Kofaktör Yenilenme ve Geliştirilmiş kullanırlılık için Aljinat Boncuk Multi-biyokatalizi immobilizasyonu

Bu deneysel prosedürün genel amacı, artırılmış üretim verimi ve yeniden kullanılabilirlik için aljinat boncuklarına immobilize edilmiş, eşleşmiş bir tüm hücre biyokatalitik sisteminin kullanımını göstermektir. Bu çalışma kapsamında; biyokatalizör immobilizasyonu, stabilite, kofaktör rejenerasyonu ve tüm hücre biyokatalizörleri gibi biyokataliz alanındaki temel sorulara yanıt verilmiştir. Bu tekniğin temel avantajı, kofaktör bağımlı yolaklar aracılığıyla birçok önemli biyomolekülün geliştirilmiş üretimi için basit ancak esnek bir yaklaşım sunmasıdır.

Bu protokolde iki rekombinant E coli suşu kullanılmaktadır. NADH oksidaz eksprese eden SpNOx E coli ve L-arabinitol dehydrogenaz eksprese eden HjLAD E coli. Bu işlem her iki E coli suşu için de aynı olduğundan, uygulama yalnızca HjLAD E coli üzerinden gösterilecektir.

HjLAD E coli'nin tek bir kolonisini, mililitre başına 15 mikrogram Ket-A-My-Sin eklenmiş üç mililitre LB besiyerine inoküle edin ve bir çalkalamalı inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kültürü 15 mikrogram/mL Ket-A-My-Sin içeren 200 mililitre taze LB içerisinde 1/100 oranında seyreltin ve OD 600 yaklaşık 0,6'ya ulaşana kadar 37 °C'de 250 RPM'de inkübe edin. Kültür ortamına 0,1 milimolar IPTG ekleyerek ve 25 °C'de 200 RPM'de altı saat boyunca inkübe ederek HjLAD protein ekspresyonunu indükleyin.

İndüklenmiş hücreleri 3200 ×g'de ve dört °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyerek hasat edin. Süpernatantı uzaklaştırın ve bir sonraki bölümde gösterildiği şekilde hücre peletinin işlenmesine geçin. Bu prosedüre başlamak için, HjLAD E coli ve SpNox E coli hücre peletlerini, litre başına beş gram kuru hücre ağırlığı hücre yoğunluğunda, 50 mM Tris-Hcl tamponunda ayrı ayrı süspande ediyoruz.

14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüp içerisinde, 600 µL litrede beş gram kuru hücre ağırlığında HjLAD E coli, 600 µL litrede beş gram kuru hücre ağırlığında SpNOx E coli, 100 µL 20 mM NAD+ ve 150 µL 2 M L-aribinitol karıştırın. 550 µL 50 mM Tris-HCl ekleyerek reaksiyon hacmini iki mililitreye tamamlayın. Reaksiyon karışımını 30 °C'de ve 200 RPM'de sekiz saat boyunca inkübe edin.

Sekiz saat sonra, karışımı 3200 ×g'de ve dört °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve reaksiyon süpernatantını toplayın. L-ksilüloz üretimini kolorimetrik bir analizle belirlemek için, toplanan süpernatantın 100 µL'sini 1,5 mL'lik bir tüpe çekin. 50 µL %1,5 sistein, 900 µL %70 sülfürik asit ve etanolde çözülmüş 50 µL %0,1 Kar-Piz-All ekleyin ve tüpü üç kez tersyüz ederek nazikçe karıştırın.

Reaksiyon karışımını 37 °C'de ve 200 RPM'de 20 dakika boyunca inkübe edin. Reaksiyon karışımının optik absorbansını bir spektrofotometre kullanarak 560 nm'de ölçün. %4'lük bir aljinat çözeltisi hazırlayarak immobilizasyon protokolüne başlayın.

20 mililitre distile suya 0.8 gram sodyum aljinat ekleyin ve sodyum aljinatı çözmek için karışımı ısıtın. 1,2 mililitre %4'lük aljinat çözeltisine, litre başına beş gram kuru hücre ağırlığındaki HjLAD E coli'den 600 mikrolitre ve litre başına beş gram kuru hücre ağırlığındaki SpNOx E coli'den 600 mikrolitre ekleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek için hücreleri ve aljinatı nazikçe pipetleyerek karıştırın.

Tekdüze boyut, morfoloji ve sertlikte aljinat boncuklarının oluşumunu sağlamak için, hücre aljinat süspansiyonunun, tüm boncukları kaplayacak yeterli hacimdeki kalsiyum klorür çözeltisine, uygun bir mesafeden yavaşça ve damla damla eklenmesi kritik önem taşır. Aljinat hücre süspansiyonunu bir iğne kullanarak şırıngaya çekin, ardından karışımı 100 mililitrelik bir beher içindeki 0,3 molar kalsiyum klorür çözeltisine, sürekli karıştırarak damla damla ekleyin. Çapraz bağlanmanın gerçekleşmesi için boncukları, oda sıcaklığında, karıştırmadan iki ila üç saat boyunca kalsiyum klorür çözeltisinde bırakın.

Kalsiyum klorür çözeltisini, boncukları yerinden oynatmadan dikkatlice 15 mililitrelik konik bir tüpe dökerek uzaklaştırın. Kalan boncukları başka bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Fazla kalsiyum klorürü ve enkapsüle edilmemiş hücreleri uzaklaştırmak için boncukları 50 milimolar Tris-HCl tamponu ile yıkayın.

Boncuklara 10 mililitre tampon ekleyin ve süspansiyonun üç ila beş dakika boyunca rahatsız edilmeden beklemesine izin verin. Boncuklar dibe çöktüğünde, tamponu başka bir kaba boşaltın. Boncukları bu şekilde üç kez yıkayın.

Boncukların parçalanmaması için hiçbir adımda santrifüj yapmayın. Kullanılmış Tris-HCl yıkama tamponunu atmayın. Daha önce toplanan kullanılmış kalsiyum klorür çözeltisi ile birlikte 30 mililitre kullanılmış yıkama tamponunu çekin.

Süzülmüş kalsiyum klorür ve Tris-HCl çözeltisi içindeki immobilize edilmemiş E coli hücrelerini 3200 ×g'de 20 dakika santrifüj ederek çöktürün. Yıkanmış boncukları bir tüpe aktarın. Ardından, hücre peletleri için gösterilen prosedürü takip ederek, ancak hücre peletleri yerine yıkanmış boncukların tamamını kullanarak L-ksilülos biyosentezini değerlendirin.

L-ksilülos üretimi için immobilize edilmiş biyokatalizörlerin stabilitesini değerlendirmek için, boncuklar oluştuktan sonra bunları toplayın. Daha önce gösterildiği gibi, santrifüjlemeden kaçınarak 10 mililitre 50 milimolar Tris-HCl tamponu ile iki kez yıkayın. Daha önce gösterildiği üzere L-ksilülos üretimi reaksiyonunu gerçekleştirmek için yıkanmış boncukların tamamını kullanın.

Daha önce gösterildiği gibi, kolorimetrik bir analizle L-ksilüloz üretimini nicelendirin. L-ksilüloz üretim reaksiyonunu istenen üretim döngüsü sayısı kadar tekrarlayın ve her döngüde reaksiyon süpernatantında üretilen L-ksilüloz miktarını ölçün. L-ksilüloz üretimi, bu kenetlenmiş tüm hücre biyokatalitik sistemi ile artırılmıştır.

150 milimolar L-aribinitol başlangıç konsantrasyonuyla başlandığında, yalnızca HjLAD E coli biyokatalizörünün kullanımı %79 L-ksilülöz verimi sağlamıştır. Buna karşılık, HjLAD E coli ve SpNOx E coli hücrelerinin bir bir oranında kullanılması %96 L-ksilülöz verimi üretmiştir. Biyokatalizör immobilizasyon verimini etkileyen parametrelerin değerlendirilmesi, verimin yüzde bir ile üç arasındaki sodyum aljinat konsantrasyonu artışıyla birlikte yükseldiğini ortaya koymuştur.

Buna karşın, %2'den yüksek sodyum aljinat konsantrasyonları L-ksilülos veriminin azalmasına neden olmaktadır. %2'lik bir sodyum aljinat konsantrasyonu kullanılarak, immobilizasyon ve L-ksilülos verimi için optimal kalsiyum klorür konsantrasyonu 0,3 molar olarak belirlenmiştir. Biyokatalizörün yeniden kullanılabilirliği değerlendirilmiştir.

Bu grafikte, immobilize edilmiş ve serbest kenetlenmiş tüm hücre biyokatalizörlerinin yedi ardışık yeniden kullanım döngüsü için L-ksiluloz üretimi sırasıyla koyu ve açık gri ile gösterilmiştir. Immobilize edilmiş kenetlenmiş tüm hücre biyokatalizörleri ile elde edilen maksimum L-ksiluloz verimi, serbest kenetlenmiş tüm hücre sistemine göre daha düşük olsa da, immobilizasyon ile yeniden kullanılabilirlik artmıştır. Yedi ardışık yeniden kullanım döngüsünün sonunda, immobilize biyokatalizörler stabilitelerini korumuş ve orijinal L-ksiluloz veriminin %65'ini muhafaza etmiştir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, biyokataliz alanındaki araştırmacıların tam çok hücreli biyokatalizörlerin verimlerini ve kofaktörleri içeren temel reaksiyonları keşfetmelerinin önünü açmıştır.