Name: Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Öğrenin, fare sırt derisinden saç folikülü kök hücreleri ve epidermal keratinositleri izole etme yöntemini. Enzimatik sindirim ve FACS analizi kullanılarak hızlı ve güvenilir sonuçlar elde edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma kısmen NIH hibe RO1GM60124 (HS'ye) tarafından desteklenmiştir. HS, Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nde Araştırmacıdır. Y.F., Deloro Kariyer Geliştirme Başkanı ve Alman İsrail Vakfı (I-2381-412.13/2015) tarafından desteklenmektedir. DS, Coleman-Cohen doktora sonrası bursu tarafından desteklenmektedir.

Bu çalışma Sağlık İsrail&#39;in Bakanlığı Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu belirtilen tavsiyelere sıkı göre yapıldı. tüm hayvanların onaylı kurumsal hayvan bakım protokolü Teknoloji Technion İsrail Enstitüsü, IL-02302-2015 göre ele alınmıştır. 1. Deneysel hazırlanması <ol><li> şelatlı Fetal Sığır Serumu hazırlanması Not: kalsiyum, bu hücrelerin maruziyetini kontrol etmek çok önemlidir, böylece epitel hücreleri kalsiyum karşı çok hassastır. Hücreler izolasyon işlemi şelasyon sırasında kalsiyum maruz kalmamasını sağlamak için Fetal Sığır Serumu lekeleme tampon maddesi 29 hazırlanması için kullanılan herhangi bir artık kalsiyumun giderilmesi için kullanılır. Aşağıdaki protokol hazırlanması FACS tampon boyama için gerekli olan kalsiyum içermeyen Fetal Sığır Serumu, yaklaşık 1 L hazırlar. <ol><li> Kuru kenetleme malzemesi, örneğin 400 g ekle., Chelex, H2O 4 L&#39;lik bir beher içine ve damıtılmış Ekle toplam hacme 4 L kapak ve sürekli olarak bir manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırın. </li><li> karıştırılırken, 10 N HCI çözeltisi kullanılarak pH 7.4 ayarlayın. 20 dakika boyunca karıştırmaya devam edin ve pH fazla 20 dakika süreyle kararlı kalana kadar gerektiğinde pH yeniden ayarlayın. </li><li> kenetleme malzemesi kompakt pelet oluşturmak için izin vermek için 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca beher kuluçkaya yatmaktadır. Dikkatlice aspire H2O ve ilave 2 O 4 L&#39;lik bir toplam hacme taze damıtılmış H </li><li> Adım 1.1.2 olarak pH ayarlamasını tekrarlayın. </li><li> kenetleme maddesi kompakt pelet oluşturulması için izin vermek için 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de beher yerleştirin. Dikkatlice aspire H 2 O </li><li> Yavaş yavaş kenetleme malzemeye fetal sığır serumu, 500 mL&#39;lik iki şişe ekleyin. Hız ayar kabarcığı meydana etmemesini sağlamak 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de yavaş yavaş ilave edin. </li><li> kenetleme malzeme kompozisyonu oluşturmak için izin vermek için 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de behere koyunPelet hareket ederler. </li><li> Dikkatle 1 L cam şişeye serum transferi ve steril koşullar altında, bir şişe ağzı filtre içinden filtre. -20 ° C&#39;de şelatlı serum Mağaza veya hemen kullanın. </li></ol></li><li> Lekeleme tampon maddesi hazırlanması <ol><li> 2+ Ca 2 + ve Mg olmadan PBS içinde FBS şelatlı% 3 100 ml hazırlayın ve buz üzerinde tutmak. </li></ol></li></ol> Yetişkin Epidermis saç köklerinin 2. izolasyonu <ol><li> bir indüksiyon kutusunu kullanarak% 5 izofluran kullanarak fareler anestezi. Burada açıklanan protokol HF döngüsünün telojen aşamasında olan 50-80 günlük fare kullanılarak optimize edilmiştir. </li><li> standart laboratuar prosedürlerine göre fareler Euthanize. Burada, bir ötenazi odasında CO 2 doz aşımı kullanarak fareleri euthanize. </li><li> Elektrik kesme makineleri kullanılarak sırt derisine tüm saç tıraş. baş ve bacaklarda kaçının. cilde mümkün olduğunca yakın makası tutun. deri ve deri altı tabaka zarar vermemek. </li&gt; <li> Tüm saç kaldırıldığında, herhangi bir saç kalıntılarını temizlemek için ve dorsal cilt dezenfekte% 70 etanol kullanın. </li><li> diseksiyon pad üzerinde fare yerleştirin ve kullanan forseps kuyruk yakın cilt yukarı çekin ve makas kullanarak küçük bir nick yapmak. dikkatle cildi kesip atmak ve fasya ayrılarak posterior-anterior yönde tüm dorsal cilt kesin. derialtı tabakası zarar görmesini önlemek. </li><li> Saç yüzü aşağı bakacak şekilde bir diseksiyon mat cilt yerleştirin ve yerine sabitlemek için cildin iki komşu kenarları aşağı pin. Yavaşça dermiş net ve düzgün olana kadar künt neşter kullanılarak, yağ kazıyın. Not: yağ kapalı kazıma zaman cilt üzerinde hafif bir basınç uygulamak için kavisli bir forseps kullanın. forseps kavisli tarafı kullanarak cilt üzerinde basınç uygulayın. Bu yırtılma cildin önleyecektir. </li><li> , Dermis 100 mm steril kültür çanak aşağı yan cildi yerleştirin ve hiçbir kıvrımları olmadığından emin olmak için cilt düzelir. Ca olmadan PBS 10 ml ekleyin 2+ </kültür çanak ve gerekirse cilt düzeltmek - sup&gt; ve Mg 2+ (PBS). </li><li> PBS aspire ve% 0.25 tripsin 10 ml. cilt katlanmamış ve serbestçe yüzen olduğundan emin olun. % 0.25 tripsin, 10 ml başına cilt tek parça inkübe edin. </li><li> 30-120 dakika için ya da gece boyunca 4 ° C &#39;de 37 ° C&#39; de inkübe edin. </li></ol> Saç köklerinin gelen Tek Hücre Süspansiyon 3. hazırlanması <ol><li> posterior yönde bir anterior kavisli bir forseps ve bir neşter kullanılarak cilt kapalı tüm saç, kazıyın. forseps kavisli tarafı kullanılarak yerinde cilt tutun ve saç kazımak için neşter kullanabilirsiniz. Not: Adım 2.8 eklenen tripsin çözeltisi içine saç kazıyın. kuyruk başlayın ve saç büyüme yönünü takip edin. tüylerin çıkış yönünün tersine Kazıma hücre verimi önemli HFS kaybı ve azalmaya neden olacaktır. HFS birlikte her bir bağlı ve küçük topaklar oluşturmayacağı; th azaltmak içinHF kümeleri e büyüklüğü bir seferde küçük bir alanda kazımak için deneyin. </li><li> Yeni kültür çanak saçsız deriyi aktarın ve eklemek PBS 10 ml - kurumasını önlemek için. Cildi kontrol edin ve kalan saç kazımak. </li><li> Tek bir HF süspansiyon elde edilinceye kadar bir neşter ve forseps kullanarak HFS yıkmak. Şiddetle tüm saç kümeleri kırmak için bir kaç dakika için 10 ml pipet kullanarak HF süspansiyon çiğnemek. Not: Buz üzerinde aşağıdaki adımların tümünü gerçekleştirin. </li><li> Önceden etiketli 50 ml tüp HF süspansiyon aktarın. </li><li> ; Deriden ve HF süspansiyon içeren hücre kültürü çanak durulama için kullanabilirsiniz - PBS aspire 50 ml&#39;lik bir tüpe transfer. </li><li> yıkama <ol><li> 50 ml&#39;lik bir tüp üzerine monte 70 mikron hücre süzgecinden geçerek süspansiyon Filtre. (-% 3 şelatlı FBS içeren PBS) ilk 50 mi boru ve lekeleme tampon maddesi 10 ml süzgeç yıkayın. </li><li> geçirerek süspansiyon filtre40 mikron hücre süzgecinden 50 ml&#39;lik bir tüp üzerine yerleştirilir. Tüm hücreler, yeni bir tüpe aktarılmıştır sağlamak için lekeleme tampon maddesi 5-10 ml tüp yıkayın. tüm hayvanlar işlendikten kadar buz üzerinde süspansiyon tutun. </li><li> 4 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj. boyama tampon 5 ml pelet ve tekrar süspansiyon pelet bozmadan özenle aspire süpernatant. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice aspire ve boyama tamponu 800 ul hücre pelletini. Not: Yukarıda belirtilen miktarlar erişkin farelerden elde edilen hücrelerin boyanması için yeterlidir. </li></ol></li><li> Önceden etiketli FACS Tüpler içine aktarın Süspansiyon. <ol><li> kontrol borular için, hücre süspansiyonunun (veya hücre süspansiyonundan kalan sol) 25-50 ul alır ve lekeleme tampon maddesi ile 300 ul toplam hacim tamamlanır. Not: Kontrol tüpleri (toplam hacim 300 ul) boyanmamış için hazırlayın (hiç antikorve hiçbir DAPI); DAPI sadece; ß1 integrin; α6 integrin; Sca-1; CD34. </li></ol></li><li> Uygun tüpe istenilen konsantrasyonlarda primer antikor ve DAPI (uygun dilüsyonları için malzemeler tabloya bakınız) eklenir. Yavaşça hücre süspansiyonu karıştırmak için tüpler hafifçe vurun. buz üzerinde dönmek ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplayın. </li><li> Hücreler süspansiyonda kalmasını sağlamak için tüpler her 10 dakikada bir fiske yavaşça buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin ve. </li><li> lekeleme tampon maddesi (tüp başına yaklaşık 4 mi) ile her bir FACS tüpü doldurarak hücreleri yıkanır; 4 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Süpernatantı dikkatlice aspire ve boyama tamponu 800 ul hücre pelletini. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücre süzgecinden kapaklarla FACS tüp içine hücre süspansiyonu aktarın. </li></ol> 4. Akım Sitometri Analizi <ol><li> signa için uygun filtreler ile debi sitometresinde hemen sıralama hücre geçinl algılama. (DAPI ölçümleri için) 405 nm menekşe, (APC uyarılması için) ve 633 nm kırmızı lazerler (FSC, SSC, PE, PE-Cy7 ve FITC ölçümler için) 488 nm mavi kullanın Not: Cihaz her üç floresan kanallar için dedektörleri kayıt olduğundan emin olun. </li><li> Tek lekeli kontrollerini kullanarak spektral örtüşme için lekesiz örnekleri ve tazminat dayalı ayarlayın floresan kapıları. Not: floresan sinyalleri herhangi bir örtüşme ortadan kaldırmak için kanallar arasındaki tazminat ayarlamak için tek lekeli kontrolleri kullanın. Tazminat ayarı kullanılan FACS sıralayıcı bağlıdır. </li><li> DAPI dayalı kurmak birincil kapıları ölü hücreleri hariç. </li><li> tekli olayları seçmek için scatter plot (FSC-A vs SSC-A) ayarlayın. </li><li> çiftler için ortadan kaldırmak ve tekli olayları ayırımcılık FSC ve SSC yükseklik ve genişlik parametrelerini ayarlamak. </li><li> CD ile ya kapı hücreleri yüksek α6 ve β1 ekspresyonu ile ve bu nüfus kapı hücreleri34 yüksek ifadesi veya Sca1 yüksek ifadesi. </li><li> önceden etiketlenmiş FACS tüpü içinde kriteri hücreleri. Not: izole edilebilir hücrelerinin iki genel nüfus; α6 + / β1 + / CD34 + / Sca-1 - ve α6 + / β1 + / Sca-1 + / CD34 -. bu tür hücre kültürü veya RNA izolasyonu gibi akış aşağı kullanılan uygulamalara kadar kriteri hücreler her zaman buz üzerinde tutulmalıdır </li></ol>

<ol><li>Wagers, A. J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasticity of adult stem cells.</a> Cell. 116, 639-648 (2004).</li>
<li>Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal%2C+multipotency%2C+and+the+existence+of+two+cell+populations+within+an+epithelial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche.</a> Cell. 118, 635-648 (2004).</li>
<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratching+the+surface+of+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445, 834-842 (2007).</li>
<li>Hsu, Y. C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+business%3A+stem+cell+progeny+join+the+niche+to+regulate+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 103-114 (2012).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+homeostasis%3A+a+balancing+act+of+stem+cells+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 207-217 (2009).</li>
<li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hair+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The hair cycle.</a> J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).</li>
<li>Muller-Rover, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+guide+for+the+accurate+classification+of+murine+hair+follicles+in+distinct+hair+cycle+stages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages.</a> J Invest Dermatol. 117, 3-15 (2001).</li>
<li>Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+self-renewal+and+differentiation+phases+in+the+niche+of+infrequently+dividing+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 267-278 (2009).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+hair+follicle+bulge+contribute+to+wound+repair+but+not+to+homeostasis+of+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis.</a> Nat Med. 11, 1351-1354 (2005).</li>
<li>Hsu, Y. C., Pasolli, H. A., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+between+stem+cells%2C+niche%2C+and+progeny+in+the+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics between stem cells, niche, and progeny in the hair follicle.</a> Cell. 144, 92-105 (2011).</li>
<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tortoise+and+the+hair%3A+slow-cycling+cells+in+the+stem+cell+race%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The tortoise and the hair: slow-cycling cells in the stem cell race.</a> Cell. 137, 811-819 (2009).</li>
<li>Plikus, M. V., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+hair+cycle+domain+patterns+and+regenerative+hair+waves+in+living+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Complex hair cycle domain patterns and regenerative hair waves in living rodents.</a> J Invest Dermatol. 128, 1071-1080 (2008).</li>
<li>Ito, M., Kizawa, K., Hamada, K., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+follicle+stem+cells+in+the+lower+bulge+form+the+secondary+germ%2C+a+biochemically+distinct+but+functionally+equivalent+progenitor+cell+population%2C+at+the+termination+of+catagen%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Hair follicle stem cells in the lower bulge form the secondary germ, a biochemically distinct but functionally equivalent progenitor cell population, at the termination of catagen.</a> Differentiation. 72, 548-557 (2004).</li>
<li>Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-retaining+cells+reside+in+the+bulge+area+of+pilosebaceous+unit%3A+implications+for+follicular+stem+cells%2C+hair+cycle%2C+and+skin+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis.</a> Cell. 61, 1329-1337 (1990).</li>
<li>Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+cells%3A+a+folliculocentric+view%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem cells: a folliculocentric view.</a> J Invest Dermatol. 126, 1459-1468 (2006).</li>
<li>Trempus, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+for+living+murine+keratinocytes+from+the+hair+follicle+bulge+with+the+cell+surface+marker+CD34%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34.</a> J Invest Dermatol. 120, 501-511 (2003).</li>
<li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).</li>
<li>Lyle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C8%2F144B+monoclonal+antibody+recognizes+cytokeratin+15+and+defines+the+location+of+human+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells.</a> J Cell Sci. 111 (Pt 21), 3179-3188 (1998).</li>
<li>Liu, Y., Lyle, S., Yang, Z., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin+15+promoter+targets+putative+epithelial+stem+cells+in+the+hair+follicle+bulge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Keratin 15 promoter targets putative epithelial stem cells in the hair follicle bulge.</a> J Invest Dermatol. 121, 963-968 (2003).</li>
<li>Vidal, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9+is+essential+for+outer+root+sheath+differentiation+and+the+formation+of+the+hair+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Sox9 is essential for outer root sheath differentiation and the formation of the hair stem cell compartment.</a> Curr Biol. 15, 1340-1351 (2005).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr6+marks+stem+cells+in+the+hair+follicle+that+generate+all+cell+lineages+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin.</a> Science. 327, 1385-1389 (2010).</li>
<li>Nijhof, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-surface+marker+MTS24+identifies+a+novel+population+of+follicular+keratinocytes+with+characteristics+of+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The cell-surface marker MTS24 identifies a novel population of follicular keratinocytes with characteristics of progenitor cells.</a> Development. 133, 3027-3037 (2006).</li>
<li>Jensen, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+population+of+clonogenic+and+multipotent+murine+follicular+keratinocytes+residing+in+the+upper+isthmus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A distinct population of clonogenic and multipotent murine follicular keratinocytes residing in the upper isthmus.</a> J Cell Sci. 121, 609-617 (2008).</li>
<li>Jensen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lrig1+expression+defines+a+distinct+multipotent+stem+cell+population+in+mammalian+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lrig1 expression defines a distinct multipotent stem cell population in mammalian epidermis.</a> Cell Stem Cell. 4, 427-439 (2009).</li>
<li>Jaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+marks+cycling%2C+yet+long-lived%2C+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.</a> Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).</li>
<li>Horsley, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blimp1+defines+a+progenitor+population+that+governs+cellular+input+to+the+sebaceous+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Blimp1 defines a progenitor population that governs cellular input to the sebaceous gland.</a> Cell. 126, 597-609 (2006).</li>
<li>Goldstein, J., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Home+sweet+home%3A+skin+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Home sweet home: skin stem cell niches.</a> Cell Mol Life Sci. 69, 2573-2582 (2012).</li>
<li>Fuchs, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sept4%2FARTS+regulates+stem+cell+apoptosis+and+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sept4/ARTS regulates stem cell apoptosis and skin regeneration.</a> Science. 341, 286-289 (2013).</li>
<li>Nowak, J. A., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of epithelial stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek hiçbir şeyi yoktur

Burada açıklanan protokol de yetişkin farelerin dorsal deri HFSCs izole etmek için kurulan, ancak aynı belirteç 2,16,23,28,29 seçimine göre, HF yapısı içindeki bir başka popülasyonlarının izole edilmesi için uygulanabilir. Bu yöntem, örneğin, doku ayrışma hücre izolasyonu için diğer yöntemler, içinde özellikle avantajlıdır, bu belirli bir hücre tipi seçilebilir ve heterojen hücre popülasyonu, bir karışımından toplanır. Bundan başka, burada tarif edilen yöntem, hızlı ve güvenilir ve kullanılan belirteçler ayır...

Yetişkin kök hücreleri (SC&#39;ler) ölen hücrelerin yerine doku vücut dengesinin sürdürülmesinde ve yaralanma üzerine hasarlı dokuların onarımı için gereklidir. Bu SC&#39;ler sürekli kendini yenileme geçmesi ve çeşitli hücre soyları 1-3 ayırt etme yetenekleri ile tanımlanmıştır. Kendi ikmal için yetişkin SC&#39;ler bağlıdır iyi çalışılan sistemler, hematopoetik sistem, bağırsak ve cilt 1,2,4 bulunmaktadır. embriyojenez sırasında cilt epidermal hücrelerin tek bir tabaka olarak başlar. Mezenkimal hücreler cilt doldurmak ve altta yatan kollajen dermis 5 oluşturduklarında saç folikülü (HF) morfonogenezi başlar. Aşağıya doğru 6 büyümeye başlar saç placodes oluşturmak için daha sonra, dermal papilla (DP) oluşturan epidermal tabakasının altında doğrudan organize etmek ve epitel teşvik mezenkimal hücreler, uzman. Son derece HF alt kısmında yer alan matris hücreleri, çoğalan,iç katman saç şaft (HS) ve çevresindeki iç kök kılıfı (IRS) 2,3 oluşturmak için konsantrik silindir içine ayırt etmeye başlar ise, bu mezenkimal hücreler zarf ve saç ampul oluştururlar. interfolliküler epidermis (IFE), yağ bezi (SG) ve HF: doğum sonrası hayatta deri epidermis üç bölmeden oluşmaktadır. Homeostasis sürekli bir durumdadır IFE ve SG aksine, HF sürekli büyüme döngüleri (anagen), yıkım (katagen) ve geri kalanı (telojen) 4,7 uğrar dinamik bir mini organdır. Kıl folikülü kök hücreleri (HFSCs) yakıt bu daimi döngüsü, şişkinlik 4 olarak bilinen HF içinde özel bir niş bulunur. DP etkinleştirme sinyalleri HFSCs şişkinliği çıkış anajen takip sırasında proliferasyon başlar ve aşağı doğru ve böylece dış kök kılıf olarak bilinen hücrelerin uzun lineer iz oluşturma alçalma (ORS) 8-10. Matris hücreleri, yaniHF, hızla döngüsünün üssünde DP&#39;yi çevreleyen ve böylece HS ve IRS 10 (Şekil 1) üreten terminal farklılaşma geçiren yukarı göç. Anagen süresi saç uzunluğunu belirler ve matriks hücrelerinin 6 çoğalma ve farklılaşma kapasitesine bağlıdır. HF katagen girer zaman, ampul ateşkes transit yalıtım matris hücreler çoğalmaya apoptoz geçmesi ve HF 8,11 olmayan bisiklet parçası ulaşıncaya kadar yukarı DP çekerken tamamen gerileme. Bu geri çekme sırasında HF katagen karakteristik epitel iplikçik olarak bilinen geçici bir yapı oluşturur, ve çok sayıda apoptotik hücre içerir. Farelerde, katagen 3-4 arasındaki gün sürer ve son derece ilk saç döngüsünde eşitlenir. HF telojen ulaştığında tüm HFSCs pasif hale gelir. HF döngüsünün farklı aşamaları da m bağlı fare deri rengine değişiklikler ile karakterize edilirelanin üretimi. Katagen sırasında koyu gri anagen sırasında siyah deri değişiklikleri telojen 6,7,12,13 sırasında pembe. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53931/53931fig1.jpg" /> Şekil 1: Saç Folikül Döngüsü. HF kalıcı üst kısmının oluşan ve hızlı büyüme (anagen), yıkım (katagen) ve göreli bir sessizlik fazı veya geri kalanı (telojen) sürekli döngülerine maruz düşük sürekli yeniden yapılanma, bisiklet bölümü. Olan <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53931/53931fig1large.jpg" target="_blank">bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.</a> HF muhafaza SC&#39;ler başlangıçta sadece SG 14 altında HF daimi bölgesinde ikamet yavaş bisiklet etiket istinat hücreler (LRC) nüfusu ortaya öğütülmüş ümidin ile kovalamaca deneyleri, kullanılarak belirlendi. HFSC gelişmelerKarakterizasyon HF niş 15 belirli SC&#39;ler belirlemek ve izole etmek için kullanılabilir belirteçlerin az sayıda tespit edildi. Belki HFSCs zenginleştirilmesi için iyi markör CD34, aynı zamanda, insanlarda 16 bir hematopoietik SC markör olarak tanımlanan bir hücre yüzey markörüdür. Bu CD34 + nüfus içinde iki ayrı nüfus da izole α6 integrin ekspresyonu 2 dayalı olmuştur. Başka bir belirteç CD34 ekspresyonu ile birlikte lokalize ve K-15 promoteri hedefleme ve transgenik hayvanlarda 15,17-19 içinde HFSCs izole edilmesi için kullanılan, keratin yüksek şişiklik bölgesinde ifade edilir 15 (K15) &#39;dir. Geçtiğimiz on yıl içinde HFSCs ve projenitör hücrelerin birçok farklı popülasyonlar da HF 17,20-27 içinde yer bildirilmiştir. HFSCs ek heyecan verici özelliği cilt onarım katkıları olduğunu. Normal şartlar altında HFSCs HF doldurmak ve IFE homeostazındaki yer almazlar. However yaralama yanıt olarak, bu hücreler IFE 9 repopulating kendi SC niş ve yardım çıkar. Son zamanlarda fareler pro-apoptotik Sept4 / sanat geni gösterim için apoptoza bir direnç gösterir CD34, 15 K ve SOX9 + HFSCs, artmış sayıda silinmiş göstermiştir. HFSCs Sept4 / sanat izole edilmiştir - / - dorsal derileri Kontrol THP (FACS) kullanılarak CD34 + ve K15 + HFSCs sayısının fazla iki kat daha yüksek olmuştur. Bunlar Sept4 / SANAT - / - HFSCs in vitro genişletilmiş ve değil sadece daha koloniler doğurdu ama kontrollere 28 ile karşılaştırıldığında aynı zamanda sert koşullarına dayanacak şekilde başardık. HFSCs artan sayısına sahip bir sonucu olarak, Sept4 / sanat - / - farelerinin, deri eksizyon yaralanmaları yanıt olarak önemli ölçüde daha hızlı iyileşti. Çarpıcı, Sept4 / SANAT - / - fareler displayeyara yatağından rejenere HFS ve önemli ölçüde daha küçük izleri da çok sayıda. Ayrıca, XIAP (apoptoz X&#39;e bağlı inhibitörü), SANAT biyokimyasal hedefi için silinen fareler bozulmuş iyileşme 28 gösterdi. Bizim sonuçları ve diğer laboratuarlarda yapılan çalışma HFSCs yetişkin SC&#39;ler biyolojisi ve fonksiyonu eğitim için ideal bir model olarak hizmet olduğunu göstermiştir. Burada, zenginleştirme ve HFSCs dört markerlerin ekspresyonu göre epidermal keratinositler izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır: integrin α6; integrin β1; Sca-1 (epidermal keratinositler için bir belirteç) ve CD34. K15 + HFSCs Benzer bir ayrılma K15-GFP raportör fare 19 kullanılarak da gerçekleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>İzofluran&nbsp;</td><td>İlkel Yoğun Bakım</td><td>&nbsp; 66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>Karbondioksit</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Elektro Tıraş Makinesi</td><td>Oster&nbsp;</td><td>Başka herhangi bir şirketten</td> <td>Altın A5</td> Tıraş Makinesi,</tr><tr><td>damıtılmış su ile seyreltilmiş %70 etanol Gadot Lab 830000051 %96 ehtanol kullanılabilir&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon matı</td><td></td><td></td><td>Herhangi bir sağlayıcıdan diseksiyon aletleri kullanılabilir</td></tr><tr><td>Foreps</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td>Başka bir firmadan Foreceps kullanılabilir</td></tr><tr><td>Makas&nbsp;</td><td>Dumont</td><td>14094-11</td><td>Başka herhangi bir şirketten makas kullanılabilir</td></tr><tr><td>İğneler/Pimler</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>Albion</td><td>10</td><td>Neşterin ucu kör olduğundan emin olun</td></tr><tr><td>Doku kültürü kabı 60 mm x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>PBS-Kalsiyum</td><td></td><td></td> <td>ve Magnezyum içermeyen kurum içi PBS</td></tr><tr><td>%0,25 Tripsin/EDTA</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>03-050-1A</td><td>Farklı bir firmadan elde edilen tripsin farklı bir aktiviteye sahip olabilir ve tripsin sindiriminin süresi buna göre ayarlanmalıdır</td></tr><tr><td>Pipetler 10 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 4488</td><td></td></tr><tr><td>Buz</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>50 ml steril santrifüj tüpleri</td><td>Minplast Ein-shemer</td><td>35050-43</td><td></td></tr><tr><td>70 & mikro; m Hücre süzgeci</td><td>Fisher</td><td>22362548</td><td></td></tr><tr><td>40 & m Hücre süzgeci</td><td>Fisher</td><td>22362549</td><td></td></tr><tr><td>Boyama</td> <td>tamponu-Santrifüj</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Eppendorf 5804 R</td><td>5805 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci kapaklı FACS tüpleri&nbsp;</td><td>Şahin&nbsp;</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>FACS tüpleri&nbsp;</td><td>Şahin&nbsp;</td><td></td><td></td>352063</tr><tr><td>Integrin ve beta; 1</td><td>eBioscience</td><td>25-0291</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Integrin ve alfa; 6</td><td>eBioscience</td><td>15-0495</td><td>1:600</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>eBioscience</td><td>11-5981</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>eBioscience</td><td>9011-0349</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Kuru Chelex</td><td>BioRad</td><td>142-2842</td><td></td></tr><tr><td>Beher&nbsp;</td><td>Pyrex-Damıtılmış</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>H2O&nbsp;</td><td></td><td></td><td>-</td></tr> <tr><td>Karıştırma çubuğu</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NHCl</td><td>BioLab</td><td>1903059</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Beit Haemek Biological Industries</td><td>400718</td><td>farklı bir firmadan alınan FBS kullanılabilir</td></tr><tr><td>1 L cam şişe</td><td>Ilmabor</td><td>Boro 3.3</td><td></td></tr><tr><td>Şişe üstü filtre</td><td>Autofil</td><td>1102-RLS</td><td></td></tr></tbody></table>

dorsal fare cilt saç folikül kök hücreler ve epidermal keratinositler ayırma

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Saç folikülü (HF), yetişkin kök hücrelerin (SK'ler) biyolojisini ve regülasyonunu incelemek için ideal bir sistemdir. Bu dinamik mini organ, şişkinlik olarak bilinen bir bölge olan HF'nin kalıcı kısmında bulunan farklı SC havuzları tarafından doldurulur. Bu multipotent şişkin SC'ler başlangıçta yavaş döngülü etiket tutma hücreleri olarak tanımlandı; bununla birlikte, CD34 ve keratin 15 (K15) gibi spesifik hücre belirteçlerinin tanımlanmasından sonra izolasyonları mümkün hale getirilmiştir. Burada, floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) teknolojisini kullanarak fare HF'lerinden şişkin SK'leri ve epidermal keratinositleri izole etmek için sağlam bir yöntem açıklıyoruz. İzole saç folikülü SK'leri (HFSC'ler) çeşitli in vivo greftleme modellerinde kullanılabilir ve çoklu potansiyel, sessizlik ve aktivasyonu yöneten mekanizmaları incelemek için değerli bir in vitro modeldir.

Bu protokol ayrıntılı olarak zenginleştirme ve nüfusun iki tip izolasyonunu anlatmaktadır. Şişkinlik AVM ve epidermal keratinositler 2 protokolünün önemli adımlar göstermektedir Şekil. geri 8 haftalık farelerin dorsal kaldırıldı cilt kullanarak, biz sadece HFSCs ifade edilir CD34 işaretleyici kullanarak tümsek SC&#39;ler zenginleştirilmiş; ve Sca-1, epidermal keratinositler etiketler. 3 cilt epitel hücrelerinin α6 + / ß1 ...

Yetişkin kök hücre biyolojisini incelemek için ideal bir model fare kılı folikülüdür. Burada, fare sırt derisinin enzimatik sindirimini ve ardından FACS analizini kullanarak farklı saç folikülleri kök hücre ve epidermal keratinosit popülasyonlarını izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Bu protokolün genel amacı, fare sırt derisinden farklı kök hücre popülasyonlarını ve epidermal keratinositleri izole etmektir. Bu protokol, kullanıcının fare sırt derisinden aynı anda birden fazla hücre popülasyonunu izole etmesine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajları; hızlı, güvenilir olması ve heterojen deri hücresi popülasyonu karışımı içerisinden ilgilenilen spesifik hücre tiplerini izole etmek için kullanılabilmesidir.Prosedürü laboratuvarımdan Dr. Yahav Yosefzon gerçekleştirecektir. Kıl folikülü döngüsünün telojen fazında olan 50 ila 80 günlük bir farenin sırt bölgesindeki tüm tüyleri, cilde ve deri altı tabakasına zarar vermeden, elektrikli tıraş makinesini cilde mümkün olduğunca yakın tutarak tıraş ederek başlayın. Ardından, cildi dezenfekte etmek ve kalan tüy kalıntılarını temizlemek için %70 etanol kullanın.Fareyi bir diseksiyon pedinin üzerine yerleştirin. Ardından, kuyruk yakınındaki deriyi kaldırmak için pens kullanın ve deriyi makasla hafifçe kesin. Tüm dorsal deriyi toplamak için, deriyi fasyadan ayırarak dokuyu posterior-anterior yönde dikkatlice kesin.Derinin tamamı çıkarıldıktan sonra, dokunun birbirine komşu iki kenarını tüy tarafı aşağı gelecek şekilde bi

isolating-hair-follicle-stem-cells-epidermal-keratinocytes-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada fare epidermal nöral krest kök hücreleri (EPI-NCSC) izole etmek için yöntem gösteriyor. Tekniği içerir mikro diseksiyon, bıyık kıl follikülleri, şişlik izole ve doku kültürü içine placeing. 4 gün - 3 gün içinde EPI-NCSC alt tabaka üzerine çıkıntı eksplantlar göç etmeye başlar.

Fare Epidermal Sinir Crest Kök Hücre (EPI-NCSC) Kültürler

Insan derisi canlı yetişkin epitelyal kök hücreleri izole bir hızlı, sağlam bir şekilde açıklanmıştır. Bu yöntem cilt kollajen matriks enzimatik sindirim, saç folikülleri ve hücre kültürü için, tek bir hücre süspansiyonları ya da doku parçalarının izolasyonu koparma kullanır.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Kazanç ya da kayıp fonksiyon-arabuluculuk lentivirüs kullanarak bir saç kökü yenilenme modeli Doku özgü analizi.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Sürekli büyüyen fare kesici diş epitel kök hücreler (DESCs) diş dokularının yenilenmesini eğitim için bir model sağlar. Sürekli ve güvenilir bir şekilde kesici bu hücrelerin elde edilmesi ve in vitro ile genişletilmesi için sağlam bir sistem burada bildirilmektedir.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Fibroblast davranışı, bir klinik antite spektrumunun temelini oluşturur, ancak büyük ölçüde doğal heterojenlikleri nedeniyle zayıf karakterize edilirler. Geleneksel fibroblast araştırmaları, in vivo fibroblast davranışını maskeleyen in vitro manipülasyona dayanır. Hücre kültürü gerektirmeyen fare derisi fibroblastlarının izolasyonu için FACS tabanlı bir protokol tanımladık.

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Epidermal keratinositler fonksiyonel bir cilt bariyeri oluştururlar ve dış çevresel hakaretlere karşı ana savunmanın ön saflarında yer alırlar. Burada, neonatal ve erişkin fare derisinden epidermal keratinositlerin izolasyonu ve birincil kültürü için yöntemleri ve keratinositlerden gelen terminal farklılaşmayı ve UVB tetiklemeli enflamatuar yanıtın indüksiyonunu tarif ediyoruz.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Bu protokolün amacı, moleküler biyoloji, biyokimya, floresan aktif hücre ayrıştırma ve primer in vitro kullanımlar (örneğin, klojenojenik) gibi çeşitli downstream uygulamaları için yetişkin farelerin dorsal deriden epidermal keratinositleri izole etmektir. keratinositler).

Fare Epidermal Keratinositlerin İzolasyon ve In Vitro Klojenik Kültür

Bu protokol, deri keratinositlerin fare modellerinden izole edilmesi, metal etiketli antikorlarla lekelenme ve farklı hücre döngüsü aşamalarında ilgi proteinlerinin ifade desenini profil için kitle sitometri tarafından lekelenmiş hücreleri analiz etmek için nasıl açıklar.

Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama

Mevcut protokol, yetişkin fare damak tadından elde edilen oral keratinositlerin izolasyonu ve kültürünü açıklar. İmmünasyon kullanılarak yapılan bir değerlendirme yöntemi de rapor edilir.

Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Kas-iskelet sistemi yaralanması ile ilişkili yara iyileşmesinin incelenmesi genellikle Schwann hücreleri (SC'ler), keratinositler ve fibroblastlar arasındaki in vitro etkileşimlerin değerlendirilmesini gerektirir. Bu protokol, bu birincil hücrelerin insan sünnet derisinden izole edilmesini, kültürlenmesini ve karakterizasyonunu açıklar.

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Öğrenin, fare sırt derisinden saç folikülü kök hücreleri ve epidermal keratinositleri izole etme yöntemini. Enzimatik sindirim ve FACS analizi kullanılarak hızlı ve güvenilir sonuçlar elde edilir.

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

Daha fazla video keşfet