Name: Kofaktör Yenilenme ve Geliştirilmiş kullanırlılık için Aljinat Boncuk Multi-biyokatalizi immobilizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Öğrenin, aljinat boncuklarda immobilize edilmiş çift E. coli suşu kullanarak kofaktör yenilenmesi ve biyokatalizör kullanırlılığını artırma yöntemini. Bu teknik L-xyluloz üretimi için etkili bir biyokataliz protokolü sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma Eğitim, Bilim ve Teknoloji (NRF-2013R1A1A2012159 ve NRF-2013R1A1A2007561), Konkuk Üniversitesi Bakanlığı tarafından finanse Kore Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK) ve Kimya Mühendisliği ve MCubed Bölümü ile Temel Bilimler Araştırma Programı tarafından desteklenen Michigan Üniversitesi&#39;nde programı.

1. Tüm hücre Biocatalysts Hazırlık Not: Rekombinant E. pET28a- SpNox 31 ya da pET28a- HjLAD 28 barındıran E. coli hücreleri, bundan sonra, E. olarak adlandırılır E. coli SpNox E. E. coli HjLAD sırasıyla. <ol><li> E. tek bir koloni İnokülasyon 37 o C, 250 rpm&#39;de coli Luria-Bertani (LB), kanamisin (50 ug / ml) ile takviye edilmiş ortam 3 ml HjLAD bir inkübatör çalkalama O inkübe / N. </li><li> 1 ile kültür sulandırmak: / ml kanamisin ve 50 ug 37 o C&#39;de inkübe içeren taze LB 200 ml, 100, 250 rpm OD kadar 600 ~ 0.6 ulaşır. </li><li> Kültür ortamına 0.1 mM izopropil β-D-tiogalaktopiranosid (IPTG) ilave edilerek HjLAD proteini ifadesine sebep 16 o C, 16 saat boyunca 180 rpm&#39;de inkübe edin. <ol><li> Alternatif olarak, 25 o C, 200 rp de indüksiyon gerçekleştirmekeğer L-ksiluloz biyosentezi 6 saat (aşağıda Adım 2) m aynı gün yapılır. </li></ol></li><li> Indüklenen E. hasat 4 O ° C&#39;de 20 dakika boyunca 3200 x g&#39;de santrifüj ile E. coli HjLAD hücreleri Süpernatantı atın ve hücre pelletini işlemek için 2. Adıma geçin. </li><li> E. 1.4 - Buna paralel olarak, gerçekleştirmek 1.1 adımları E. coli SpNox. </li></ol> 2. biyosentezi Kavrama E. L-ksiluloz E. coli HjLAD E. Kofaktör Rejenerasyon için coli SpNox <ol><li> E. Hücre topakları yeniden süspanse E. coli HjLAD E. E. coli SpNox ayrı 5.0 g kuru hücre ağırlığı (gDCW) / L&#39;lik bir hücre yoğunluğunda, 50 mM Tris-HCI tampon maddesi (pH 8.0) &#39;de. Not: gDCW ve 600 nm&#39;de (OD600) de ölçülen optik yoğunluğu arasında bir ilişki deney kolaylaştırmak için kurulmuş olabilir. kullanılan, formülBu protokol, 1 gDCW / L = 0.722 * OD 600 - Farklı spektrometre arasında değişebilir 0,0965. </li><li> 5.0 gDCW / L E. 600 ul karıştırın E. coli HjLAD, 5.0 gDCW / L E. 600 ul E. coli SpNox, 14 ml, 20 mM NAD +, 100 | il, ve 2 M, L-arabinitolden 150 ul, yuvarlak tabanlı tüpü ve 50 mM Tris-HCl, 550 ul ekleyerek 2 ml reaksiyon hacmi (pH 8.0) . Not: iki tam hücre biyokatalizörlerinin miktarına göre oranı, ürünün sentezini artırmak için optimize edilebilir. Anlatılan sistemin, E. oranın E. coli SpNox E. E. coli HjLAD = 1: 1, L-ksiluloz biyosentez (Şekil 1B) için en uygun olduğu bulunmuştur. </li><li> 30 ° C, 8 saat 200 rpm&#39;de Reaksiyon karışımı inkübe edin. </li><li> 4 o C&#39;de santrifüj sonra süpernatant toplayın 3.200 xg 10 dakika a içinnd aşağıda Adım 3&#39;te açıklandığı gibi, L-ksiluloz üretimini ölçmek için devam edin. </li></ol> L-ksiluloz ölçümü için 3. Renk Ölçümü Tahlili <ol><li> Aspire 1.5 ml tüp içine adım 2.4 toplanan reaksiyon süpernatant 100 ul. </li><li> % 1.5 Sistein 50 ul,% 70 sülfürik asit, 900 ul, ve etanol içinde çözülmüş% 0.1 karbazol 50 ul ilave edin ve boru 3 kez ters yüz edilerek yavaşça karıştırın. </li><li> 37 o C, 20 dakika boyunca 200 rpm&#39;de, reaksiyon karışımı inkübe edin. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak 560 nm&#39;de (A 560), reaksiyon karışımının, optik absorbansı ölçülür. <ol><li> A 560 okuma, 1 üzerinde ise reaksiyon karışımı sulandırmak. </li></ol></li></ol> Kalsiyum Aljinat Boncuk Rekombinant Tüm hücre Katalizörler 4. İmmobilizasyonu <ol><li> damıtılmış su, 100 ml 4 g sodyum alginat çözülür. s ekleyerek aljinat çözeltisi hazırlayınsu odium aljinat kümeleri oluşumunu önlemek için. Gerekirse karışımı ısıtın. </li><li> 5.0 gDCW / L E. 600 ul ekle E. coli HjLAD ve 5.0 gDCW / L E. 600 ul E. coli SpNox 1.2 ml% 4 aljinat adımında 4.1 hazırlanan ve kabarcık oluşumunu önlemek için yumuşak pipetleme hücreleri ve aljinat karıştırın. </li><li> Sürekli karıştırılarak 100 ml&#39;lik bir beher içinde (CaCI2) çözeltisi, bir iğne ile bir şırınga içine aljinat / hücre süspansiyonu aspire ve 0.3 M kalsiyum klorür içine damla damla karışımı ekleyin. Not: aljinat damlacıkları tamamen sular altında olması için aljinat boncuk oluşumu için kullanılan CaCl2 çözeltisinin hacmi yeterli olmalıdır. Buna ek olarak, şırınga iğnesi ve kalsiyum klorür çözeltisi yüzeyi arasındaki mesafe eşit küresel boncuklar oluşmasını sağlamak için en uygun aralıkta muhafaza edilmelidir. Optimum mesafe aralığı deneyi tespit edilebilirally ve iğne iç çapına bağlıdır. bir tahmin olarak, ~ 15 ± 5 cm&#39;lik bir mesafenin 0.6 cm (iç çap) şırınga iğnesi için en uygun olduğu bulunmuştur. </li><li> Çapraz bağlama ve jel boncukları oluşumuna izin vermek için karıştırmadan oda sıcaklığında 3 saat - 2 CaCI2 çözeltisi boncuk bırakın. </li><li> Dikkatli bir 50 ml&#39;lik konik tüp içine CaCl2 çözeltisi dökerek boncuk bozmadan CaCl2 çözeltisi Durusu ve başka bir 50 ml konik tüp içine CaCl2 çözeltisi içinde kalan boncuk aktarın. </li><li> CaCl2 aşırı ve enkapsüle hücreleri çıkarmak için, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 ml ile üç kez boncuk yıkama tamponu. NOT: Herhangi bir aşamada, onları kopma böylece yapıyor gibi boncuk santrifüj yok. 5 dakika - çözeltiden boncuk ayırmak için, süspansiyon 3 rahatsız bekletin. boncuk dibinde yerleşmek ve yıkama tamponu dekante edilebilirBaşka bir kabın içine. <ol><li> Kullanılan yıkama tamponu atmayın. Aşama 4.5 toplanan ikinci CaCI2 çözeltisi ile Tris-HCI yıkama tamponu (30 mi) havuz. </li></ol></li><li> Un-immobilize E. pelet bir araya getirilmiş CaCl2 ve Tris-HCl çözeltisi santrifüj ile coli hücreleri 20 dakika boyunca 3200 x g&#39;de adım 4.6 toplanmıştır. Adım 2.1 &#39;de açıklandığı gibi immobilizasyon etkinliğini belirlemek için, gDCW / L pelet enkapsüle hücrelerin yoğunluğunu hesaplamak. </li><li> Bir tüp içine adım 4,6 yıkanmış boncuk aktarın. adımları 2.2 izleyin - 3.4 hücre pelet yerine yıkanmış boncuklar her kullanılarak L-ksiluloz biyosentezini değerlendirmek için. </li></ol> L-ksiluloz Üretimi için İmmobilize 5. Stabilite Testi <ol><li> Aşama 4.8 boncuk toplayın ve (Kademe 4.6 de tarif edildiği gibi), santrifüj olmadan 50 mM Tris-HCI (pH 8.0) içinde 10 ml tampon ile iki kez yıkanır. </li><li> tüm kullan3.4 - adım 2.2 de tarif edildiği gibi yıkanmıştır tanelerin reaksiyonu gerçekleştirmek için. </li><li> Üretim döngüsü istenen sayıda 5.2 ve her döngüde reaksiyon süpernatant üretilen L-iksuloz miktarını ölçmek - Tekrar 5.1 adımları. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının beyan ederim. Kağıt aljinat taneleri immobilize bir birleştiğinde tüm hücre biyokatalitik sistemini oluşturmak için detaylı metodoloji raporlama amaçlamaktadır. Bilimsel yenilik Önceki bir çalışmada 16 bildirilmiştir.

Son teknolojik gelişmeler biyoteknoloji sektöründe piyasa değeri kademeli artışa neden rekombinant Biotherapeutics ticarileştirilmesi bir dalgalanma sağlamıştır. Böyle bir gelişme ölçeklenebilir endüstriyel sistemlerin 38 kurulmasında büyük söz göstermiştir rekombinant mikroorganizmalar metabolik mühendislik, gelişi olduğunu. Çoğu usul olduğu gibi, genetik olarak mikroplar tarafından üretilen rekombinant biyomoleküllerin başarılı bir şekilde pazarlanmasını sistemi 39 üretim verimi üzerinde son dere...

3 - mikroorganizmalar kullanılarak indirgeyici tam hücreli biyotransformasyon ticari ve terapötik önemli biyomoleküllerin 1 kemo-enzimatik sentezi için yaygın bir yöntem haline gelmiştir. 7 - Bu izole edilmiş enzimlerin kullanımı üzerinde birçok avantajı, özellikle maliyet-yoğun aşağı arıtma süreçlerinin ortadan kaldırılması ve uzun ömürlü 4 gösteri sunuyor. Kofaktörler ürünün oluşumu için gerekli olan biyokatalitik yollar için, bütün-hücre sistemleri pahalı olmayan, elektron-verici ko-substrat 5,8,9 eklenerek in situ kofaktör rejenerasyonunda sağlama potansiyeli vardır. 13 - Ancak, bu kapasite nadir veya pahalı ko-yüzeylerde 10 stokiyometrik konsantrasyon gerektiren reaksiyonlar için azalır. Birlikte bütün hücrelerin zayıf yeniden kullanılabilirliği ile, bu bir ölçeklenebilir ve sürekli süreden kurulmasını engellemektedirction sistemi. Bu eş çarpana-bağımlı Biyotransformasyon bütün hücre sistemlerine Stratejik modifikasyonlar bahsedilen sınırlamalarını aşmak için gereklidir. Spesifik olarak, işbirliği içinde çalışır bütün hücre biyokatalizörlerin kombinasyonu belirgin barındıran enzimler 14 verimlilik ve stabilitesini arttırmak için gösterilmiştir. Genellikle ticari olarak ürünlerin büyük ölçekli üretimi sağlayarak için kritik olan bu faktörler, CO-hareketsizleştirici biyokatalitik mikroplar 15 ile daha da optimize edilebilir. Biz son zamanlarda L-ksiluloz üretimi 16 kofaktör rejenerasyonu ve biocatalyst immobilizasyon hem sağlayan basit ve yeniden tam hücreli biyokatalitik sistemi geliştirdik. Bu çalışmada, bu sistem geliştirilmiş biyotransformasyon üretim verimi ve biocatalyst yeniden kullanılabilirliği için bu iki strateji uygulayarak deneysel prosedürleri göstermek için bir örnek olarak kullanılmıştır. L-ksilüloz bir cla aittirBiyolojik yararlı moleküllerin ss nadir şekerler atadı. Nadir şekerler doğada çok nadir meydana gelen eşsiz monosakkaritler veya şeker türevleri, ancak biyoaktif molekülleri 17,18 tanıma elemanları olarak önemli rol oynarlar. Onlar tatlandırıcılar, fonksiyonel gıdalar potansiyel terapötik 19 arasında değişen çeşitli uygulamalar var. L-ksiluloz birden α-glukozidaz potansiyel bir önleyicisi olarak kullanılabilir ve aynı zamanda, hepatit ve karaciğer sirozu 17,20 bir göstergesi olarak kullanılabilir. Bütün hücre sistemlerinde, L-ksiluloza ksilitol Yüksek verimlilik dönüşüm Pantoea daha önce bildirilmiştir 21,22, Alcaligenes SP ananatis. 701B 23 Bacillus pallidus Y25 24,25 ve Escherichia coli 26. E. E. coli, bununla birlikte, bunun nedeni daha yüksek 1 den bir başlangıç ​​ksilitol konsantrasyonu potansiyel inhibitör etkileri, düşük (&lt;67 mM) ksilitol konsantrasyonları 26 ile sadece elde edildiKsilitol-4-dehidrogenaz aktivitesinin 21,26 00 mM. Ksiluloz ve ksilitol arasında termodinamik denge güçlü ksilitol 25,27 oluşumunu teşvik ettiği gösterilmiştir. Buna ek olarak, ksiluloz verimi in situ kofaktör rejenerasyon sisteminde yokluğunda tedarik gereken pahalı kofaktör miktarı ile sınırlıdır. Birlikte, bu faktörler L-ksiluloz biyosentezi için sürdürülebilir sistemlere ölçekleme potansiyelini sınırlar. Bu sınırlamaları aşmak ve L-ksiluloz biyotransformasyon verimi artırmak için, kofaktör yenilenme stratejisi birleştiğinde tüm hücre biyokatalitik sistemi kurarak ilk istihdam edildi. Spesifik olarak, L-Arabinitol 4-dehidrojenaz Hypocrea jecorina den (EC 1.1.1.12) (HjLAD), mantar, L-arabinoz katabolik yolunda bir enzim, L-ksiluloz 28,29 içine L-arabinitolden dönüşümünü katalize etmek için seçildi . Birçok biyosentetik enzimlerin gibi, büyük bir limitatioHjLAD n bu dönüşümü gerçekleştirmek için pahalı nikotinamid adenin dinükleotid kofaktör (NAD + NADH oksitlenmiş biçimi) stoikiometrik bir miktarda gerektirmesidir. Streptococcus pyogenes (SpNox) bulunan NADH oksidaz yüksek eş çarpana-yenilenmesi etkinliğini 30,31 göstermek için gösterilmiştir. SpNox, E. bu niteliğin yararlanan L-ksiluloz üretimi için HjLAD ifade coli hücreleri E. ile birlikte, NAD + rejenerasyonu için SpNox ifade coli hücreleri Şekil 1A&#39;da gösterilen bağlanmış reaksiyon ile gösterilen L-ksiluloz üretimi artırmak için. Optimal koşullar ve 150 mM L-arabinitolden bir başlangıç ​​konsantrasyonu kullanılarak altında, maksimum L-ksiluloz verimi çok daha verimli literatürde daha bu sistemin hale% 96 olmuştur. Bütün hücre immobilizasyon stratejisi daha da birleştiğinde biocatalyt tekrar kullanılabilirliği arttırmak için bir sonraki istihdam edildiic sistemi. Bütün hücre hareketsizleştirme için yaygın olarak kullanılan yöntemler, katı matrisler, polimer ağları 32 çapraz bağlanma / sıkışması ve kapsülleme bağlantı adsorpsiyon / kovalent bulunmaktadır. Bu yaklaşımlar arasında, hücre immobilizasyon için en uygun yöntem kalsiyum aljinat boncuk kapsülleme olduğunu. Onların hafif jelleşme özellikleri, atıl sulu matris ve yüksek gözeneklilik kapsüllü biyolojik 33 fizyolojik özelliklerini ve işlevselliğini korumak yardımcı olur. Bu nedenle, bağlanan bir biyokatalizör sistemi E. her ikisini de içeren HjLAD ya SpNox barındıran E. coli hücreleri, 7 döngüsünden sonra birinci aşama dönüşüm verimi% 65 muhafaza .bir hareketsizleştirilmiş bir biyokatalizör sistemi iyi çalışma kararlılık göstermiştir, L-ksiluloz üretiminin çok döngüleri sağlamak için kalsiyum aljinat taneleri (Şekil 2) hareketsizleştirildi ardışık tekrar kullanımı, ücretsiz hücre sistemi neredeyse tamamen katalitik aktivite kaybetti.

<table><tbody><tr><td>LB et suyu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-6X1KG</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil ve beta;-D-tiyogalaktopiranosid (IPTG)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>I6758-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Fisher</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>B-Nikotinamid adenin dinükleotid hidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N7004-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3506-10G</td><td></td></tr><tr><td>L-Sistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320501-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Karbazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5132</td><td></td></tr><tr><td>Etanol ve nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum aljinat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W201502</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Excella E24 çalkalayıcı kuluçka makinesi</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary 60 UV-Vis Spektrofotometre</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5810R</td><td>Eppendrof</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beherler</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İğnesi</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pioneer Analitik ve Hassas Tartım Terazisi</td><td>Ohaus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kofaktör yenilenme ve geliştirilmiş kullanırlılık için aljinat boncuk multi-biyokatalizi immobilizasyonu

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Biz son zamanlarda gelişmiş üretim verimi ve sürekli sentezi için kofaktör rejenerasyonu ve biocatalyst immobilizasyon yeteneği ile, basit yeniden kullanılabilir ve birleştirilmiş tüm hücre biyokatalitik sistemi geliştirdik. Açıklanan bu belge, E. iki oluşan bu tür bir sistemin geliştirilmesi için deneysel prosedür işlevsel tamamlayıcı enzimleri ifade coli suşları. Birlikte, bu iki enzim Biyoreaksiyon ürün verimini artırmak için pahalı yardımcı faktörler rejenerasyonunu aracılık etmek için işbirliği içinde işlev görebilir. Buna ek olarak, kalsiyum aljinat taneleri içinde bütün hücrelerin kapsüllenmesi ile bağlanmış biyokatalitik sisteminin bir hareketsiz hale getirilerek sentezlenmesi için bir yöntem rapor edilmiştir. Bir örnek olarak, E. bağlanması ile L-arabinitolden L-ksiluloz geliştirilmiş biyosentezi bu enzimler, L-arabinitolden dehidrojenaz ve NADH oksidaz ifade coli hücreleri. uygun koşullar altında ve 150 arasında bir başlangıç ​​konsantrasyonu kullanılarakmM L-arabinitolden, maksimal L-ksiluloz verim literatürde daha yüksek olduğu% 96 ulaştı. ücretsiz cep sistemi neredeyse tamamen katalitik aktivite kaybetti birleştiğinde tüm hücre biyokatalizi hareketsiz formu, ardışık yeniden kullanım 7 döngüsünden sonra ilk döngüsünde elde edilen verim% 65 koruyarak iyi operasyonel kararlılık göstermiştir. Bu nedenle, burada bildirilen yöntemler L-iksuloz sanayi üretimi yanı sıra, genel olarak kofaktör kullanımını gerektiren diğer katma değerli bileşikler iyileştirilmesine yardımcı olabilir iki strateji sağlar.

Kofaktör yeniden oluşmasını sağlar, L-ksiluloz sentezi E. ihtiva eden bir bağlanmış bütün hücre biyokatalitik sistemde gerçekleştirildiği E. coli HjLAD E. E. coli SpNox hücreleri. Çeşitli parametrelerin optimizasyonu sonra, bu sistemin yeniden kullanılabilirliği kalsiyum aljinat taneleri (Şekil 2) bunu hareketsiz arttırılmıştır. Kavrama...

örnek olarak L-iksuloz üretimini kullanarak kofaktör rejenerasyonu ve geliştirilmiş yeniden kullanılabilirliği eş hareketsiz tam hücre Biyokatalizörler için protokol sundu. Kofaktör yenilenmesi işlevsel tamamlayıcı enzimleri ifade eden iki Escherichia coli suşları birleştirilmesi ile elde edilir; Bütün hücre gibi bir biyokatalizör hareketsizleştirme kalsiyum aljinat taneleri hücre kapsülleme ile elde edilir.

Kofaktör Yenilenme ve Geliştirilmiş kullanırlılık için Aljinat Boncuk Multi-biyokatalizi immobilizasyonu

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Bu deneysel prosedürün genel amacı, artırılmış üretim verimi ve yeniden kullanılabilirlik için aljinat boncuklarına immobilize edilmiş, eşleşmiş bir tüm hücre biyokatalitik sisteminin kullanımını göstermektir. Bu çalışma kapsamında; biyokatalizör immobilizasyonu, stabilite, kofaktör rejenerasyonu ve tüm hücre biyokatalizörleri gibi biyokataliz alanındaki temel sorulara yanıt verilmiştir. Bu tekniğin temel avantajı, kofaktör bağımlı yolaklar aracılığıyla birçok önemli biyomolekülün geliştirilmiş üretimi için basit ancak esnek bir yaklaşım sunmasıdır.Bu protokolde iki rekombinant E coli suşu kullanılmaktadır. NADH oksidaz eksprese eden SpNOx E coli ve L-arabinitol dehydrogenaz eksprese eden HjLAD E coli. Bu işlem her iki E coli suşu için de aynı olduğundan, uygulama yalnızca HjLAD E coli üzerinden gösterilecektir.HjLAD E coli'nin tek bir kolonisini, mililitre başına 15 mikrogram Ket-A-My-Sin eklenmiş üç mililitre LB besiyerine inoküle edin ve bir çalkalamalı inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kültürü 15 mikrogram/mL Ket-A-My-Sin içeren 200 mililitre taze LB içerisinde 1/100 oranında seyreltin ve OD 600 yaklaşık 0,6'ya ulaşana kadar 37 °C'de 250 RPM'de inkübe edin. Kült

immobilization-multi-biocatalysts-alginate-beads-for-cofactor

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Aşağıdaki bölümlerde, biyomedikal uygulamalarda kullanım için aljinat mikroküreler hazırlanması için prosedürleri özetlemektedir. Biz özellikle tip 1 diyabet için potansiyel bir tedavi olarak hücre ve protein encapsulation çift amaçlı çok katmanlı aljinat mikroküreler oluşturmak için bir teknik göstermektedir.

Biyomedikal Uygulamalar için Aljinatta Mikrokürelerin Üretimi

Bu video, nörotoksik amiloid-beta salgılayan hücreleri kapsülleyen polimer mikro boncukların üretilmesi için bir yöntemi göstermektedir. Hücre-polimer süspansiyonu, kalsiyum çapraz bağlama yoluyla elde edilen polimer jelleşmesi ile bir mikroboncuk üretim cihazı aracılığıyla işlenir ve hücrelerin etrafında küresel mikro boncuklar oluşturur. Polimer, hücre çoğalmasına izin verirken, kontrollü, uzun süreli amiloid-beta salınımına izin vererek Alzheimer hastalığındaki birikimini simüle eder.

Alzheimer Hastalığının Modellenmesi için Amiloid-Beta Salınan Polimer Mikro Boncukların İmalatı

Biz sıralı on-chip bioorthogonal Siklokatılma kimya ve antikor-antijen yakalama kullanarak, küçük moleküllerin hızlı, geri dönüşümlü immobilizasyon ve Yüzey Plazmon Rezonans (SPR) çalışmaları için işlevselleştirilen nanoparçacık meclisleri için bir yöntem mevcut.

Tersi Küçük Moleküller veya Biosensor Uygulamaları için Çok bileşenli Yapılar hareketsiz için microfluidic On-chip Yakalama sikloeklenme Tepki

Burada, karın içi yağ dokusunda ısı üretimi için lipitleri tüketen ve obez farelerde enerji dağılımını artıran katabolik hücrelerin kapsüllenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Yağ Dokusu Depolarında içine Nakli Enkapsülasyon termojenik Preadipositler

Pluripotent kök hücreleri (PS hücreleri) bir koaksiyel nozul kullanarak aljinat hidrojel kapsüllerine kapsüllemek için bir yöntem oluşturduk.  Bu, hücrelerin aşırı toplanmasını önler ve süspansiyon kültüründeki hücrelerin yaşadığı kesme stresini sınırlar.  Teknik, PS hücrelerinin seri üretiminin yanı sıra kök hücre nişi üzerine yapılan araştırmalara da uygulanabilir.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Heparin ve protaminden üretilen kendiliğinden birleşen polielektrolit kompleksleri (PEC), osteojenik büyüme faktörlerinin salınımını yakalamak ve düzenlemek için aljinat boncuklar üzerinde biriktirildi. Bu uygulama stratejisi, spinal füzyon uygulamalarında BMP-2 dozunun 20 kat azaltılmasını sağlar. Bu makale, PEC'lerin faydalarını ve üretimini göstermektedir.

Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi

Heterojen hücre popülasyonlarına sahip yük taşıyan dokuların mühendisliği ve analizi hala bir zorluktur. Burada, tek bir yapı içinde çeşitli hücre popülasyonlarının birlikte kültürü için bir platform olarak iki katmanlı aljinat hidrojel diskler oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz.

Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform

Bu video ve el yazması memeli hücrelerini basit bir karıştırma teknesi kullanarak büyük partiler halinde üretilebilen% 0.5 ila% 10 aljinat boncuklar halinde kapsüllemek için emülsiyon temelli bir yöntemi tarif eder. Kapsüllenmiş hücreler, hücresel terapi uygulamaları için in vitro kültürlenebilir veya nakledilebilir.

Alginat Boncuklarda Memeli Hücre Kapsüllenmesinin Basit Bir Karıştırılmış Geminin Kullanımı

Bu protokol, hücreleri hareketsiz etmek için aljinat hızlı fiziksel jelleşme tarafından bir hücre kapsülleme yöntemi gösterilmektedir. Elde edilen mikroboncuk zaman içinde amiloid-β kontrollü ve sürekli salgılanmasını sağlar ve salgılanan amiloid-β in vitro ve in vivo modellerde etkilerini incelemek için kullanılabilir.

Alzheimer hastalığının modellenmesi için amiloid-β-salgıcı alginat Mikroboncuk imalatı

Burada 3D kültür koşullarında domuz oositkapsülasyonu için iki protokol sunulmuştur. İlk olarak, kümülüs-oosit kompleksleri (COCs) fibrin-aljinat boncuklar kapsüllenir. İkincisi, florlu etilen propilen toz parçacıkları (mikrobiyoreaktörler) ile çevrilidir. Her iki sistem de 3B organizasyonlarını sürdürmek için en uygun koşulları sağlar.

Proteolytically Bozulmuş Aljinat Hidrojeller ve Porcine Oosit Kapsülleme için Hidrofobik Mikrobiyoreaktörler

Öğrenin, aljinat boncuklarda immobilize edilmiş çift E. coli suşu kullanarak kofaktör yenilenmesi ve biyokatalizör kullanırlılığını artırma yöntemini. Bu teknik L-xyluloz üretimi için etkili bir biyokataliz protokolü sunar.

Kofaktör Yenilenme ve Geliştirilmiş kullanırlılık için Aljinat Boncuk Multi-biyokatalizi immobilizasyonu

Daha fazla video keşfet