Bakteriyel Topluluk Karakterizasyonu Verimli Nükleik Asit Ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen Sıralama

Bu prosedürün genel amacı, sürüntülerden yüksek kaliteli DNA ve RNA'yı izole etmek ve daha sonra 16S rRNA gen dizilimi kullanarak bakteri bileşimlerini belirlemektir. Bu yöntem, bir araştırmacının belirli bir insan örneğinde hangi bakterilerin bulunduğunu belirlemesine ve belirli bakteriler ile konakçı özellikleri veya hastalık durumu arasındaki ilişkileri belirlemesine yardımcı olabilir. Bu yöntem, insan vajinal bakteri toplulukları hakkında bilgi sağlamak için tasarlanmış olsa da, yöntem aynı zamanda burun, ağız, deri ve rektum gibi diğer vücut bölgelerinden ve diğer organizmalardan bakteri topluluklarını incelemek için de uygulanabilir.

Bu videonun protokolün daha zor kısımlarını vurguladığını ve sıralama kısmını veya sıralama analizini kapsamadığını unutmayın. Laboratuvarımdan bir teknisyen olan Brittany Bowman gösterecek. Bu prosedüre, ekteki belgede açıklandığı gibi ıslak buz üzerinde toplanan ve saklanan ektoservikal sürüntülerle başlayın.

Nükleik asit ekstraksiyonuna hazırlanırken, davlumbazın tüm yüzeylerini ve davlumbaza getirilen tüm öğeleri çamaşır suyu ile temizleyin ve ardından RNazları, DNazları ve DNA'yı gideren bir dekontaminant uygulayın. Kaputta, numune başına bir boncuk boncuk tüpü yerleştirin. Her tüpe 500 mikrolitre NaCl-Tris-EDTA tamponu, 210 mikrolitre %20 SDS ve 500 mikrolitre fenol kloroform izoamil alkol ekleyin.

Swabların dikkatli bir şekilde kullanılması, bu protokolle net sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Swabı düşürmeden aktarmak biraz pratik gerektirir ve bunun gibi içi boş şaftlı bir swab kullanırsanız daha kolaydır. Steril forseps kullanarak, swabı taşıma şişesinden boncuk boncuk tüpüne aktarın.

Çubuk kafasını tüpün iç duvarlarına en az 30 saniye boyunca iyice ovalayın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin. Ardından eldivenleri değiştirin ve sürüntü prosedürünü bir sonraki numune ile tekrarlayın.

Tüm numuneler kuvvetlice ovulduktan sonra, en az 10 dakika buz üzerinde soğumaya bırakın. Swabı çıkarmak için 10 dakika geçtikten sonra, sapı steril cımbızla tutun ve temiz bir P200 ucu kullanarak kafayı tüp duvarının içine doğru bastırın. Bu işlem, sürüntüden sıvıyı serbest bırakarak nükleik asit geri kazanımını arttırır.

Boncuk boncuk tüpünü boncuk boncuk içine yerleştirin ve numuneyi dört santigrat derecede iki dakika homojenize edin. Ardından, döküntüleri peletlemek ve sulu ve fenol fazlarını ayırmak için boncuk boncuk tüpünü 6.000 g ve dört santigrat derecede üç dakika santrifüjleyin. Spinden sonra genellikle üç faz görülebilir.

En üst katman, DNA ve RNA'yı içeren sulu fazdır. Alt katman, hücrelerden ve sürüntülerden lipitler ve döküntüler içeren organik fazdır. İnterfaz adı verilen ince beyaz orta tabaka protein içerir.

Sulu fazı, yaklaşık 500 ila 600 mikrolitre, steril 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Eşit hacimde fenol kloroform izoamil alkol ekleyin. Ters çevirme ve kısa girdap ile karıştırın.

Tüpü beş dakika santrifüjleyin. Sıkma işleminden sonra, sulu fazı yeni bir steril 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Malzemeyi ara fazdan veya alttaki fenol fazından aktarmamaya dikkat edin.

Aktarılan hacme dikkat edin ve fenol fazını gelecekteki protein izolasyonu için saklayın. Daha sonra, 0.8 hacim izopropanol ve 0.1 hacim üç molar sodyum asetat ekleyin. Ters çevirerek ve kısaca girdap yaparak iyice karıştırın.

Tüpü en az iki saat ve gece boyunca 20 santigrat derecede soğutarak nükleik asidi çökeltin. Çökeltmenin ardından tüpü 30 dakika santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, süpernatanı çıkarmak için dikkatlice bir pipet kullanın ve peleti sağlam bırakın.

500 mikrolitre% 100 etanol ekleyin. Pelete dokunmadan hafif girdap veya pipetleme ile peleti yerinden çıkarın. Beş dakika santrifüjleyin.

Bir P10 pipeti kullanarak, peleti bozmadan mümkün olduğunca fazla etanolü çıkarın ve atın. Peletleri oda sıcaklığında 15 dakika havayla kurutun. Peletleri 20 mikrolitre UltraPure 0.1X-Tris-EDTA tamponunda yeniden süspanse edin.

Numunenin buz üzerinde 10 dakika soğumasına izin verin ve tam süspansiyonu sağlamak için tekrar tekrar pipetleyin. Bir spektrofotometre kullanarak nükleik asit konsantrasyonunu ölçün. İstenirse, üreticinin protokolünü takip eden bir kolon temizleme kiti kullanarak DNA'yı RNA'dan ayırın.

PCR kurulumu, bu prosedürde kritik bir adımdır. Reaktiflerin, PCR başlığının ve eldivenlerin sterilitesini sağlayarak kontaminasyonu en aza indirmek çok önemlidir. Hızlı ama dikkatli çalışın ve eşyaları kaputun içine ve dışına taşırken uygun tekniği kullanın.

Mikrosantrifüj tüpleri için temiz bir tezgah üstü soğutucu rafı ve davlumbaza bir PCR plaka soğutucusu yerleştirin. 8 oyuklu şerit tüplerini ayrı kapaklarla etiketleyin ve bunları PCR soğutucusuna yerleştirin. Amplifikasyon üç kopya halinde yapılmalı ve her bir astar çifti için şablonsuz su kontrolü dahil edilmelidir.

Ana karışım için soğutucuya bir mikrosantrifüj tüpü yerleştirin. Ardından, her numune için UltraPure su, 5X HF tamponu, DNTP'ler, 515F ileri astar ve ekteki belgede açıklandığı gibi %3 DMSO'yu birleştirin. Daha sonra ana karışıma polimeraz ekleyin ve pipetleyerek karıştırın.

İlk kuyucuğa, 90 mikrolitre ana karışım ve iki mikrolitre ters astar ekleyin, iyice karıştırın. Daha sonra şablon kontrolü olarak görev yapan dördüncü kuyucuğa, 23 mikrolitre master ve iki mikrolitre su ekleyin ve karıştırın. Daha sonra, ilk oyuğa uygun numuneden altı mikrolitre ekleyin.

İyice karıştırın ve 25 mikrolitreyi ikinci kuyucuğa aktarın. İpuçlarını değiştirin, ardından ilk kuyudan üçüncü kuyuya 25 mikrolitre daha aktarın. Her kuyuyu sıkıca kapatın.

Kuyuların iç kısmına veya kapağına dokunmamaya dikkat edin. Ardından, her numune için bu işlemi tekrarlayın. Tüm numuneler hazırlandıktan sonra, şerit tüplerini hızlı bir şekilde döndürün, bir termocycler'a aktarın ve programı çalıştırın.

Çalışma tamamlandıktan sonra, duvarlardan sıvı toplamak için tüpleri hızlı bir şekilde döndürün. Ardından, temiz bir laboratuvar tezgahında, her numuneden alınan üçlü PCR reaksiyonlarını etiketli steril bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. Her bir şablon kontrolünün 25 mikrolitresini ayrı bir steril tüpe aktarın.

Henüz farklı örneklerden amplikonları birleştirmeyin. Başarılı PCR amplifikasyonunu doğrulamak için, her numuneden beş mikrolitreyi %1.5'lik bir agaroz jel üzerine yükleyin ve 30 ila 60 dakika boyunca 120 voltta elektroforez gerçekleştirin. Jeli UV ışığı altında görüntüleyin.

380 baz çifti etrafında tek bir güçlü banda dikkat ederek her bir numunenin başarılı bir şekilde amplifikasyonunu doğrulayın. Çift bant varsa, numuneyi farklı bir ters barkodla yeniden yükseltin. Hiç bant yoksa, aynı ters barkodu veya yeni bir ters barkodlu bir astar kullanarak numuneyi yeniden yükseltin.

Yeniden amplifikasyon başarısız olursa, numunede PCR inhibitörleri bulunabilir, bu durumda PCR inhibitörlerini çıkarmak için kolon bazlı bir DNA temizliği gerçekleştirin. Kalan 70 mikrolitre amplikoyu 20 santigrat derecede saklayın. Şablon yok kontrolünün kalan 20 mikrolitresini, bir bant vermediğini varsayarak atın.

Amplikon havuzunu oluşturmak için, her ampliçağın iki ila beş mikrolitresini tek bir steril tüpte birleştirin. Bir numuneden gelen bant zayıfsa, numunelerin geri kalanına göre iki kat daha fazla hacim ekleyin. Ardından bir kit kullanarak PCR primerlerini çıkarın.

Mümkünse, son kitaplığı oluşturmak için astar içermeyen amplikon havuzlarını birleştirin. Bir spektrofotometre veya florometrik bir sistem kullanarak kütüphanenin DNA konsantrasyonunu belirleyin. Son olarak, numuneleri iki nanomolar ile seyreltin ve dizileme için gönderin.

Dizi analizi ile ilgili ayrıntılı bilgi ekteki belgede verilmiştir. Yüksek kaliteli DNA ve RNA izole edildi ve DNA, bu videoda anlatıldığı gibi 16S rRNA geni V4 bölgesinin PCR amplifikasyonu için şablon olarak kullanıldı. Jel elektroforezi, şablonla amplifiye edilen her numunede yaklaşık 380 baz çifti etrafında tek bir bandın varlığını doğrulamak için kullanıldı.

Aynı astar çifti ile paralel olarak çalıştırılan hiçbir şablon denetiminde bir bant yoktu. PCR amplikonları daha sonra tek bir tüpte birleştirildi, nicelleştirildi ve dizilemeden önce daha da seyreltildi. Burada, okumanın her bir konumundaki dizi kalite puanlarının temsili bir çubuk grafiği gösterilmektedir.

200 baz çiftinden sonra dizi kalitesinin düşmesi normaldir. Ancak ortalama kalite puanı 30'un üzerinde kalmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, fenol kloroform bazlı bir ekstraksiyon kullanarak DNA ve RNA'yı sürüntülerden nasıl izole edeceğinizi, 16SR ribozomal RNA geninin V4 bölgesini nasıl çoğaltacağınızı ve yüksek verimli dizileme için bir kitaplık hazırlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, numune toplama, nükleik asit ekstraksiyonu ve PCR amplifikasyonu sırasında kontaminasyonu önlemek için büyük özen göstermek önemlidir. Fenol kloroform ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken havalandırmalı bir başlıkta çalışmak ve su geçirmez eldivenler, yan siperli koruyucu gözlükler ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.