Name: Bir Baş-Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu subpopülasyonu olması Kök Hücre Özellikleri İzolasyonu ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Keşfedin baş-boyun skuamöz hücre karsinomu hücre hatlarından kanser kök benzeri hücreleri izole etme yöntemini. Hoechst boya akış analizi ve akış sitometrisi ile CD44-yüksek/ALDH-yüksek popülasyonları belirleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud'un (UMS3444/US8) Akış Sitometrisi Platformu'ndan Thibault Andrieu ve Sebastien Dussurgey'e sıralamamız sırasındaki tavsiyeleri ve yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, ETOILE ve Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063) bilimsel çerçevesi içinde gerçekleştirilmiştir.

Butun hayvan prosedürleri, Hayvan Bakım yerel kurallarına göre gerçekleştirildi. Bu çalışmanın tüm detayları CECCAPP, bir Fransız etik komite tarafından kabul edildi. Hoechst Boya akış Tahlili tarafından bir yan Nüfus (SP) 1. Seçim <ol><li> Hoechst 33.342 boya ile 50 milyon hücrelerin boyanması. <ol><li> bir &quot;Hoechst&quot; etiketli tüp ve &quot;Hoechst ve Verapamil&quot; etiketli bir: İki 15 ml konik dipli steril tüpler hazırlayın. Steril su içinde 5 mM verapamil hidroklorür çözeltisi 10 ml hazırlayın. Kök hücreleri için kültür ortamı (CM) hazırlayın. <ol><li> Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM): F12 (1: 3, hacim: hacim) hidrokortizon, fetal buzağı serumu (% 5 FCS), 0.04 mg / L, CSC (CM-CSC) CM hazırlanması için, aşağıdakileri birleştirerek penisilin, 100 U / ml, 0.1 g / streptomisin L ve epidermal büyüme faktörü (EGFR) ve 20 ug / L&#39;dir. </li></ol></li><li> Laminer akış kaputu altında, hücreler trypsinize. s ile yıkayın, Ortamı çıkarınterile fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile 75 cm² şişeye tripsin-EDTA, 1 ml (0,5 g / L) ilave edilir. 37 ° C&#39;de 3 dakika kuluçkalayın. parental hücre çizgisi için kullanılan kültür ortamı ilave ederek reaksiyonu durdurun. Bir hücre sayacı kullanılarak hücrelerin sayısını. <ol><li> ana hücre hattı (CM-P) CM hazırlamak için% 10 FCS, 0.4 mg / hidrokortizon L, penisilin, 100 U / ml ve 0.1 g / streptomisin L) ile DMEM tamamlar. </li></ol></li><li> CM-P, 10 7 hücre / ml elde etmek üzere aşama 1.1.2 &#39;de elde edilen hücre süspansiyonu ile seyreltilir. Hazırlanan 2 tüplerde hücre süspansiyonu bölünmüş: tüp &quot;Hoechst ve Verapamil&quot; ve tüp &quot;Hoechst&quot; 4 ml (4 x 10 7 hücre) 100 ul (10 6 hücre) koydu. </li><li> örnek &quot;Hoechst Verapamil&quot; olarak, 5 mM verapamil hidroklorür çözeltisi (nihai konsantrasyon: 0.5 mM) 10 ul ve hafifçe karıştırın. (0.1 g / L son konsantrasyon) 1 g / L Hoechst çözeltisi 5 ul ekle. Örnek &amp; # içinde34; Hoechst &quot;, 1 g 5 ul ekleyin / L Hoechst 10 6 hücre başına çözeltisi (200 ul toplam) Bundan sonra, alüminyum folyo kullanarak doğrudan ışığa maruz kalmaktan korunmuş örnekleri tutmak.. </li><li> 1 saat 30 dakika boyunca 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde tüm tüpler inkübe edin. yerleşme hücreleri önlemek için yavaşça her 15 dakikada karıştırın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüj tüpleri. Süpernatantı ve 1x PBS 2 mL her pelletini. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüj tüpleri. süpernatantı. PBS içinde seyreltilmiş yeniden süspanse &quot;Hoechst Verapamil&quot; 5 mg / L propidyum iyodür (PI) 500 ul tampon maddesiyle topak ve 5 mg / PBS tamponunda seyreltilmiş L PI 4 ml &quot;Hoechst&quot; pelet. </li><li> akış sitometresinde örnek alımı için tüplerde tek hücre agrega kaldırmak ve toplamak için 70 mikron hücre süzgecinden örnek çözümleri aktarın. buz üzerinde örnekleri tutmak ve alüminyum folyo kullanılarak doğrudan ışığa maruz kalmaktan korur. </li></ol></li><li> benHücre sıralayarak Hoechst boyası hariç Yan Nüfus solation. <ol><li> Bir aşağıdaki parametrelerle sıralayıcı flow sitometri üzerinde Hoechst negatif hücre ayrımı gerçekleştirin: UV lazer (355 nm), mavi Hoechst (BP 450/50) ve kırmızı Hoechst filtreleri (BP 610/20) UV lazer yolda 2 dedektörleri ve 2 toplayıcıları. <ol><li> Birincisi, boyama ve sitometresi set-up akış için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir örnek &quot;Hoechst&quot; analiz. </li><li> &quot;Nokta Plot&quot; tıklayın &quot;Küresel Çalışma&quot; penceresinde, sitometresinin yazılımı kullanarak (beşinci sağ resim üst) ve küresel çalışma sayfasında bir grafik oluşturmak. Ordinat üzerinde bir sağ tıklama ile, FSC-A (ileri dağılım) ve apsis üzerinde, SSC-A (yan dağılım) (Şekil 1A) seçin. Aynı şekilde, SCC-lH nokta arsa karşısında SSC-W oluşturur. Bu ikinci nokta arsa üzerinde, bir P1 bölge oluşturmak için, &quot;Poligon kapısı&quot; (ondördüncü sağ resim üst) (Şekil 1B) 33 tıklatın. Not: P1 bölge olacaktek hücre kapsayacak ve ikilileri ayrımcılık. </li><li> İsteğe bağlı: P1 kapılı PI karşı bir FSC-A oluşturarak PI pozitif hücreleri hariç. Bu nokta arsa üzerinde, PI pozitif ölü hücreleri hariç PI negatif nüfus (P2) seçin. </li><li> &quot;Küresel Çalışma&quot; penceresinde, sitometresi yazılımı kullanarak, &quot;Dot Plot&quot; üzerine tıklayın ve küresel çalışma sayfasında bir grafik oluşturmak. ordinat üzerinde bir sağ tıklama ile, mavi Hoechst-A seçin ve apsis üzerinde, kırmızı Hoechst-A. nüfus bir sağ tıklama ile &quot;Show nüfus&quot; ve P1 seçin. Bu nokta arsa üzerinde, bir bölgeyi (P2) hücrelerin ana nüfus (Şekil 1C) sol yan kolu olarak görünen negatif Hoechst boya yan nüfus (SP) hücreleri seçmek için oluşturun. </li></ol></li><li> örnek &quot;Hoechst&quot; Analiz ve 10.000 olayları toplamak. SP nüfusunu temsil kapı P2, iyi konumlandırılmış emin olmak için, örnek analiz &quot;Hoechst ve Verapamil&quot; (10.000 olaylar)SP nüfus (Şekil 1D) ortadan kaybolması gözlemlemek. </li><li> 1.1.1.1 hazırlanan CM-CSC 1 ml içeren 15 ml&#39;lik bir tüp içinde SP Hoechst boya negatif hücreler toplanır. </li><li> hücre sıralama sonunda, santrifüj, 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de hücre süspansiyonu, süpernatant kaldırmak ve CM-CSC 1 ml pelletini. Bir hücre sayacı kullanılarak sıralanır hücrelerinin sayısını ve bir kültür şişesine hücrelerin uygun sayıda transferi (bakınız Tablo 1). CM-CSC ekleyin ve 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 atmosferde inkübe edin. </li><li> 5 x 10 7 hücre (aşama 3, &quot;hücre kültürü yöntemi&quot; bölümüne bakınız) en az kalana kadar 2 geçitlerin en fazla aynı koşullar altında kültür içinde hücreleri korumak. </li></ol></li></ol> Yan Nüfus&#39;e CD44 yüksek / ALDH yüksek Alt nüfusun 2. Seçim <ol><li> ALDH Algılama Kit ve C SP Hücreleri 50 milyon boyanmaD44 antikor. <ol><li> &quot;Boyanmamış&quot; (Tüp a) &quot;CD44-APC&quot; (Tüp b) &quot;IgG1-APC&quot; (Tüp c) &quot;ALDH&quot; (Tüp d) &quot;ALDH ve DEAB aşağıdaki gibidir: yedi 15 ml işaretlenmiş steril tüpler hazırlayın &quot;(Tüp e)&quot; ALDH ve CD44-APC &quot;(Tüp f)&quot; ALDH, DEAB ve CD44-APC &quot;(Tüp g). boyama esnasında 4 ° C&#39;de tüm tüpler ve reaktifleri tutun. </li><li> 4,5 (kitte bulunan) tampon 1 ml ve CD44-APC (alofikosiyanin) antikoru (: 100 seyreltme 1) 45 ul tampon A hazırlayın. tampon 1 100 ul ve IgG1-APC antikor 1 ul (: 100 seyreltme 1) ile tampon B hazırlayın. tampon 1 4 ml kiti reaktif 20 ul tampon C hazırlayın. </li><li> 10 7 hücre / ml, daha önce sıralanmış hücreleri (aşama 1.2.5) &#39;in bir hücre süspansiyonu hazırlanır. A, B ve C, ve tüp f 4 ml (4 x 10 7 hücre) tüplere hücre süspansiyonu 100 uL (10 6 hücre) ekleyin. Şu an için tüpler d, e ve g hücreleri koymayın. </li><li> 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de hücreleri içeren tüpler santrifüjleyin. dietilaminobenzaldehit 5 ul (DEAB), borular e ve g bir ALDH inhibitörü ekleme Süpernatantı ve tüpler, a, b ve tamponun 1. 100 ul Cı pelet tekrar süspansiyon. <ol><li> 4 ml reaktif C ve hemen f tüp içinde süspanse edin hücreleri tüpler d e ve g içine 100 ul aktarın. 30 dakika boyunca 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde tüm tüpler inkübe ve alüminyum folyo ile doğrudan ışığa maruz kalmaktan korur. çökeltme hücreleri önlemek için 15 dakika sonra vorteks ile yavaşça hücre süspansiyonu karıştırın. </li></ol></li><li> Bu andan itibaren, buz üzerinde tüpler tutmak ve alüminyum folyo kullanılarak doğrudan ışığa maruz korunmaktadır. Santrifüj Tüm 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de tüpler ve supernatant çıkarın. </li><li> 4 ml ve borular, tampon B, 100 ul tampon A süspanse boru C, 100 ul, b ve g tüpler yeniden süspanse tüpü F 1. inkübe 10 dakika 4 ° C&#39;de tampon 100 ulC. </li><li> Santrifüj Tüm 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de tüpler ve supernatant çıkarın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g hızında tekrar 1 tamponu 1 ml (tüp f 4 mi) ve santrifüj ile bir kez yıkayın. süpernatantı. Yeniden askıya 4 ml tampon maddesi ile 1 ve 1 ml diğer borularda boru F pelet. </li><li> akış sitometresinde örnek alımı için uygun tüplerde tek hücre agrega kaldırmak ve toplamak için 70 mikron hücre süzgeçler ile örnek çözümleri aktarın. </li></ol></li><li> Floresan CD44 yüksek / ALDH yüksek Hücre Nüfus İzolasyon Hücre Sıralama&#39;yı Aktif. <ol><li> Gerçekleştirmek CD44 yüksek / ALDH bir aşağıdaki parametrelerle sıralayıcı flow sitometri üzerinde sıralama yüksek hücre: bir FITC filtresi (530/30), 1 ile mavi lazer yolda Mavi lazer (488 nm) ve kırmızı lazer (633 nm), 1 dedektör APC filtresi (660/20) ve 2 kolektörleri ile kırmızı lazer yolda dedektör. </li><li> sitometresi yazılımı kullanarak, Dot Plo &quot;üzerine tıklayınt &quot;(beşinci sağ üst resim) bölümünde 1.2.1.2 açıklandığı gibi, SSC-A nokta arsa karşısında FSC-A oluşturmak için hücre morfolojisi kontrol ve SSC-H karşısında SSC-W ile tek hücrelerden oluşan bir popülasyon seçmek için nokta arsa. </li><li> &quot;Küresel Çalışma&quot; penceresinde, sitometresi yazılımı kullanarak, &quot;Dot Plot&quot; üzerine tıklayın ve küresel çalışma sayfasında bir grafik oluşturmak. ordinat üzerinde bir sağ tıklama ile, çift lekeli nüfusu seçmek için APC-A ve apsis, FITC-A seçin. ALDH yüksek hücreleri (Şekil 2A) seçmek için d ve e tüplerini kullanarak bir kapı oluşturun. Not: Pozitif hücreler DEAB (Şekil 2B) ile muamele boru e kaybolur. <ol><li> Aynı Grafikte, CD44 yüksek hücreler (Şekil 2C ve 2D) seçmek için tüpler b ve c kullanarak ikinci bir kapı oluşturun. Pozitif hücreler, IgG1-aPC ihtiva eden bir tüp içinde kaybolur. F ve g tüpleri analiz ve CD44 yüksek / ALDH &lt;içeren üçüncü bir kapı oluşturmaksup&gt; yüksek hücreleri (Şekil 2E ve 2F). Not: pozitif hücreler, IgG1-APC (Şekil 2D) ihtiva eden bir tüp içinde mevcut ise, hücre ve APC lekeli antikor etkileşimi spesifik değildir. </li></ol></li><li> CM-CSC 1 ml içeren 15 ml tüp içine CD44 yüksek / ALDH yüksek hücreleri toplayın. CM 19 1 ml içeren 15 ml tüp içine düşük de CD44 düşük / ALDH toplayın. Not: Adım 1.1.1.1 tarif edildiği gibi CM-CSC hazırlayın. </li><li> 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj süpernatant kaldırmak ve CM-CSC 1 ml pelletini. sıralanmış hücrelerin sayısını. </li></ol></li></ol> 3. Hücre Kültürü Yöntemi <ol><li> Yukarıda tarif edildiği gibi hücre çift Ayırma işleminden sonra,% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de CM-CSC uygun bir kültür şişesi (Tablo 1) ayrılmıştır hücreler plaka. 18-24 saat sonra,Hücreler yapıştırılır kontrol ve kültür ortamı değiştirin. genişleyen koloniler% 50 konfluent daha büyük olana kadar her 3 günde bir kültür ortamı değiştirin. </li><li> Kültür şişesi hücreleri trypsinize EDTA (Tablo 1) - tripsin 0.5 g / L, uygun hacim kullanın. 37 ° C&#39;de hücreler 3-5 dakika kuluçkalayın. Tripsin hareketi durdurmak için CM-CSC (Tablo 1) uygun hacim. </li><li> Elde edilen hücreler ve plaka CM-CSC ile 175 cm² kültür şişelerinde 4 x 10 5 hücre sayısını. 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5 CO2. Bu konsantrasyonda, 24 saatlik bir ikiye katlanma süresi olan hücreler 7 gün içinde% 70 konfluent olacaktır. </li><li> Bunlar 3 pasajlar tabi önce in vitro veya in vivo deneylerde CSCS kullanın. </li></ol> Tümör Potansiyeli ve CSC Özellikleri 4. Onay <ol><li> Tümör Küre Oluşumu CD44 yüksek / ALDH tümör Potansiyeli Onaylayüksek Hücreler. <ol><li> 3.2 de tarif edildiği gibi hücreler tripsinize. 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de 15 ml&#39;lik bir tüp ve santrifüj 1 x 10 6 hücre ekleyin. Süpernatantı ve bir DMEM pelet yeniden askıya: F12 (3: 1) rhEGF orta FCS bilgilerini, 20 ng / ml heparin ve 1 x B27 4 mg / l. 37 ° C&#39;de 6, alçak ankraj plakaları kültür şişelerinde hücreleri inkübe ve% 5 CO2. Not: DMEM: F12 (3: 1) FCS% 5, rhEGF 20 ng / ml, 4 mg / heparin L ve 1 x B27 hücre FCS içermeyen büyümez halinde içeren ortam. </li><li> (Şekil 3A) tohumlama sonra 4 ila 10 gün arasında bir optik mikroskop ile tümör küre oluşumunu gözlemlemek. Not: Tümör küre çapı en fazla 35 mm olmalıdır. CD44 yüksek / ALDH yüksek hücreler CD44 düşük / ALDH düşük oranla sayısı ve büyüklüğü bakımından daha hızlı ve daha gelişmiş tümör küre oluşumunu gösterecektir. </li></ol></li><li> İn Vivo tümorijenisite Değerlendirilmesi sonraNOD-SCID Fare CD44 / yüksek ALDH yüksek hücrelerinin deri altına enjekte. <ol><li> Ayırma işleminden sonra, üç farklı konsantrasyonda (10 4 hücre / ml, 10 5 hücre / ml ve 10 6 hücre / ml) PBS içinde hücrelerin yeniden askıya. 6 farelerin sağ yan yüz bölgesi içinde deri altına 10 4 hücre / ml (10 3 hücre), 100 ul enjekte edilir. 10 5 hücre / ml (10 4 hücreleri) ve 10 6 hücre / ml (10 5 hücreleri) için de yapın. Not: 10 3 hücreleri test edilebilir daha düşük seyreltme. </li><li> Sol yan bölgede CD44 düşük / ALDH düşük hücrelerin aynı konsantrasyonu enjekte edilir. Kadar 10 hafta boyunca Monitör enjekte edilen fareler tümör ilerlemesi 19 görmek için. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li>
<li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).</li>
<li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).</li>
<li>Dalerba, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+human+colorectal+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).</li>
<li>Hermann, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+cancer+stem+cells+determine+tumor+growth+and+metastatic+activity+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).</li>
<li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+CD90+cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li>
<li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tumorigenic+subpopulation+with+stem+cell+properties+in+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas.</a> Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).</li>
<li>Prince, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+subpopulation+of+cells+with+cancer+stem+cell+properties+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).</li>
<li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+--+Perspectives+on+current+status+and+future+directions%3A+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li>
<li>Soltanian, S., Matin, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and cancer therapy.</a> Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).</li>
<li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li>
<li>Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+--+Normal+stem+cells+%27Jedi%27+that+went+over+to+the+%27dark+side.%27%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'.</a> Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+and+chemoresistance+of+CD133%2B+cancer+stem+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma.</a> Mol Cancer. 5, 67(2006).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance%3A+Cancer+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li>
<li>Bertrand, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Head+and+Neck+Cancer+Stem+Cells+to+Overcome+Resistance+to+Photon+and+Carbon+Ion+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+tumor+stemness+by+increasing+the+invasive+and+tumorigenic+side+population+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction.</a> Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).</li>
<li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li>
<li>Chen, Z. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+concept+in+progression+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oncol%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer.</a> J Oncol. 2009, 894064(2009).</li>
<li>Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+oral+squamous+cell+carcinoma+possesses+tumor+stem+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes.</a> Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subpopulation+of+CD133%28%2B%29+cancer+stem-like+cells+characterized+in+human+oral+squamous+cell+carcinoma+confer+resistance+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy.</a> Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).</li>
<li>Sun, S., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Head+neck+squamous+cell+carcinoma+c-Met%E2%81%BA+cells+display+cancer+stem+cell+properties+and+are+responsible+for+cisplatin-resistance+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis.</a> Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+putative+marker+for+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).</li>
<li>Lim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+traits+in+squamospheres+derived+from+primary+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas.</a> Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).</li>
<li>Yu, Q., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface-localized+matrix+metalloproteinase-9+proteolytically+activates+TGF-beta+and+promotes+tumor+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis.</a> Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).</li>
<li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-initiated+signaling+promotes+the+survival+and+self-renewal+of+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells.</a> Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).</li>
<li>Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+properties+of+CD44%2B+cancer+stem-like+cells+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).</li>
<li>Chen, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cucurbitacin+I+suppressed+stem-like+property+and+enhanced+radiation-induced+apoptosis+in+head+and+neck+squamous+carcinoma--derived+CD44%28%2B%29ALDH1%28%2B%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells.</a> Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).</li>
<li>Clay, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-marker+identification+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+with+aldehyde+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase.</a> Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).</li>
<li>Meinelt, E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeinelt%2C+E+%22Technical+Bulletin%3A+Standardizing+Application+Setup+Across+Multiple+Flow+Cytometers+Using+BD+FACSDiva+Version+6+Software%22">Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software</a>. , BD Biosciences. (2012).</li>
<li>Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2C+one+of+the+markers+of+cancer+stem+cells+in+Hep-2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line.</a> Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).</li>
<li>Fukusumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD10+as+a+novel+marker+of+therapeutic+resistance+and+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).</li>
<li>Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+as+a+molecular+marker+to+screen+cancer+stem+cells+in+hypopharyngeal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer.</a> Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).</li>
<li>Kanojia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+cancer+stem+cells+derived+from+primary+tumors+of+HER2%2FNeu+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice.</a> Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).</li>
<li>Higgins, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cell+multipotency+correlates+with+nanog+expression+and+extent+of+passaging+in+human+glioblastoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts.</a> Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol için diğer HNSCC hücre çizgileri için geçerli olan özel bir hücre soyundan CSCS başarıyla izolasyonu için güvenilir bir yöntem tarif eder. İzole baş ve boyun CSCS bağışık yetmezliği olan farelere 19 transplantasyon in vitro ve fonksiyonel doğrulama ileri moleküler karakterizasyonu için daha sonra uygundur. Ancak, bazı değişiklikler yan nüfus veya ebeveyn hücre hattında bulunan CD44 yüksek / ALDH yüksek oranda bağlı test edilebilir. Yan popülasyonda hücreleri...

Baş ve boyun yassı hücreli karsinom (HNSCC), tüm dünyada sık görülen ve mevcut tedavilerde kaydedilen ilerlemelere rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastaların prognozu kötüdür. Hastanın genel 5 yıllık sağ kalım oranı cerrahi, kemo-radyoterapi ve hedeflenen-terapiler dahil terapötik yaklaşımların kombinasyonu rağmen% 30 civarında olduğunu. Son çalışmalar antikanser tedaviler 1 Aşağıdaki kanser kök benzeri hücrelerin hayatta kalma (rulmanları) için lokal nüks ve uzak metastaz bağlıyor. Göğüs, beyin, prostat, akciğer, kolon, pankreas, karaciğer ve deri 2- dahil olmak üzere çeşitli katı tümörlerin kök hücrelerin özelliklerini (farklılaşmamış durum, kendini yenileme ve farklılaşma kapasitelerinin ve telomeraz aktivitesi) sunan hücrelerin varlığını destekleyen artan kanıtlar vardır 10. Ancak, CSCS kökeni 11,12 belirsizliğini koruyor. Normal kök hücreleri 3,13 veya dedifferen malign transformasyonu kaynaklanabilirCSCS benzeri özellikler 14,15 kazanmak tümör hücrelerinin sokan. Bu nedenle, CSCS ilişkin belirgin yollarının anlaşılmasında erken tanı ve dirençli HNSCC tedavisi konusunda bilgi verilecektir. CSCS ayrıca tümör hücrelerinin 16-19 toplu karşılaştırıldığında tümör nüks sonuçlanan standart kemoterapi ve radyoterapi kaçmasına dirençli fenotipleri, sahip ve 20 nişler hipoksik içine lokalize olduğu öne sürülmüştür. Sayısız faktör gibi sessizliğini eğilimi olarak CSCS bu dirençleri, gelişmiş DNA onarım, up-regüle hücre döngüsü kontrol mekanizmaları ve serbest radikal süpürücü 21 açıklamak için öne sürülmüştür. Dahası, çeşitli onkojenik moleküler yollar özellikle CSCS 17 aktive edilebilir. daha hedefli tedaviler için CSCS bilgi geliştirmek için, kök hücre ile ilgili markörlerin heterojen bağlı, tanımlama ve CSCS izolasyonu için güvenilir yöntemler mikanser 22 çeşitli. HNSCC olarak, kök benzeri tümör başlatan hücreleri, ilaç dışarı atım taşıyıcıları ifade 23, CD44 yüksek, CD24 düşük CD133 yüksek, c-Met + 10,24 fenotipe gibi farklı CSC biyobelirteçlerini (ifade hücreleri sıralayarak primer hasta tümörlerinden izole edilmiştir, 25 ya da ALDH yüksek aktiviteli 26) ya da CSC özelliklere sahip squamospheres oluşturmak için birincil hasta tümörü yetiştirilmesi. Bununla birlikte, squamospheres sayısı, böylece daha fazla karakterizasyon için küçük bir örneklem büyüklüğü 27 çalışmaları vererek, iki pasaj sonra dramatik azalır. Bu nedenle, in vitro deneyler, köklü hücre hatları başlayarak CSCS bilgisini geliştirmek için deney tasarımı için daha kolay bir çözümdür. Bu makalenin amacı, multiparametrik akım sitometri analizi a kullanarak HNSCC hücre hatları CSCS izole etmek için bir yöntem önermektirnd hücre sıralama. ALDH aktivitesinin dahil olmak üzere birçok CSCS özellikleri ile ilişki içinde CD44 ekspresyonu, yan Nüfus (SP) fenotipi sferoid oluşturma yeteneğine ve tümör gelişimini izole edilmesi ve CSCS bu alt-nüfusu karakterize etmek için kullanılır. CD44, bir hücre yüzeyi glikoproteini, hücre yapışması ve göçü katılır. CD44 yüksek kafa ve boyun kanseri modelleri 29-31 de dahil olmak üzere, CSCS 28 bir çok katı tümörlerin olarak ifade edilir. Ayrıca, CD44 yüksek hücreler 10 olamaz in vivo CD44 düşük hücrelerin ise heterojen bir tümör oluşturabilir. SP deney CSC zarı içinde aşırı taşıyıcı proteinlerin ATP-bağlayıcı kaset (ABC) ailesi ile Hoechst boya 22 akıttığı hücre ayırıcı potansiyeli dayanır. Bu deney, bu kontrol numunelerinde verapamil ABC transportör inhibitörlerinin kullanılmasını içerir. Aldehit dehidrogenaz (ALDH) ret için retinol dönüştürme görev yapan hücre içi enzimerken kök hücre farklılaşması 25,26 sırasında inoic asit elde edildi. Yüksek ALDH aktivite göstermek HNSCC 26 kök benzeri hücre davranışını ve ALDH yüksek hücrelerin çok az sayıda sergileyen hücreler in vivo 26,32 tümör oluşturmak edebiliyoruz. Bu belirteçlerin ve özellikleri kombinasyonu başarıyla Bertrand e t arkadaşları tarafından kullanılmıştır. Vitro ve foton bu CSCS in vivo ve karbon iyon radyasyonu 19 direncini incelemek için. Bu sonuçlar açık bir şekilde, çeşitli hücre belirteçleri ve özellikleri kombinasyonu tek markör yaklaşımlara göre HNSCC CSCS popülasyonları hakkında yararlı çalışmalar için daha seçici olduğu gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Fetal Buzağı Serumu Altın</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon suda çözünür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin 100x</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Fındık Karışımı (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>Çözelti kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır çünkü çok kararsızdır</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>StemcellTM Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50x), eksi A vitamini</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Aşındırıcı, akut toksisite (oral, dermal, soluma) kategori 4</td></tr><tr><td>Verapamil hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-4629</td><td>Akut toksisite (oral, dermal, inhalasyon) kategori 3</td></tr><tr><td>Propidium İyodür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Akut toksisite (oral, dermal, inhalasyon) kategori 4</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Kiti</td><td>Kök Hücre</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>CD44-APC, insan antikoru</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-177</td><td></td></tr><tr><td>IgG1-APC, insan antikoru</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-189</td><td></td></tr><tr><td>Z1 coulter parçacık</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Optik mikroskop</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B hücre hattı</td><td>John Little'dan Hediye s</td> <td>Laboratuvar-FaDu</td><td></td></tr> <tr><td>hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>HTB-43</td><td></td></tr><tr><td>Düşük ankraj plakaları</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>145383</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva yazılımı v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

bir baş-boyun skuamöz hücre karsinomu subpopülasyonu olması kök hücre Özellikleri İzolasyonu ve karakterizasyonu

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom (HNSCC) ilerleme anlayışı ilerlemelere rağmen, beş yıllık sağkalım oranı nedeniyle lokal nüks ve uzak metastaz düşük kalmaktadır. bu nüksetme açıklamak için bir hipotez içsel kemo ve radyo direnci mevcut kanser kök-benzeri hücreler (rulmanları) varlığıdır. Yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için, hedeflenen tedavi etkinliğini doğrulamak deney modelleri vardır ve bu nedenle CSCS tanımlanması ve izole edilmesi için güvenilir bir yöntem olması gereklidir. Bu amaçla, flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması tarafından gerçekleştirilen iki ardışık hücre sortings (FACS) birleştirilmesine dayanır, insan HNSCC hücre çizgilerinden CSCS izolasyonu için bir protokol mevcut. İlki, diğerleri arasında, dışlamak böylece Kaset (ABC) taşıyıcı proteinler ATP-bağlama ve aşın için CSCS özelliğine dayanmaktadır gibi Hoechst 33342. hücreleri gibi hayati DNA boyalar th ile sıralanıryöntem, bir &quot;yan nüfus&quot; (SP) olarak tanımlanır edilir. SP hücreleri düşük bir yüzde ebeveyn hücrelerinin (&lt;% 5) &#39;i temsil olarak, giderek artan bir fazı ikinci hücre sıralama önce sayısını arttırmak için gereklidir. Bir sonraki adım, iki HNSCC kök hücre özellikleri hücresi yüzey markerine CD44 (yüksek CD44) ve aldehit dehidrojenaz aşırı ifadesi (ALDH yüksek) yüksek ekspresyon seviyesi, yani sahip hücrelerin seçilmesine izin verir. Tek bir belirteç kullanımı CSCS, SP kombinasyonu izolasyonu için çok sayıda sınırlamalar ve tuzaklar olduğundan, CD44 ve ALDH belirteçleri canlı hücreleri gerektiren başka analitik ve fonksiyonel testleri için CSCS izole etmek için yararlı bir araç sağlayacaktır. CSCS sap benzeri özellikleri son tumorispheres oluşumu ve β-katenin sentezlenmesi ile in vitro koşullarında doğrulanmıştır.

HNSCC hücre çizgilerinden CSCS izolasyonu ebeveyn hücre çizgisinde CSCS çok az bir kısmının birbirini takip eden iki sıralama gerekli. İlk ayırma ilaç akış taşıyıcılar nedeniyle Hoechst boya hariç tutmak için CSCS yeteneğine dayanmaktadır. Bu sıralama toplam hücre popülasyonunun (Şekil 1) 1-5% satın alınması ile sonuçlanmıştır. Hoechst boyası negatif hücre sıralama sırasında, SSC-A nokta arsa (Şekil 1A) karşı FSC-A bakarak boyutu ve sıralanmış hücrelerin...

Kanser kök benzeri hücrelerin tümör nüksü ve tedavilere dirençteki rolünü anlamak son on yılda büyük ilgi gören bir konu haline gelmiştir. Bu makale, baş ve boyun skuamöz karsinom hücre hatlarından (HNSCC) kanser kök benzeri hücrelerin alt popülasyonunun izolasyonunu ve karakterizasyonunu açıklamaktadır.

Bir Baş-Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu subpopülasyonu olması Kök Hücre Özellikleri İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Bu prosedürün genel amacı, baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomu veya HNSCC hücre hatlarından kanser kök hücrelerini izole etmektir. Bu yöntem, kanser tedavisi alanında, tümör radyorezistansını aşmak için kemoterapinin nasıl kullanılacağına dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, HNSCC hücre hatlarından elde edilen kanser kök hücrelerinde yüksek bir özgüllük sağlamak için bir dizi belirteç kombinasyonu kullanmasıdır.Prosedür, teknisyenimiz Prescillia Battiston-Montagne ve laboratuvarımdan doktora mezunu Marion Gilormini tarafından gösterilecektir. Hoechst boya eflluks testi ile kanser kök hücre benzeri hücrelerin yan popülasyonunu seçmek için öncelikle bir konik tüpü Hoechst ve diğerini Hoechst ve Verapamil şeklinde etiketleyin. Ardından, bir HNSCC hücre kültürünü steril PBS ile yıkayın ve ardından bir mililitre Tripsyn EDTA ekleyin.37 °C'de üç dakika sonra reaksiyonu taze hücre kültür medyumu ile durdurun ve hücreleri sayın. Kültürü 1 × 10⁷ hücre/mL olacak şekilde seyreltin ve ebeveyn hücre hattı medyumunu tamamlayın. Ardından, Hoechst ve Verapamil tüpüne 100 µL ve Hoechst tüpüne 4 mL hücre ekleyin.Ardından, 10 µL 5 mM Verapamil hidroklorür çözeltisini Hoechst ve Verapamil örneğine nazikçe karıştırın, ardından her iki tüpe 10⁶ hücre başına 5 µL Hoechst ekleyin. Daha sonra örnekleri alüminyum folyo ile kapatın ve 37 °C'ye yerleştirin. Her 15 dakikada bir nazikçe karıştırarak 90 dakika bekledikten sonra tüpleri santrifüjleyin ve pelletleri 2 mL PBS içinde yeniden süspande edin.Merkezkaç işleminden sonra, Hoechst ve Verapamil peletini PBS içinde 500 µL propidyum iyodürde, Hoechst peletini ise aynı çözeltinin 4 mL'sinde yeniden süspande edin. Ardından, agregatları uzaklaştırmak için örnekleri 70 µm hücre süzgeçleri üzerinden FACS tüplerine filtreleyin ve örnekleri ışıktan korunmuş şekilde buz üzerinde bekletin. Son olarak, Hoechst örneğini akış sitometresine yükleyin ve akış sitometresi yazılımındaki Global Çalışma Sayfası (Global Worksheet) penceresini açın.Global Çalışma Sayfası'nda bir grafik oluşturmak için Dot Plot'a tıklayın ve forward (ileri) ve side scatter (yan saçılım) parametrelerini seçmek için sağ tıklayın. Aynı yöntemle bir side scatter wide (yan saçılım genişliği) ile side scatter height (yan saçılım yüksekliği) nokta grafiği oluşturun ve ardından tek hücreleri seçmek ve dubletleri ayırt etmek için ikinci grafikte bir P1 bölgesi oluşturmak üzere polygon gate'e tıklayın. Sonrasında, red Hoechst (kırmızı Hoechst) alanı ile blue Hoechst (mavi Hoechst) alanı şeklinde bir nokta grafiği oluşturun ve P1 popülasyonunu vurgulamak için hücrelerin üzerine sağ tıklayın.Ardından, ana hücre popülasyonunun solunda yan kol olarak görünen negatif Hoechst boyası yan popülasyon hücrelerini seçmek için bir P2 bölgesi oluşturun ve Hoechst örnek olaylarından 10.000 adet toplayın. Yan popülasyonu temsil eden P2 kapısının doğru konumlandırıldığını doğrulamak için, ayrıca 10.000'er adet Hoechst ve Verapamil örnek olayı toplayın. Yan popülasyonun kaybolmuş olması gerekir.Ardından, Hoechst boyası negatif hücrelerin yan popülasyonunu, bir mililitre komple kanser kök benzeri hücre besiyeri içeren 15 mililitrelik konik tüpe sıralayın. Sıralamanın sonunda, hücreleri santrifüjleyin ve yan popülasyon peletini bir mililitre taze komple kanser kök benzeri hücre besiyerinde yeniden süspande edin. Daha sonra hücreleri sayın ve uygun sayıda yeni bir hücre kültürü flaskına ekin.Sıralanmış yan popülasyon hücrelerinden CD44-yüksek/ALDH-yüksek alt kümesini seçmek için, öncelikle yedi adet steril 15 mililitrelik konik tüpü belirtildiği şekilde etiketleyin. Ardından, sıralanmış hücreleri kök hücre besiyerinde 1x10⁷ hücre/mL olacak şekilde seyreltin ve tüm işlemleri buz üzerinde gerçekleştirerek; boyanmamış CD44-APC ve IGG1-APC tüplerine 100 µL, ALDH ve CD44-APC tüpüne ise 4 mL hücre paylaştırın. Hücreleri santrifüjleyin ve boyanmamış CD44-APC ile IGG1-APC peletlerini ALDEFLUOR kitindeki 100 µL tampon 1 içerisinde yeniden süspanse edin.Ardından, ALDH, ALDH ve DEAB ile ALDH DEAB ve CD44-APC tüplerine beş µL ALDH inhibitörü DEAB ekleyin. ALDH ve CD44-APC tüpündeki hücreleri; dört mL tampon bir ve kit içerisinden 20 µL reaktif içeren dört mL reaktif C içerisinde yeniden süspande edin ve bu hücrelerden 100 µL'sini derhal ALDH, ALDH ve DEAB ile ALDH DEAB ve CD44-APC tüplerine aktarın. Daha sonra tüm tüpleri 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirip 30 dakika boyunca ışıktan koruyun ve 15 dakika sonra numuneleri hafifçe vorteksleyerek karıştırın.İnkübasyon sonunda tüm örnekleri santrifüjleyin ve süpernatantları uzaklaştırın. Ardından tüm tüpleri buza yerleştirin ve ALDH ve CD44-APC pelletini dört mililitre tampon A içinde, CD44-APC ve ALDH DEAB ve CD44-APC pelletlerini ise aynı tamponun 100 mikrolitresi içinde yeniden süspanse edin. IGG1-APC pelletini 100 mikrolitre tampon B'de, boyanmamış ALDH ve ALDH ve DEAB tüplerini ise 100 mikrolitre tampon bir içinde yeniden süspanse edin.10 dakika sonra, tüm örnekleri tekrar santrifüjleyin ve ardından ALDH ve CD44-APC örneği hariç tüm örnekleri 1 mililitre tampon bir ile, ALDH ve CD44-APC örneğini ise dört mililitre tampon bir ile yıkayın. İkinci santrifüjden sonra, ALDH ve CD44-APC örneği hariç tüm peletleri bir mililitre taze tampon bir içinde, ALDH ve CD44-APC örneğini ise dört mililitre tampon bir içinde yeniden süspande edin. Şimdi ALDH ve CD44-APC tüpünü akış sitometresine yükleyin ve çift boyalı popülasyonu görselleştirmek için APC'ye karşı bir nokta grafiği oluşturun.Ardından, ALDH-yüksek hücreler için bir kapı oluşturmak üzere ALDH tüpünü yükleyin. ALDH ve DEAB tüpü yüklendiğinde pozitif hücreler kaybolmalıdır. Aynı grafikte, CD44-yüksek hücreleri seçmek için CD44-APC ve IGG1-APC tüplerini kullanarak ikinci bir kapı oluşturun.IGG1-APC tüpü yüklendiğinde pozitif hücreler kaybolacaktır. Ardından, CD44-yüksek/ALDH-yüksek hücreleri içeren üçüncü bir kapı oluşturmak için ALDH ve CD44-APC ile ALDH DEAB ve CD44-APC tüplerini yükleyin. Son kapıyı çift pozitif hücreler üzerine konumlandırmak için çift boyamalı ALDH-CD44 tüpünü kullanın.Ardından, CD44-yüksek/ALDH-yüksek hücreleri, bir mililitre komple kanser kök benzeri hücre besiyeri içeren 15 mililitrelik konik tüpe ve isteğe bağlı olarak CD44-düşük/ALDH-düşük hücreleri bir mililitre komple hücre kültür besiyerine sıralayın. İkinci sıralama işleminden sonra, CD44-yüksek/ALDH-yüksek hücreleri komple kanser kök benzeri hücre besiyeri ile birlikte uygun bir hücre kültür balonuyla hücre kültürü inkübatöründe 18 ila 24 saat boyunca ekleyin. Hücreler balonun tabanına yapıştığında, kültür besiyerini değiştirin ve balonu inkübatöre geri yerleştirin.CD44-yüksek/ALDH-yüksek hücrelerin tümör potansiyelini doğrulamak için, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek üzere gösterildiği gibi kanser kök hücre benzeri monokatmanı tripsinize edin ve 10⁶ hücreyi 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Hücreler santrifüjle çöktürüldükten sonra, peleti rekombinant insan epidermal büyüme faktörü heparin ve B27 ile desteklenmiş düşük serumlu besiyerinde yeniden süspanse edin ve optik mikroskopla tümör küreleri gözlemlenene kadar hücreleri hücre kültürü inkübatöründe, düşük tutunmalı bir petri kabında inkübe edin. Sıralama işlemi yeni bir hücre hattında ilk kez gerçekleştirildiğinde, hücre hattının tümör potansiyelinin, in vitro serumsuz ortamda tümör küreleri oluşturma yeteneği ile kanıtlanarak doğrulanması gereklidir.Ayrıca, QPCR, CD44-high/ALDH-high hücreler tarafından beta-kateninin ve diğer kök hücre benzeri hücre belirteçlerinin yüksek ekspresyonunu göstermelidir. CD44-high/ALDH-high hücreler, CD44-low/ALDH-low hücrelerle karşılaştırıldığında, düşük miktarlarda enjekte edildiklerinde in situ tümörler oluşturabilmelidir. Yöntem USTALIK kazanıldıktan sonra, uygun şekilde gerçekleştirildikleri takdirde her bir hücre ayıklama işlemi beş saat içinde tamamlanabilmelidir.Bu prosedürü uygularken, florokromla işaretlenmiş örneklerin doğrudan ışığa maruz kalmasını önlemeye dikkat etmek önemlidir. Bu prosedürün ardından, kanser kök hücrelerinin metastaz sürecindeki rolüne dair ek soruları yanıtlamak için invazyon migrasyon analizleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, kanser alanındaki araştırmacıların HNSCC kanserinde tümör kaçış mekanizmalarını keşfetmelerine olanak sağlamıştır.Bu videoyu izledikten sonra, çok parametreli akış sitometrik analiz ve hücre ayıklama yöntemlerini kullanarak HNSCC hücre hatlarından kanser kök hücrelerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Tümör hücreleri ve DNA interkalasyon ajanlarıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken önlük ve eldiven giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

isolation-characterization-head-neck-squamous-cell-carcinoma

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kanser kök hücre göçü araştırılması için bir bölme oluşturan mikroakışkan cihaz tarif edilmektedir. Bu yeni platform canlı hücresel mikroçevrede oluşturur ve canlı hücre lokomosyon mikroskobik görselleştirme sağlar. Son derece hareketli kanser hücrelerinin potansiyel olarak daha etkin gelecekteki tedaviler neden agresif infiltrasyon moleküler mekanizmaları, çalışma izole edilmiştir.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

Bu videoda, floresanla aktive edilen hücre sıralayıcı veya FACS kullanarak baş ve boyun skuamöz karsinom hücre hatlarından kanser kök benzeri hücrelerin bir alt popülasyonunun izolasyonunu açıklıyoruz. İzole edilmiş yan hücre popülasyonu, daha fazla aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Kanser Tarafı Popülasyon Ayrımcılığı Deneyi: Hoechst Boya Akıntı Testi Kullanılarak Kanser Kök Benzeri Hücreleri İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Bu makale, birincil hücre kültürleri ve nasıl tümör hücrelerinden eritrositler ve fibroblastların kirlilikler çıkarmak için taze olarak elde edilen melanom doku hazırlanmasını tarif etmektedir. Son olarak, biz nasıl tarif...

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Doğrudan insan dokularından kanser kök hücreler (rulmanları) izolasyonu biyolojik karakterizasyonu için bir koşuldur. Ayrıca zor sorun giderme adımları konusunda ipuçları sağlarken Bu makale, insan dokularından prostat CSCS izolasyonu için bir yöntem anlatılmaktadır.

İnsan Prostat Kanseri Örneklerinden Kanser Kök Hücreleri İzolasyon

İn vitro küre testleri, kanser kök hücrelerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. Burada tek ve çok hücreli küre tahlillerini karşılaştırıyoruz. Daha zahmetli tek hücre bazlı tahliller veya metilselüloz takviyesi daha doğru sonuçlar verirken, sıvı ortamda gerçekleştirilen çok hücreli bazlı tahliller hücre yoğunluğundan büyük ölçüde etkilenebilir.

Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Pankreas kanseri kök hücreleri (CSC'ler), CSC biyolojisini incelemek için güçlü bir araç olan ve yeni CSC hedefleme tedavileri geliştirmek için ilk adım olarak hizmet edebilen ankrajdan bağımsız küre kültürü tekniği kullanılarak in vitro olarak genişletilebilir. Burada pankreatik CSC'lerin genişletilmesi, analizi ve hedeflenmesi için metodoloji sağlanmaktadır.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Kemik sarkomlarda kanser kök hücrelerinin varlığı (rulmanları) son zamanlarda onların patogenezi ile bağlantılı olmuştur. Bu makalede, yapışmayan koşullarda büyümeye CSCS yeteneğini kullanılarak geleneksel osteosarkoma (OS) insan biyopsilerinden elde edilen birincil hücre kültürlerinden CSCS izole sunulmuştur.

Kanser kurulması İnsan Konvansiyonel Osteosarkom Hücre Kültürleri Kök

Tümör Başlatan hücrelerin insan sarkomu hasta türevi xenograflarından floresan-aktif hücre sıralama ile yalıtılması için ayrıntılı bir protokol tanımlayarak, insan lökosit antijen-1 (HLA-1) ' i negatif bir işaret olarak kullanarak ve daha fazla doğrulama ve Bu HLA-1-negatif tümör başlatma hücrelerinin karakterizasyonu.

Sarkom hasta türevi xenografts tümör-başlatma hücrelerinin yalıtım ve karakterizasyonu

Burada bir orthotopic fare modeli baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu geliştirmek için tekrarlanabilir bir yöntem mevcut. Tümör nekroz, zavallı farklılaşma, nodal metastaz ve bağışıklık infiltrasyon gibi hastalığın klinik histopatolojik özellikler göstermektedir. Tümörü taşıyan fareler disfaji, çene deplasman ve kilo kaybı gibi klinik belirtiler geliştirmek.

Skuamöz Hücre Karsinomu Hücre Tümörü bağışıklık profil oluşturma için fareler ve tedaviye yanıt değerlendirme intramucosal aşı

İnsan primer prostat epitel hücreleri kullanarak, kök benzeri hücrelerin küresel tabanlı etiket tutma testi ile fonksiyonel karakterizasyonu için yeni bir biyomarker-free yöntemi ni rapor ediyoruz. BrdU, CFSE veya Far Red 2D hücre etiketlemesi için adım adım bir protokol tanımlanır; üç boyutlu küresel oluşum; immünositokimya ile etiket tutucu kök benzeri hücre tanımlama; ve FACS tarafından izolasyon.

3 Boyutlu Spheroid Kültürlerden Kök Benzeri Hücrelerin İzolasyon

Bu deneysel protokol, BCSC'lerin meme kanseri hücre ve doku örneklerinden izolasyonunun yanı sıra BCSC fenotipini ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek in vitro ve in vivo testleri tanımlamaktadır.

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Keşfedin baş-boyun skuamöz hücre karsinomu hücre hatlarından kanser kök benzeri hücreleri izole etme yöntemini. Hoechst boya akış analizi ve akış sitometrisi ile CD44-yüksek/ALDH-yüksek popülasyonları belirleyin.

Bir Baş-Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu subpopülasyonu olması Kök Hücre Özellikleri İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet