Murin Hind Ekstremite Uzun Kemik Diseksiyon ve Kemik İliği İzolasyonu

Bu uzun kemik diseksiyonu ve kemik iliği izolasyon prosedürünün genel amacı, uzun kemikleri hızlı ve sistematik bir şekilde çıkarmak ve daha ileri aşağı akış analizi için kemik iliğini toplamaktır. Bu yöntem, kemik iliği biyolojisi, kanser metastazı ve immünoloji ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, diseksiyon işleminin hızlı ve standart olması, kemik iliği izolasyon prosedürünün oldukça steril olmasıdır, Fareyi sırtüstü pozisyonda konumlandırarak başlayın.

Daha sonra dört pençe yastığını da ayak bileği ekleminin altına sabitleyin ve fareye %70 etanol püskürtün ve bacakları iyice ıslatın. Daha sonra, alt karın bölgesinde, kalçanın hemen üstünde, orta hattın sağında küçük bir kesi yapın ve kesiyi bacaktan aşağıya doğru uzatın ve ayak bileği eklemini geçin. Cildi geri çekin.

Daha sonra, uyluk kemiğinin ön tarafını ortaya çıkarmak için uyluk kemiğinin proksimal ucuna tutturulmuş kuadriseps kasını kesin ve kası, tahtadan 45 derecelik bir açıyla pim ile bacaktan dışarı doğru sabitleyin. Makasla uyluk kemiğinin arka tarafına yaslanın, hamstringleri diz ekleminden uzakta kesin. Ardından, kemiğin arka tarafını ortaya çıkarmak için uyluk kemiğinin proksimal ucuna tutturulmuş cildi ve hamstring kaslarını geri çekin ve pimi 45 derecelik bir açıyla yerleştirerek hamstring kaslarını bacaktan dışarı çıkarın.

Forseps ile uyluk kemiğinin distal ucunu diz ekleminin hemen üzerinde kavrayın. Ardından femur milinin her iki yanındaki makas bıçaklarını kalça eklemine doğru yönlendirin. Femur kafasına ulaştıktan sonra, femuru yerinden çıkarmak için üst bıçağı doğrudan femur başının üzerine hareket ettirerek makası çevirin.

Şimdi femur şaftının üst kısmını forseps ile kavrayın ve uyluk kemiğini asetabulumdan serbest bırakmak için yumuşak dokuyu femur başından kesin. Daha sonra uyluk kemiği, diz ve tibia dahil olmak üzere tüm bacak kemiğini vücuttan yukarı ve uzağa çekin ve bacağı cilde bağlayan bağ dokusunu ve kası dikkatlice kesin. Tüm bağ dokusu çıkarıldığında, ayak bileği eklemini aşırı uzatın ve kaval kemiğini yerinden çıkarmak için makası gösterildiği gibi bükün.

Tibianın distal ucunu kavrayarak ve tendonları koparmamaya dikkat ederek, tibiayı yukarı ve vücuttan ve pin tahtasından uzağa doğru çekin. Daha sonra dizdeki uzun kemiğe bağlı kalan bağ dokusunu ve uyluk kemiği ve kaval kemiğine bağlı ek kas veya bağ dokusunu çıkarın. Uzun kemiği kemik iliği izolasyonuna hazırlamak için, femuru patella dışarı bakacak ve femur başı aşağı bakacak şekilde kavrayın.

Diz eklemini aşırı gerin ve tibiayı femurdan çıkarmak için makası çevirin. Ardından femur ve tibiayı bir arada tutan tüm bağ dokularını çıkarın. Ardından, femuru ön tarafı uzağa ve femur başı aşağı bakacak şekilde kavrayın ve makası femur şaftından kondillere doğru yönlendirin.

Kondilleri, patellayı ve epifizi çıkarmak için makası hafifçe ileri geri döndürün ve metafizi açığa çıkarın. Ardından, uyluk kemiğine bağlı herhangi bir ek kas veya bağ dokusunu çıkarmak için forseps, makas ve Kimwipes kullanın. Ardından, ön tarafı uzağa ve ayak bileği ucu aşağı bakacak şekilde kaval kemiğini kavrayın.

Tibial epifiz sağlamsa, makası tibia şaftından kondillere doğru yönlendirin ve tibial metafizi açığa çıkararak kondilleri ve epifizi çıkarmak için makası hafifçe ileri geri döndürün. Ardından, az önce gösterildiği gibi, tibiaya bağlı herhangi bir ek kas veya bağ dokusunu çıkarın. Kemik iliğini toplamak için önce 18 gauge iğneyi 0,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünün altından itin.

Daha sonra uzun kemikleri diz ucu aşağı gelecek şekilde tüpe yerleştirin ve kapağı kapatın. 0.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünü 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve tüpleri 15 saniye boyunca bir mikrosantrifüjde 10.000 kez g'ye eşit veya daha büyük bir sıcaklıkta santrifüjleyin. Görsel inceleme ile kemik iliğinin kemiklerden çıkarıldığını doğrulayın.

Kemikler beyaz görünmeli ve daha büyük tüpte büyük bir pelet görünmelidir. Daha sonra kemikleri 0.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne atın ve istenen aşağı akış analizi için kemik iliğini uygun çözeltide askıya alın. Bu hızlı diseksiyon tekniği, histomorfometri ve histoloji dahil olmak üzere bir dizi aşağı akış analizi için uygundur.

Gerçekten de, bu temsili histomorfometrik mikro-BT 3D rekonstrüksiyonu ile gösterildiği gibi, hem süngerimsi kemik hem de kortikal kabuk korunur ve kemik histomorfometrisi için standartlaştırılmış yapısal parametrelerin doğru bir şekilde ölçülmesine izin verilir. H ve E ile boyanmış formal ve sabit ve dekalsifiye tibianın bu temsili histolojik bölümünde, histolojik analiz için hem kalsifiye kemiğin hem de hücresel kemik iliğinin bütünlüğünün korunması gözlemlenebilir. Ayrıca, bu prosedürle izole edilen kemik iliği, osteoklastların veya osteoblastların birincil hücre kültürü de dahil olmak üzere birçok aşağı akış uygulaması için uygundur.

Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa, teknik uzun kemik diseksiyonundan kemik iliği izolasyonuna kadar yaklaşık yedi dakika içinde tamamlanabilir. Prosedürü denerken, diseksiyon kolaylığı için fareyi konumlandırmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, kemik iliği hücre popülasyonlarındaki değişikliklerle ilgili ek soruları yanıtlamak için FACS veya diğer tek hücreli işlemler gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, farelerin uzun kemiklerinin nasıl hızlı bir şekilde kesileceğini ve kemik iliğini santrifüjleme ile nasıl izole edeceğinizi iyi anlamalısınız.