Kofaktör Yenilenme ve Geliştirilmiş kullanırlılık için Aljinat Boncuk Multi-biyokatalizi immobilizasyonu

Bu deneysel prosedürün genel amacı, gelişmiş üretim verimi ve yeniden kullanılabilirlik için aljinat boncuklarda hareketsiz hale getirilmiş birleştirilmiş bir tam hücre biyokatalitik sistemin kullanımını göstermektir. Bu benim konum, biyokatalizörlerin immobilize edilmesi, stabilite, kofaktör rejenerasyonu ve tüm hücre biyokatalizörleri gibi biyokataliz alanındaki temel soruları yanıtladım. Bu tekniğin ana avantajı, birçok önemli biyomolekülün kofaktöre bağlı yollarla daha iyi üretilmesi için basit ama esnek bir yaklaşım sağlamasıdır.

Bu protokolde iki rekombinant E coli suşu kullanılmaktadır. NADH oksidazı eksprese eden SpNOx E coli ve L-arabinitol dehidrojenazı eksprese eden HjLAD E coli. Bu prosedür her iki E coli suşu için aynı olduğundan, sadece HjLAD E coli için gösterilecektir.

Tek bir HjLAD E coli kolonisini, mililitre başına 15 mikrogram Ket-A-My-Sin ile desteklenmiş üç mililitre LB ortamında aşılayın ve bir inkübatör çalkalayıcıda gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kültürü mililitre başına 15 mikrogram Ket-A-My-Sin içeren 200 mililitre taze LB'de bir ila 100 oranında seyreltin ve OD 600 yaklaşık 0.6'ya ulaşana kadar 250 RPM'de 37 santigrat derecede inkübe edin. Kültür ortamına 0.1 milimolar IPTG ekleyerek ve altı saat boyunca 25 santigrat derece, 200 RPM'de inkübe ederek HjLAD protein ekspresyonunu indükleyin.

İndüklenen hücreleri 20 dakika boyunca 3200 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatanı atın ve bir sonraki segmentte gösterildiği gibi hücre peletini işlemeye devam edin. Bu işleme başlamak için, HjLAD E coli ve SpNox E coli'nin hücre peletlerini, litre başına beş gram kuru hücre ağırlığı hücre yoğunluğunda, 50 milimolar Tris-Hcl tamponunda ayrı ayrı süspanse ediyoruz.

14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpte, litre başına 600 mikrolitre beş gram kuru hücre ağırlığı HjLAD E coli, litre başına 600 mikrolitre beş gram kuru hücre ağırlığı SpNOx E coli, 100 mikrolitre 20 milimolar NAD plus ve 150 mikrolitre iki molar L-aribinitol karıştırın. 550 mikrolitre 50 milimolar Tris-HCl ekleyerek reaksiyon hacmini iki mililitreye getirin. Reaksiyon karışımını sekiz saat boyunca 30 santigrat derece ve 200 RPM'de inkübe edin.

Sekiz saat sonra, karışımı 10 dakika boyunca 3200 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin ve reaksiyon süpernatantını toplayın. L-ksilüloz üretimini kolorimetrik bir testle ölçmek için, toplanan süpernatantın 100 mikrolitresini 1.5 militerlik bir tüpe aspire edin. 50 mikrolitre %1.5 sistein, 900 mikrolitre %70 sülfürik asit ve 50 mikrolitre %0.1 Kar-Piz-All etanol içinde çözünmüş ekleyin ve tüpü üç kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.

Reaksiyon karışımını 37 santigrat derece ve 200 RPM'de 20 dakika inkübe edin. Bir spektrofotometre kullanarak reaksiyon karışımının optik absorbansını 560 nanometrede ölçün. % 4'lük bir aljinat çözeltisi hazırlayarak immobilizasyon protokolüne başlayın.

20 mililitre damıtılmış suya 0.8 gram sodyum aljinat ekleyin ve sodyum aljinatı çözmek için karışımı ısıtın. % 4'lük aljinat çözeltisinin 1.2 mililitresine litre HjLAD E coli başına 600 mikrolitre beş gram kuru hücre ağırlığı ve litre SpNOx E coli başına 600 mikrolitre beş gram kuru hücre ağırlığı ekleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek için hücreleri ve aljinatı nazik pipetleme ile karıştırın.

Tek tip boyut, morfoloji ve sertliğe sahip aljinat boncukların oluşumunu sağlamak için, hücre aljinat süspansiyonunun, tüm boncukları kaplayacak şekilde yeterli hacimde kalsiyum klorür çözeltisine yavaş, damla damla bir şekilde optimal bir mesafe için eklenmesi çok önemlidir. Aljinat hücre süspansiyonunu bir iğne kullanarak bir şırıngaya aspire edin, ardından karışımı sürekli karıştırarak 100 mililitrelik bir beherde 0.3 molar kalsiyum klorür çözeltisine damla damla ekleyin. Çapraz bağlanmanın gerçekleşmesine izin vermek için boncukları kalsiyum klorür çözeltisinde karıştırmadan oda sıcaklığında iki ila üç saat

Kalsiyum klorür çözeltisini 15 mililitrelik konik bir tüpe dikkatlice dökerek boncukları rahatsız etmeden kalsiyum klorür çözeltisini boşaltın. Kalan boncukları başka bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Aşırı kalsiyum klorür ve kapsüllenmemiş hücreleri çıkarmak için, boncukları 50 milimolar Tris-HCl tamponu ile yıkayın.

Boncuklara 10 mililitre tampon ekleyin ve süspansiyonun üç ila beş dakika boyunca rahatsız edilmeden durmasına izin verin. Boncuklar dibe çöktüğünde, tamponu başka bir kaba boşaltın. Bu şekilde boncukları üç kez yıkayın.

Boncukları herhangi bir adımda santrifüjlemeyin, aksi takdirde yırtılırlar. Kullanılmış Tris-HCl yıkama tamponunu atmayın. 30 mililitre kullanılmış yıkama tamponunu daha önce toplanan kullanılmış kalsiyum klorür çözeltisi ile çekin.

Çekilmemiş E coli hücrelerini, çekilen kalsiyum klorür ve Tris-HCl çözeltisinin 20 dakika boyunca 3200 kez G'de santrifüjlenmesiyle peletleyin. Yıkanan boncukları bir tüpe aktarın. Daha sonra, hücre peletleri için gösterilen prosedürü takip ederek, ancak hücre peletleri yerine yıkanmış boncukların tümünü kullanarak L-ksilüloz biyosentezini değerlendirin.

L-ksilüloz üretimi için hareketsizleştirilmiş biyokatalizörlerin stabilitesini değerlendirmek için, boncukları oluşturulduktan sonra toplayın. Ve daha önce gösterildiği gibi santrifüjleme olmadan 10 mililitre 50 milimolar Tris-HCl tamponu ile iki kez yıkayın. Daha önce gösterildiği gibi L-ksilüloz üretimi için reaksiyonu gerçekleştirmek için yıkanmış tüm boncukları kullanın.

L-ksilüloz üretimini, daha önce gösterildiği gibi, kolorimetrik bir testle ölçün. İstenilen sayıda üretim döngüsü için L-ksilüloz üretim reaksiyonunu tekrarlayın ve her döngüde reaksiyon süpernanında üretilen L-ksilüloz miktarını ölçün. L-ksilüloz üretimi, bu birleştirilmiş tam hücre biyokatalitik sistemi ile arttırılır.

150 milimolar L-aribinitol'lük bir başlangıç konsantrasyonu ile başlayarak, tek başına HjLAD E coli biyokatalizörünün kullanımı% 79 L-ksilüloz verimi üretti. Karşılaştırıldığında, HjLAD E coli ve SpNOx E coli hücrelerinin bire bir oranında kullanılması, %96'lık bir L-ksilüloz verimi üretti. Biyokatalizör immobilizasyon verimliliğini etkileyen parametrelerin değerlendirilmesi, sodyum aljinat konsantrasyonunun yüzde bir ila üç aralığında artmasıyla verimliliğin arttığını ortaya koymuştur.

Bununla birlikte, %2'den büyük sodyum aljinat konsantrasyonları, L-ksilüloz veriminin düşmesine neden olur. %2'lik bir sodyum aljinat konsantrasyonu kullanılarak, immobilizasyon ve L-ksilüloz verimi için optimal kalsiyum klorür konsantrasyonu 0.3 molar olarak belirlendi. Biyokatalizörün yeniden kullanılabilirliği değerlendirildi.

Bu grafikte, hareketsizleştirilmiş ve serbest birleştirilmiş tam hücre biyokatalizörlerinin art arda yedi yeniden kullanım döngüsü için L-ksilüloz üretimi sırasıyla koyu ve açık gri renkte gösterilmiştir. İmmobilize edilmiş birleştirilmiş tam hücre biyokatalizörleri tarafından maksimum L-ksilüloz verimi, serbest birleştirilmiş bir tam hücre sisteminden daha düşük olmasına rağmen, yeniden kullanılabilirlik immobilizasyon ile iyileştirilir. Ardışık yedi ardışık yeniden kullanım döngüsünün sonunda, hareketsizleştirilmiş biyokatalizörler stabilitelerini korudu ve orijinal L-ksilüloz veriminin% 65'ini korudu.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, biyokataliz alanındaki araştırmacıların tam çok hücreli biyokatalizörlerin verimlerini ve kofaktörleri içeren ana reaksiyonları keşfetmelerinin yolunu açtı.