyunca PBS içindeki %0,3 Triton X-100'e daldırın.Numuneyi, 37 °C'de 15 dakika boyunca mikrolitre başına 50 µg Proteinaz K çözeltisi ile inkübe edin. Ardından doku kesitlerini, oda sıcaklığında beş dakika boyunca trietanolamin ve asetik anhidrit ile inkübe edin. İşlemi bir PBS yıkaması ile takip edin.Dokuyu iyice yıkayın. Ardından, doku kesitini 120 µL hibridizasyon tamponu ile oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, 5' DIG işaretli NLA probunu 120 µL hibridizasyon solüsyonu içerisinde 3 pM nihai konsantrasyona seyreltin.Ardından, 120 µL hibridizasyon tamponuna 40 ng/µL stok çözeltiden üç µL ekleyin. Ve karışımı 95 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Doku kesitini 10x8 inçlik bir kaba yerleştirin ve dokunun tamamen kaplanması için üzerine 120 µL prob ekleyin.Nem odası oluşturmak için iki kağıt havluyu ıslatın ve kabın üzerini kapatın. Doku kesitini 54 °C'de gece boyunca inkübe edin. Hibritizasyon sonrası dokuyu, 57 °C'de yedi dakika boyunca beş X salin sodyum sitrat tamponu veya SSC ile yıkayın.Ardından, doku kesitini iki kez 1X SSC ile yıkayın. Doku kesitini 0.2X SSC ile yıkayın. Daha sonra, doku kesitini oda sıcaklığında yedi dakika boyunca 0.2X SSC ile yıkayın.Doku kesitini on dakika boyunca PBS içerisinde inkübe edin. Doku kesitini, nemli bir oda içerisinde oda sıcaklığında bir saat boyunca bloklama tamponu ile inkübe edin. Anti DIG AP antikorunu bloklama tamponu ile 1/300 oranında seyreltin.Ve doku kesitini antikor ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kesitleri yıkama tamponu ile beşer dakikadan üç kez yıkayın. Boyut üç floresan ışık üreten alkali fosfataz ile doku kesitini geliştirmek için ELF 97 ticari kit talimatlarını izleyin.Ardından, kesiti beş dakika boyunca yıkama tamponu ile yıkayın. Kesiti 5 dakika boyunca 100 µL 2,5 ng/µL Hoeshct boyası ile boyayın. Boyama işleminin ardından kesiti yıkama tamponu ile beş dakika yıkayın.Doku kesiti başına 15 µL montaj tamponu kullanın. Fazla montaj solüsyonunu bir doku mendiliyle silin. Ardından, sızıntıyı önlemek için lamı şeffaf oje ile mühürleyin.Son olarak, kesiti 100 X toplam büyütmede floresan mikroskobu ile inceleyin. Micro RNA 489 ekspresyonunu belirlemek için iki hastadan alınan insan meme kanseri dokusu kullanılmıştır. Meme bezi kanalı ve epitelyal hücrelerin, komşu tümör dokusuna göre anlamlı derecede daha yüksek Micro RNA 489 seviyeleri eksprese ettiği bulunmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, meme kanseri hastası örnekleri kullanarak Micro RNA In Situ hibridizasyonunun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

clinicopathological-analysis-mirna-expression-breast-cancer-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu makalede, formalin içerisinde tespit edilmiş böbrek bölümlerinde microRNA ifade Renkölçer tespiti için optimize edilmiş bir in situ hibridizasyon protokolü tarif eder.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Formalin Sabit Böbrek Dokular Hibridizasyon

Östrojen ve mikroRNA'lar hem aracılığıyla sinyal Moleküler meme kanseri gelişiminde ve büyümesinde önemli olan. Östrojen transkripsiyon faktörleri olan östrojen reseptörleri aktive eder. Pek çok transkripsiyon faktörleri microRNA ekspresyonunu düzenleyen ve estrojen ile düzenlenen microRNA farklı büyük ölçekli teknikler kullanılarak profilli olabilir.

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Burada, kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-PCR) ve yerinde hibridizasyon (ISH) kullanan arşivlenmiş Formalin-Sabit, Parafine Gömülü (FFPE) veya taze dondurulmuş prostat kanseri (PCa) klinik dokularında mikroRNA (miRNA) ekspresyon analizleri için basitleştirilmiş bir protokolü açıklıyoruz.

Prostat Kanseri Klinik Dokularındaki miRNA İfade Analizleri

Nükleik asit bozulması arşivleme doku, tümör heterojenite ve taze donmuş doku örnekleri eksikliği kanser tanı Hizmetleri dünya çapında patoloji laboratuarlarında olumsuz etkileyebilir. Bu el yazması meme kanserlerinin sınıflandırmak için bir multiplex manyetik boncuk tahlil kullanarak biyolojik bir panel optimizasyonu açıklar.

Meme kanseri arşivleme malzeme kullanarak bir Multiplex RNA temel ifade tahlil duruma getirilmesi

Parafin katıştırılmış örneklerden formalin sabit insan hastalıkların moleküler biyolojik değerli bir kaynağı temsil eder. Burada başlangıçta taze donmuş RNA ile tasarlanmış ve dokulara gelen arşivlenmiş mikroRNA'lar analizini 35 yaşına kadar saklı için en iyi duruma getirilmiş bir laboratuar tabanlı cDNA Kütüphanesi hazırlık protokolü, mevcut.

Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü

Mikro-RNA'ların (miRNAs) haberci RNA (mRNA) çoğu düzenleyiciler hizmet veren kısa ve son derece homolog RNA dizileri vardır. Geçerli miRNA algılama yöntemleri duyarlılık ve özgüllük değişir. Situ hibridizasyon ve immunostaining eşzamanlı miRNA ve protein molekülleri fare kalp doku bölümlerinde algılanması için bir araya getiren bir protokolü açıklar.

Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma In Situ hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde

Biz mikroRNA (miRNAs) dolaşan ifade düzeylerini değerlendirmek için bir protokol kanserli hastalarda plazma örnekleri mevcut. Özellikle, biz piyasada bir kit miRNA çıkarma ve ters transkripsiyon dolaşan için kullanılır. Son olarak, gerçek zamanlı önceden benekli sonda özel plakaları kullanarak 24 seçili miRNAs oluşan bir panel analiz ettik.

Metastatik kolorektal kanser hastalarında dolaşımdaki mikroRNA özel Panel tespiti

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Ortodontik aletler doğal oral biyofilm yapısal ve kompozisyon analizi için bir protokol...

Floresan In-Situ Hibridizasyon ve Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi Palatal Genişleticilerden Oral Biyofilm Analizi

Kemik metastazının patogenezine, anjiyojenez önemli bir proses ve bu nedenle görüntüleme ve tedavi için bir hedef temsil eder. Burada siteye özel meme kanseri kemik metastazı bir sıçan modeli sunmak ve non-invaziv görüntü anjiyogenez için stratejiler...

Manyetik Rezonans Görüntüleme, Volumetrik Bilgisayarlı Tomografi ve Ultrason Kullanımı Meme Kanseri Kemik metastazı bir Nude Rat Model Angiogenezis Multi-modal Görüntüleme

Öğrenin meme kanserinde miRNA in situ hibridizasyonu ile mikro RNA lokalizasyonunu tespit etmeyi. Bu yöntem, tümör baskılayıcı rolleri anlamak için klinikopatolojik analiz sağlar.

miRNA kullanarak Meme Kanseri Dokularındaki miRNA İfade Klinikopatolojik Analizi

Daha fazla video keşfet