Bir Baş-Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu subpopülasyonu olması Kök Hücre Özellikleri İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, kanser kök hücrelerini baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomundan veya HNSCC hücre hatlarından izole etmektir. Bu yöntem, kanser tedavisi alanında, tümör radyodirencinin üstesinden gelmek için kemoterapinin nasıl kullanılacağına dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, HNSCC hücre dizilerinden kanser kök hücrelerinde yüksek bir özgüllük elde etmek için bir dizi belirteç kullanmasıdır.

Prosedürü göstermek, teknisyenimiz Prescillia Battiston-Montagne ve laboratuvarımdan bir doktora olan Marion Gilormini tarafından yapılacak. Hoechst boya akışı testi ile kanser kök benzeri hücrelerin bir yan popülasyonunu seçmek için, önce bir konik tüp Hoechst ve bir Hoechst ve Verapamil'i etiketleyin. Daha sonra, bir HNSCC hücre kültürünü steril PBS ile yıkayın ve ardından bir mililitre Tripsyn EDTA ekleyin.

37 santigrat derecede üç dakika sonra, taze hücre kültürü ortamı ile reaksiyonu durdurun ve hücreleri sayın. Kültürü mililitrede 10 ila yedinci hücreye bir kez seyreltin ve ebeveyn hücre hattı ortamını tamamlayın. Daha sonra Hoechst ve Verapamil tüpüne 100 mikrolitre ve Hoechst tüpüne dört mililitre hücre ekleyin.

Daha sonra, 10 mikrolitre beş milimolar Verapamil hidroklorür çözeltisini Hoechst ve Verapamil örneğine nazikçe karıştırın, ardından her iki tüpe 10 ila altıncı hücreye bir kez beş mikrolitre Hoechst karıştırın. Daha sonra numuneleri alüminyum folyo ile örtün ve 37 santigrat dereceye yerleştirin. 90 dakika sonra, her 15 dakikada bir hafifçe karıştırarak, tüpleri santrifüjleyin ve peletleri iki mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Bir merkez santrifüjlemeden sonra, Hoechst ve Verapamil peletini PBS'de 500 mikrolitre propidyum iyodür içinde ve Hoechst peletini aynı şekilde dört mililitrede yeniden süspanse edin. Şimdi numuneleri 70 mikronluk hücre süzgeçlerinden geçirerek agregaları çıkarmak için FACS tüplerine süzün ve numuneleri ışıktan korunan buz üzerine yerleştirin. Ardından, Hoechst örneğini akış sitometresine yükleyin ve akış sitometresi yazılımında Global Çalışma Sayfası penceresini açın.

Global Çalışma Sayfasında bir grafik oluşturmak için Nokta Grafiği'ne tıklayın ve ileri ve yan dağılım parametrelerini seçmek için sağ tıklayın. Aynı şekilde bir yan dağılım yüksekliği nokta grafiği ile geniş bir yan dağılım oluşturun ve ardından tek hücreleri seçmek ve çiftleri ayırt etmek için ikinci grafikte bir P1 bölgesi oluşturmak için çokgen kapısına tıklayın. Ardından, mavi bir Hoechst alanı nokta grafiği ile kırmızı bir Hoechst alanı oluşturun ve P1 popülasyonunu vurgulamak için hücrelere sağ tıklayın.

Ardından, ana hücre popülasyonunun solunda bir yan kol olarak görünen negatif Hoechst boya tarafı hücre popülasyonunu seçmek için bir P2 bölgesi oluşturun ve Hoechst örnek olaylarının 10.000'ini toplayın. Yan popülasyonu temsil eden P2 kapısının doğru konumlandırıldığını doğrulamak için, 10.000 Hoechst ve Verapamil örnek olayını da toplayın. Yan popülasyon ortadan kalkmalıdır.

Daha sonra Hoechst boya negatif hücrelerinin yan popülasyonunu, bir mililitre tam kanser kök benzeri hücre ortamı içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe sıralayın. Sıralamanın sonunda, hücreleri döndürün ve yan popülasyon peletini bir mililitre taze tam kanser kök benzeri hücre ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri sayın ve uygun sayıda yeni bir hücre kültürü şişesine tohumlayın.

Sıralanmış yan popülasyon hücrelerinden CD44-yüksek/ALDH-yüksek alt kümesini seçmek için, önce yedi steril 15 mililitrelik konik tüpü belirtildiği gibi etiketleyin. Daha sonra, sıralanmış hücreleri kök hücre ortamında mililitrede 10 ila yedi hücreye bir kez seyreltin ve 100 mikrolitre hücreyi lekelenmemiş CD44-APC ve IGG1-APC tüplerine ve dört mililitre hücreyi ALDH ve CD44-APC tüpüne alikot edin, hepsi buz üzerinde. Hücreleri döndürün ve lekelenmemiş CD44-APC ve IGG1-APC peletlerini ALDEFLUOR kitinden 100 mikrolitre tampon içinde yeniden süspanse edin.

Daha sonra ALDH ve DEAB ve ALDH DEAB ve CD44-APC tüplerine beş mikrolitre ALDH inhibitörü DEAB ekleyin. ALDH ve CD44-APC tüpündeki hücreleri, kitten dört mililitre tampon bir ve 20 mikrolitre reaktif içeren dört mililitre reaktif C içinde yeniden süspanse edin ve bu hücrelerin 100 mikrolitresini hemen ALDH, ALDH ve DEAB ve ALDH DEAB ve CD44-APC tüplerine aktarın. Daha sonra tüm tüpleri 30 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin, ışıktan koruyun ve numuneleri 15 dakika sonra hafifçe girdaplama ile karıştırın.

Kuluçka süresinin sonunda, tüm numuneleri santrifüjleyin ve süpernatanları atın. Daha sonra tüm tüpleri buzun üzerine yerleştirin ve ALDH ve CD44-APC peletini dört mililitre tampon A, bir CD44-APC ve ALDH DEAB ve CD44-APC peletlerini 100 mikrolitrede yeniden süspanse edin. IGG1-APC peletini 100 mikrolitre tampon B'de ve lekelenmemiş ALDH ve ALDH ve DEAB tüplerini 100 mikrolitre tampon birde yeniden süspanse edin.

10 dakika sonra, tüm numuneleri tekrar döndürün ve ardından dört mililitre tamponda yıkanan ALDH ve CD44-APC numunesi dışındaki tüm numuneler için 1 mililitre tamponda bir yıkama yapın. İkinci santrifüjlemeden sonra, dört mililitre tampon birde yeniden süspanse edilen ALDH ve CD44-APC numunesi hariç, tüm peletleri bir mililitre taze tamponda yeniden süspanse edin. Şimdi ALDH ve CD44-APC tüpünü akış sitometresine yükleyin ve çift lekeli popülasyonu görselleştirmek için uygun nokta grafiğine göre bir APC oluşturun.

Ardından, ALDH yüksekliğindeki hücreler için bir kapı oluşturmak üzere ALDH tüpünü yükleyin. ALDH ve DEAB tüpü yüklendiğinde pozitif hücreler kaybolmalıdır. Aynı grafikte, CD44 yüksekliğindeki hücreleri seçmek için CD44-APC ve IGG1-APC tüplerini kullanarak ikinci bir kapı oluşturun.

IGG1-APC tüpü yüklendiğinde pozitif hücreler kaybolacaktır. Ardından, CD44 yüksek / ALDH yüksek hücreleri içeren üçüncü bir kapı oluşturmak için ALDH ve CD44-APC ve ALDH DEAB ve CD44-APC tüplerini yükleyin. Son kapıyı çift pozitif hücrelere yerleştirmek için çift boyama ALDH-CD44 tüpü kullanın.

Daha sonra CD44-yüksek/ALDH-yüksek hücreleri, bir mililitre tam kanser kök benzeri hücre ortamı içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe sıralayın ve CD44-düşük/ALDH-düşük hücreleri istenildiği gibi bir mililitre tam hücre kültürü ortamında toplayın. İkinci sıralamadan sonra, CD44 yüksek / ALDH yüksek hücreleri, hücre kültürü inkübatöründe 18 ila 24 saat boyunca tam kanser kök benzeri hücre ortamı ile uygun bir hücre kültürü şişesine yerleştirin. Hücreler şişenin dibine bağlandığında, kültür ortamını değiştirin ve şişeyi inkübatöre geri koyun.

CD44 yüksek / ALDH yüksek hücrelerin tümör potansiyelini doğrulamak için, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için gösterildiği gibi kanser kök benzeri tek tabakayı tripsinize edin ve altı hücreye bir kez 10 kez 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın. Hücreleri döndürdükten sonra, peleti rekombinant insan epidermal büyüme faktörü heparin ve B27 ile takviye edilmiş serum düşük ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri, tümör küreleri optik mikroskopi ile gözlenene kadar hücre kültürü inkübatöründe düşük ankrajlı bir petri kabında inkübe edin. Sıralama yeni bir hücre hattında ilk kez gerçekleştirildiğinde, in vitro olarak serumsuz ortamda tümör küreleri oluşturma kabiliyeti ile kanıtlandığı gibi hücre hattının tümör potansiyelini doğrulamak gerekir.

Ayrıca, QPCR, CD44-yüksek / ALDH-yüksek hücreler tarafından beta-katenin ve diğer kök benzeri hücre belirteçlerinin yüksek bir ekspresyonunu göstermelidir. CD44-yüksek / ALDH-yüksek hücreler, CD44-düşük / ALDH-düşük hücrelere kıyasla düşük miktarlarda enjekte edildiğinde yerinde tümörler oluşturabilmelidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, her hücre sıralaması, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse beş saat içinde tamamlanabilmelidir.

Bu prosedürü denerken, florokrom etiketli numuneleri doğrudan ışığa maruz kalmaktan korumayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, kanser kök hücrelerinin metastatik sürece katılımı hakkında ek soruları yanıtlamak için invazyon migrasyon testleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, kanser alanındaki araştırmacıların HNSCC kanserinde tümör kaçış mekanizmalarını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, multiparametrik, akış sitometrik analizi ve hücre sıralama kullanarak kanser kök hücrelerinin HNSCC hücre hatlarından nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Tümör hücreleri ile çalışmanın ve DNA ajanlarının birbirine karışmasının son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.