İlköğretim nöron değerlendirilmesi Xenopus Embriyolar kullanarak immün

Bu deneyin genel amacı, gelişmekte olan xenopus embriyonik beynindeki farklı nöronal hücre popülasyonlarının hızlı ve rahat bir şekilde görselleştirilmesine izin vermektir. Bu yöntemler, ksenopus merkezi sinir sistemindeki nöronal farklılaşmanın düzenleme sürecini gözlemlemek gibi birincil nörojenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nöral kök hücre progenitör havuzunun yanı sıra tek bir deney içinde farklılaşmış bir birincil nöral havuzun aynı anda gözlemlenmesine izin vermesidir.

Bu işleme başlamak için, hava kabarcıkları oluşturmadan plastik veya cam bir pipet kullanarak cam şişeden beş ila on embriyoyu dikkatlice aspire edin. Embriyoları montaj odasına aktarın ve bir stereoskop altında gözlemleyin. Kesit bloğunun sertliğini sağlamak için montaj odasını jelatin solüsyonu ile doldurun.

Ardından, bir çift ince uçlu forseps kullanarak embriyoları yan yana düzenleyin. Kriyojenik uyumlu bir işaretleyici kullanarak haznenin kenarına bir ok çizerek kafa yönünü işaretleyin. Birden fazla embriyo grubu için, her grubun açıklamasını ilgili odanın kenarına yazın.

Ardından, hazneyi yarısı kuru buzla doldurulmuş bir köpük kutuya yatay olarak dikkatlice yerleştirin. Kapağı kapatın ve montaj odasının beş ila on dakika boyunca birer birer donmasına izin verin. Bundan sonra, kriyoseksiyona devam edin veya donmuş numuneleri immünojenisiteyi kaybetmeden en az bir ila iki hafta boyunca 80 santigrat derecede tutun.

Bu prosedürde, kör bir çubuk veya parmağınızı kullanarak haznenin altına bastırarak donmuş numune bloğunu hazneden çıkarın. Ardından, numune tutma diskine birkaç damla doku dondurma ortamı ekleyin. Numune bloğunu, embriyoların ön ucu yukarı bakacak şekilde monte edin ve monte edilen bloğun kriyostat odasının içinde yaklaşık bir dakika veya doku dondurma ortamı opak hale gelene kadar kalmasına izin verin.

Numune tutma diskini, numune bloğunun alt tarafı yukarı bakacak şekilde hemen mikrotom üzerine takın. Numune bloğu hala nispeten yumuşakken bir bıçak kullanarak numune bloğunun bir kısmını kesin. Ardından, sıcaklığının dengeye ulaşmasını sağlamak için numune tutma diskini mikrotom üzerinde en az beş dakika bekletin.

Daha sonra, kurbağa yavrularının kafaları yarı saydam jelatinden görünene kadar numune bloğunu kademeli olarak kesin. Kırpma hızını artırmak için kesit kalınlığını artırın. Sonraki bölümlerin uzun bir şerit halinde oluşturulduğundan emin olmak için bıçağın keskinliği ve açısı gibi kriyostat performansını izleyin.

Kurbağa yavrusu kafaları görünür hale geldiğinde, bitmiş dilimlerin şeritler oluşturabildiğinden ve üst üste binmediğinden veya bıçağa yapışmadığından emin olmak için kriyostatın ayarlarını tekrar normale getirin. Ardından, kurbağa yavrularının kafaları neredeyse açığa çıkana kadar kesmeye devam edin. Örnek bölümleri toplamaya başlamadan önce sahne alanındaki kalan bölümleri fırçalayın.

Yaklaşık 10 ila 15 bölüm yapın ve uzun bir şerit oluşturmalarına izin verin. Kalın kapak cam plakasını yana doğru çevirin ve ince uçlu bir boya fırçası kullanarak şeridi bıçaktan nazikçe çıkarın. Ardından, uzun ekseni bıçağa paralel olacak şekilde sahneye yerleştirin.

10 ila 15 bölüm yapın ve kırılmadan uzun bir şerit oluşturmalarına izin verin. Kolay olmayabilir ve pratik gerektirir. Bir püf noktası, el çarkına çok yüksek hız uygulamamaya çalışmaktır.

Bunun yerine, el çarkını dikkatli ve yavaş bir şekilde döndürün. Bundan sonra, oda sıcaklığında pozitif yüklü bir slayt seçin ve bir kalemle etiketleyin. Ardından, etiketli tarafı aşağı bakacak şekilde şeridin üzerine hızlı ve sıkı bir şekilde bastırın.

Ardından, sürgüyü kriyostat odasından çıkarın. Her slaytta paralel olarak 20 ila 30 dilim düzenlemek için bu adımı tekrarlayın. Kenarları 10 dakika havayla kurutun, ardından hemen immün boyama prosedürüne geçin veya slaytları, immün boyama prosedürü gerçekleşmeden önce üç ila altı aya kadar 80 santigrat derecede bir slayt kutusunda saklayın.

Burada, aşağıdaki görüntüler için konumsal referanslar sağlamak için kullanılacak olan bir ksenopus kurbağa yavrusunun ön beyin, orta beyin, arka beyin ve omuriliğinin karşılık gelen kesit düzlemlerini görebiliriz. Anti-Sox 3, Anti-Asetillenmiş Tubulin ve DAPI ile boyanan ilgili kesitler, nöral kök hücre havuzlarının yanı sıra nöral tüp içindeki nörofilamentlerin göreceli konumlarını gösterir. Ve burada, nöral tüp içindeki farklılaşmış birincil nöronların göreceli konumlarını gösteren Anti-MyT1 ve DAPI ile boyanmış karşılık gelen kesitler verilmiştir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kuru buzdaki numune bloğu için yeterli soğutma süresini garanti etmeyi unutmamak önemlidir. Aksi takdirde, numune bloğu yeterince sert olmayabilir ve bu nedenle kesilmesi zor olabilir.

Geliştirildikten sonra bu teknik, gelişimsel sinirbilim alanındaki araştırmacıların ksenopus merkezi sinir sistemlerindeki sinirsel farklılaşmayı keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bölümlerin nasıl oluşturulacağını iyi anlamalı ve bir xenopus merkezi sinir sistemindeki belirli nöronal hücre havuzlarını gözlemlemelisiniz.