BANT: Cerrahi Uygulama için Bitkilerde bir Ubiquitous Bileşik esinlenerek bir Biyobozunur Hemostatik Tutkal

Bu protokolün genel amacı, bitkilerde yaygın olarak bulunan bir bileşikten esinlenerek, cerrahi uygulama için biyobozunur bir hemostatik yapıştırıcı geliştirmektir. Bu yöntem, biyomedikal uygulamalardaki doku yapıştırıcıları ve sızdırmazlık ajanları gibi biyometriklerin suya dayanıklı yapışma mekanizmasını anlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, TAPE üretim sürecinin son derece basit, ölçeklenebilir ve çevre dostu olmasıdır.

İlk olarak, manyetik karıştırıcı üzerinde dört mililitrelik cam bir flakon içerisinde Tannik Asit çözeltisi hazırlayın. 200 rpm karıştırma hızıyla bir mililitre distile su ve bir gram Tannik Asit ekleyin. Bir saat sonra, Tannik Asit kahverengi bir çözelti içerisinde tamamen çözünecektir.

Ardından, bir gram PEG tozuna bir mililitre distile su ekleyin ve beyaz bir bulamaç oluşana kadar vorteksleyin. Bulamacı 10 dakika boyunca 60 °C'de tutun. Tamamen berrak hale gelmelidir.

Ardından, oda sıcaklığına geri döndürün. Sonra, bir mikrosantrifüj tüpünde 329 µL PEG çözeltisini 671 µL Tannik Asit çözeltisi ile karıştırın. Her iki çözelti de oldukça vizkoz olduğu için alikotu yavaşça alın.

Çözeltileri dar bir spatula ile bal kıvamında bir karışım olana kadar nazikçe karıştırın. Karışımı, sabit açılı bir rotorda 12,300 g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, tamamen oluşmuş TAPE'yi yerinde bırakarak süpernatanın mümkün olduğunca fazlasını dikkatlice pipetle alın.

TAPE'yi birkaç hafta boyunca dört ila sekiz derece santigrat sıcaklıkta saklayın. TAPE'nin yapışma gücünü ölçmek için, porcine biyopsi deri punch'ından bir test dokusu hazırlayın. Tüm yağları temizleyin ve ardından iki adet altı milimetre çapında test dokusu hazırlayın.

Her bir dokunun dış tarafına ticari siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın ve test cihazı tarafından kavranacak olan çubukları veya benzeri bir nesneyi sabitleyin. Ardından, dokunun bir tarafına bir damla TAPE uygulayın ve iki dokunun iç yüzeyleri arasında, birbirlerine yapışacak şekilde eşit olarak yayın. Daha sonra, arayüzü tamamen kaplayan homojen bir karışım oluşturmak için dokuları birkaç kez birbirine yapıştırıp ayırın.

Ardından, çubukları test düzeneğine sabitleyin. Bir dakika boyunca 20 Newton kuvvet uygulayarak başlayın. Sonrasında, dokular tamamen ayrılana kadar çubukların dakikada bir milimetre hızla birbirinden uzaklaşmasını sağlayın.

Veriler bir kuvvet-mesafe eğrisi olarak verilmiştir. Suyun varlığında yapışma gücünü test etmek için, iki doku arasındaki ayrılmış bölgeye 20 µL su ekleyin ve ıslak yüzeyleri TAPE ile hemen birleştirin. Testi, başka herhangi bir değişiklik yapmadan daha önce olduğu gibi tekrarlayın.

Öncelikle, bir mikrocentrifuge tüpünün sekiz milimetre çapındaki kapağını kesin ve tartın. Ardından, kapağı 150 mg TAPE ile doldurun ve toplam ağırlığı ölçün. Kapağı, bariyer olarak kullanılacak olan kenar kısmının üzerine çıkacak şekilde doldurmayın.

75 santimetrekarelik hücre kültürü flaskına 50 mililitre PBS tamponu ekleyin. Yüklü kapağı flaskın içine yerleştirin ve kapağı batırın. Flaskı, 50 rpm'den daha yüksek olmayacak şekilde ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıda 37 derece Celsius'ta inkübe edin.

İstenen zamanda, kapağı çıkarın ve nitrojen gazı ile kurutun. Ardından, kapağı tartın. Sonrasında, flask içindeki PBS'yi yenileyin ve bir sonraki zaman noktasına kadar hafifçe çalkalayarak inkübasyona devam edin.

Ölçümlerden yola çıkarak, kalan göreceli ağırlığı hesaplayın. Pençe sıkma testiyle kontrol edilmiş, tamamen anestezi altındaki altı haftalık erkek bir fare ile başlayın. Cerrahi işleme başlamadan önce gözlere veteriner merhemi uyguladığınızdan emin olun.

Şimdi, orta hat abdominal insizyonu ile karaciğeri açığa çıkarın ve karaciğeri sabitlemek için altına kütlesi bilinen filtre kağıdı yerleştirin. Ardından, kanamayı başlatmak için karaciğere 18 gauge'lik bir iğne ile batırın. Kanı steril gazlı bezle emerken, insizyon bölgesine hemen 100 µL TAPE uygulayın.

Pozitif kontroller için siyanoakrilat veya benzeri bir yapıştırıcı kullanın ve negatif kontroller için hiçbir işlem yapmayın. Daha fazla sütürleme gerekmemektedir. Yapıştırıcıyı uyguladıktan sonra, hasarlı bölgeden kan örneğini kağıda toplayın.

Kağıdı iki dakika boyunca her 30 saniyede bir değiştirin. Dört filtre kağıdındaki emilen kanın kütlesini ölçün. Hayvan ötanize edilmelidir.

TA ve PEG'in çeşitli oranları test edilmiş ve TAPE üretimi için ideal kombinasyonun ikiye bir hacim oranı olduğu belirlenmiştir. Bu TAPE, altı milimetre çapındaki iki domuz derisi arasına uygulanmış ve ardından açıklandığı şekilde bir çekme cihazında test edilmiştir. İki domuz derisini ayırmak için gereken kuvvet başlangıçta 200 kilopascal olarak ölçülmüş ve tekrarlanan döngülerle 250 kilopascale yükselmiştir.

Her bir yapışma/ayrılma döngüsünden sonra cilt örnekleri nemlendirildiğinde, bağın çekme dayanımı başlangıçta 90 kilopascals değerine düşmüş ve 20 döngü sonrasında 50 kilopascals değerine gerilemiştir. TAPE'nin dayanıklılığı, fizyolojik ışık koşulları altında çalkalamalı olarak PBS içinde dilüe edilmiş küçük hacimlerde test edilmiştir. İkiye bir oranındaki formülasyon kullanılarak kütle 21 gün boyunca korunmuştur.

Bire bir oranındaki TAPE formülasyonu, bu koşullar altında yalnızca 13 gün dayanmıştır. Ardından, in vivo olarak bir hemostatik test gerçekleştirilmiştir. TAPE ile sızdırmazlığı sağlanan karaciğer, ticari fibrin yapıştırıcısı ile karşılaştırılmıştır.

TAPE ile mühürlenmiş karaciğer, fibrin yapıştırıcısı ile mühürlenmiş karaciğere göre önemli ölçüde daha az kanamıştır. Uzmanlaşıldığında, TAPE hazırlığı uygun şekilde gerçekleştirildiği takdirde beş dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, Tannik Asit ve PEG arasındaki optimize edilmiş oranı korumayı hatırlamak önemlidir çünkü bu oran TAPE'nin yapışma kuvvetini ciddi şekilde etkileyebilir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, biyometri alanındaki araştırmacıların, suya dayanıklı yapıştırıcı malzemeler geliştirme konusundaki güncel sorunları çözmek için doğadan esinlenen yöntemleri keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu yöntem hemostatik malzemeler hakkında bilgi sağlayabilmesinin yanı sıra, yara iyileştirmesi için doku sızdırmazlayıcılar ve ilaç teslimatı için implante edilebilir yamalar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.