Name: Kan işleme için hızlı bir yöntem insan kanı plazma peptid düzeylerinin veriminin arttırılması için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Öğrenin, insan kanında endojen peptid hormon verimini artırmak için RAPID kan işleme yöntemini. Bu teknik, doğru moleküler form tespiti sağlayarak peptid araştırmalarında değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Eğitim ve Araştırma 03IPT614A (CG) Alman Araştırma Vakfı STE 1765 / 3-1 (AS) ve Alman Bakanlığı tarafından desteklenmiştir. Biz organizasyon ve antropometrik ölçümler yürütülmesi konusunda yardım için Reinhard Lommel ve Petra Busse mükemmel teknik destek yanı sıra Karin Johansson ve Christina Hentzschel teşekkür

protokolü (/ 114/10 protokol numarası EA1) insan araştırma için yerel etik kurul tarafından onaylandı. 1. Kan İşleme <ol><li> Standart prosedür veya HIZLI yönteme göre bir önkol ven ve süreç gecede hızlı bir sonra 07:00 ile 08:00 saatleri arasında venöz kan toplayın. Kan çekilmeden önce egzersiz veya duman değil konuları söyleyin. </li><li> Standart işlem için, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 3000 x g&#39;de 10 dakika içinde soğutulmuş EDTA içeren tüplere kan ve santrifüj toplar. Süpernatant toplayın ve radioimmunoassay ile daha sonra işlenene kadar -80 ° C tutun. </li><li> HIZLI işlem için, hemen kan seyreltilmiş buz soğukluğundaki tampon içinde 1:10 (pH 3.6) 0.1 M amonyum asetat, 0.5 M NaCI ihtiva eden ve enzim inhibitörleri (kan çekilmesinden sonra 1 dakika içinde) (diprotin A, E-64-D, antipain , löpeptin, kimostatin, 1 ug / ml). Daha sonra, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 3000 x g&#39;de 10 dakika içinde santrifüj ve supernatant bize toplamaksıçanlarda 6 önce ayrıntılı olarak polipropilen tüpler bir pipet ing. <ol><li> % 100 asetonitril (hızı 10 mL / dakika) ile şarj kromatografisi kartuş (360 mg, 55-105 um), 1 ml&#39;lik sabit bir hızda süpernatan ile% 0.1 trifloroasetat (TFA, kuru, 10 ml / dakika) ve yük dengelenmesi / bir şırınga pompası kullanılarak dak. </li><li> Daha sonra, 3 ml% 0.1 TFA ile birlikte kartuş (hızı 10 mL / dakika) ile yıkayın ve yavaş yavaş% 0.1 TFA (2 mL / dakika) ihtiva eden 2 mL% 70 asetonitril ile elüte. </li><li> radyoimmünoanaliz ile daha sonra işlenene kadar -80 ° C&#39;de vakum santrifüj ve deposunu kullanan kuru elüt örnekler. NOT: Polipropilen (HIZLI işleme) ve borosilikat (radioimmunoassay) bağlanma özelliklerini önemli ölçüde daha düşük bir yüzey sergiler ve böylece 26 önce çalışılan peptidlerin çoğu için peptid kaybını minimize tüplerde tüm adımları yürütün. </li></ol></li></ol> 2. Ölçümler NOT: Bu bölümdeki adımlar bir laboratuvarda yapılmalıdırradyoaktif malzeme ile çalışmak için onaylanmıştır. Ben alınmalıdır 125 ile çalışmak için standart önlemler. <ol><li> Radyo-işaretli peptidlerin geri kazanımı <ol><li> 125I-radyoetiketlenmiş insan peptidleri elde edilir (örn., Asil-grelin, GLP-1, glukagon, insülin, Kisspeptin, leptin, nesfatin-1 PYY 3-36 ve somatostatin-28). </li><li> daha sonra, taze,% 0.1 asetik asit ile sulandırıldı, deney kadar toz formunda peptidler saklayın (~ ml başına 100,000 cpm). </li><li> standart kan işleme için, tüpler, 3.000-6.000 cpm radyo-50 ul bir tüp içine transferi 1 ml kan içeren soğutulmuş EDTA, kan çekilmesi hemen sonra (doğrudan sayılır deney başlamadan önce). </li><li> HIZLI işlem için, 9 mL HIZLI tampon içeren bir tüp içine kan EDTA içeren transfer 1 ml kan (bileşimin 1.3) ve 500 ul radyo-30,000-60,000 cpm. radiolabe nedeniyle 01:10 seyreltme kullanımı 10 kat daha hacimliHIZLI işleme l. </li><li> Daha sonra, işlem örnekleri olarak aşama 1.3.2 1.2 tarif edilmiştir. </li><li> kurtarma deneyler için, vakum santrifüj yoluyla değil kuru örnekler yapmak ve -80 ° C&#39;de muhafaza etmeyin. Bunun yerine, doğrudan daha sonra bir gama sayacı kullanılarak radyoaktif işaretli peptidlerin kurtarma değerlendirmek. </li><li> RAPID örneklerin kullanılan radyo-miktarının karşılaştırılabilirliğini elde etmek için toplam hacminin 1/10 analiz ederken, standart örneklerde tüm süpernatant ölçün. ölçümü için, gama sayacı içine uydurma tüplerde süpernatant aktarmak ve dakika başına sayıları değerlendirmek </li><li> % 100 standart olarak, işleme tabi olmayan 125l-radyo işaretli peptid, 50 ul iki örnek kullanın. 2.1.7 tarif edildiği gibi, diğer örnekleri ile aynı anda ölçülür. </li><li> Her peptid için deneyini beş altı kez yapın. </li></ol></li><li> Radyoaktif Ghrelin&#39;in Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi <ol><li> c kan çekiniztüpler ve (deney başlamadan önce direkt olarak sayılır) 15.000-20.000 cpm içeren 200 ul radyoaktif işaretli-açil ghrelin içeren tüplere transfer 1 ml içeren tepeli EDTA. </li><li> HIZLI işlem için, 9 mL HIZLI tampon içeren bir tüp içine transferi 1 ml kan (bileşimin 1.3) ve 200 ul radyo-etiketli asil grelin 15.000-20.000 cpm. </li><li> Daha sonra, işlem örnekleri olarak aşama 1.3.2 1.2 tarif edilmiştir. </li><li> ters fazlı HPLC ile daha fazla analiz için su içinde doğrudan% 17 asetonitril içinde dengelenmiş bir stabil bir bağ C18 kolonu (50 mm x 2.1 mm, 1.8 um) (her ikisi de% 0.1 TFA ile takviye edilmiş) üzerinde numunelerin yük. </li><li> 5 dakika dengelenmesinden sonra, (1 ml / dakika akış oranı) 40 dakika içinde örnek elüt edilmesi için 17-40% asetonitril gradyanı kullanın. </li><li> 1 ml her dakika fraksiyonlarını toplamak ve bir gama sayacı kullanılarak radyoaktivite analiz. </li><li> Ayrı bir deneyde, yükleme 200 ul radyo-etiketli asil grelin 15.000-20.000 ihtiva edenkopyaya doğrudan kolona ve adım 2.2.6 ile 2.2.4 açıklandığı gibi HPLC gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Radioimmunoassay <ol><li> radyoimüno için, dondurulmuş üst fazlar (standart işleme) çözülmesi ve oda sıcaklığında kurutulur tozu (hızlı yöntem) vakum. </li><li> Hemen önce radyoimmunoasay plazmanın (500 ul) orijinal hacmine göre çift distile H2O kuru HIZLI örnekleri yeniden askıya. </li><li> Üreticinin protokollerine göre, ticari radyo immün analizleri kullanılarak 12,27 daha önce açıklandığı gibi Kisspeptin toplam (desasil ve açil ghrelin hem de dahil) yanı sıra, asil ghrelin değerlendirin. istikrarlı pelet oluşumuna izin borosilikat tüpler kullanın. <ol><li> Birinci gün, 24 saat bir süre için, üretici tarafından sağlanan seyreltme tahlil tampon maddesi ve birincil antikor (ör., Anti-grelin) numuneler kuluçkalayın. </li><li> Günde iki, vo 125 I izleyici (örneğin 125 I-grelin) ekleyinrtex ve 24 saatlik bir süre için inkübe edilir. </li><li> üçüncü günde, çökeltme reaktif, vorteks eklemek ve üretici tarafından tavsiye edildiği gibi kuluçkaya yatmaktadır. Sonra, santrifüj tüpleri 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 3000 x g&#39;de. Süpernatantlar çıkarın ve bir gama sayacı kullanılarak topaklar radyoaktivite sayımı </li></ol></li><li> toplam eksi asil ghrelin fark olarak desasil ghrelin hesaplayın. her bir örnek için desasil ghrelin tarafından asil bölerek asil / desasil ghrelin oranını değerlendirmek. </li><li> Tüm örnekler Süreç - eğer mümkünse - bir toplu arası tahlil değişkenliği önlemek için. Bu deneyde test içi değişkenliği Kisspeptin için &lt;% 8, &lt;toplam% 7 ve açil Grelin &lt;% 9 idi. </li></ol></li></ol> 3. İstatistiksel Analiz <ol><li> Kolmogorov-Smirnov testi ile verilerin dağılımını belirlemek. ortalamanın ortalama ± standart hata (SEM) gibi verileri ifade eder. </li><li> İki arasındaki farkları değerlendirmekt-testi ile grupları. Holm-Sidak yöntemiyle takip tüm çift-bilge çoklu karşılaştırma prosedürleri (Tukey post hoc testi) veya iki yönlü ANOVA ile çoklu gruplar arasındaki farklılıkları değerlendirmek. </li><li> Önemli p &lt;0.05 düşünün ve bir istatistik programı kullanılarak analiz gerçekleştirin. </li></ol>

<ol><li>Finucane, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National%2C+regional%2C+and+global+trends+in+body-mass+index+since+1980%3A+systematic+analysis+of+health+examination+surveys+and+epidemiological+studies+with+960+country-years+and+9.1+million+participants%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants.</a> Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).</li>
<li>James, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+obesity%3A+the+size+of+the+problem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of obesity: the size of the problem.</a> J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).</li>
<li>Stengel, A., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+peptides+and+their+regulation+of+hunger+and+satiety%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gastroenterol+Rep%22%5BJournal%5D)">Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety.</a> Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).</li>
<li>Hussain, S. S., Bloom, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+food+intake+by+the+gut-brain+axis%3A+implications+for+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity.</a> Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).</li>
<li>Hosoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimum+collection+and+storage+conditions+for+ghrelin+measurements%3A+octanoyl+modification+of+ghrelin+is+rapidly+hydrolyzed+to+desacyl+ghrelin+in+blood+samples%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples).</a> Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAPID+method+for+blood+processing+yields+new+insight+in+plasma+concentrations+and+molecular+forms+of+circulating+gut+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides.</a> Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+differentially+decreases+plasma+acyl+and+desacyl+ghrelin+levels+in+rats%3A+Potential+role+of+the+circulating+ghrelin-acylating+enzyme+GOAT%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT.</a> Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+ambient+temperature+reverses+abdominal+surgery-induced+delayed+gastric+emptying+and+decreased+plasma+ghrelin+levels+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats.</a> Peptides. 31, 2229-2235 (2010).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+administration+of+pan-somatostatin+agonist+ODT8-SST+prevents+abdominal+surgery-induced+inhibition+of+circulating+ghrelin%2C+food+intake+and+gastric+emptying+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats.</a> Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).</li>
<li>Stengel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+surgery+inhibits+circulating+acyl+ghrelin+and+ghrelin-O-acyltransferase+levels+in+rats%3A+role+of+the+somatostatin+receptor+subtype+2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injection+of+urocortin+1+induces+a+CRF2+mediated+increase+in+circulating+ghrelin+and+glucose+levels+through+distinct+mechanisms+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats.</a> Peptides. 39, 164-170 (2013).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexigenic+response+to+tail+pinch%3A+role+of+brain+NPY%281%29+and+corticotropin+releasing+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).</li>
<li>Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+increases+plasma+levels+of+corticotropin-releasing+hormone+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats.</a> Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).</li>
<li>Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ethylenediamine+tetraacetic+acid+%28EDTA%29+as+in+vitro+anticoagulant+for+diagnostic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes.</a> Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).</li>
<li>Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrally+injected+kisspeptin+reduces+food+intake+by+increasing+meal+intervals+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice.</a> Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).</li>
<li>De Bond, J. A., Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kisspeptin+and+energy+balance+in+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Kisspeptin and energy balance in reproduction.</a> Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).</li>
<li>Wren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+enhances+appetite+and+increases+food+intake+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans.</a> J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992(2001).</li>
<li>Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glucagon+on+food+intake+and+body+weight+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of glucagon on food intake and body weight in man.</a> J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).</li>
<li>Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+glucagon-like+peptide+1+or+peptide+YY+3-36+affects+food+intake+in+healthy+male+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects.</a> Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).</li>
<li>Dewan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+insulin-induced+hypoglycaemia+on+energy+intake+and+food+choice+at+a+subsequent+test+meal%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal.</a> Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).</li>
<li>Schlogl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+24-hour+ad+libitum+food+intake+is+associated+with+lower+plasma+irisin+concentrations+the+following+morning+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Appetite%22%5BJournal%5D)">Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans.</a> Appetite. 90, 154-159 (2015).</li>
<li>Heymsfield, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+leptin+for+weight+loss+in+obese+and+lean+adults%3A+a+randomized%2C+controlled%2C+dose-escalation+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial.</a> JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).</li>
<li>Shimizu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+administration+of+nesfatin-1+reduces+food+intake+in+mice%3A+the+leptin-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism.</a> Endocrinology. 150, 662-671 (2009).</li>
<li>Batterham, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+food+intake+in+obese+subjects+by+peptide+YY3-36%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36.</a> N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).</li>
<li>Shibasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+effect+of+somatostatin+on+corticotropin-releasing+factor-induced+anorexia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat.</a> Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+using+the+optimal+plasticware+and+glassware+in+studies+involving+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides.</a> Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).</li>
<li>Smets, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+plasma+levels+of+metastin+in+early+pregnancy+are+associated+with+small+for+gestational+age+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Prenat+Diagn%22%5BJournal%5D)">Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates.</a> Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).</li>
<li>Kojima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+is+a+growth-hormone-releasing+acylated+peptide+from+stomach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach.</a> Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).</li>
<li>Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((the+Gastric+X%2FA-like+Cell+as+Possible+Dual+Regulator+of+Food+Intake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake.</a> J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).</li>
<li>Inhoff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desacyl+ghrelin+inhibits+the+orexigenic+effect+of+peripherally+injected+ghrelin+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats.</a> Peptides. 29, 2159-2168 (2008).</li>
<li>Hirayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+effects+of+ghrelin+and+des-acyl+ghrelin+on+the+lumbo-sacral+defecation+center+and+regulation+of+colorectal+motility+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats.</a> Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).</li>
<li>Horikoshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+elevation+of+plasma+metastin+concentrations+in+human+pregnancy%3A+metastin+as+a+novel+placenta-derived+hormone+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans.</a> J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).</li>
<li>Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+of+kisspeptin+levels+in+girls+with+idiopathic+central+precocious+puberty+and+its+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance.</a> Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).</li>
<li>Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+and+des-acyl+ghrelin%3A+two+major+forms+of+rat+ghrelin+peptide+in+gastrointestinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue.</a> Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).</li>
<li>Raff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+and+active+ghrelin+in+developing+rats+during+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia.</a> Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).</li>
<li>Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+anticoagulants+and+storage+temperatures+on+stability+of+plasma+and+serum+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones.</a> Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).</li>
<li>Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+degradation+pathway+of+recombinant+human+parathyroid+hormone%3A+deamidation+of+asparaginyl+residue+and+peptide+bond+cleavage+at+aspartyl+and+asparaginyl+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues.</a> Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).</li>
<li>White, A., Handler, P., Smith, E. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+A+%22Principles+of+Biochemistry%22">Principles of Biochemistry</a>. , 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kan işleme HIZLI yöntem sıçanlarda 6 standart kan işleme göre 11/12 peptidler için kurtarma geliştirilmiş bundan önce bildirmiştir. Bu çalışmada, bu yöntem, aynı zamanda, insanlarda kullanım için uygun olduğunu göstermiştir. HIZLI işleme ardından, test 9 125 9-etiketli peptidler için kurtarma standart kan işleme (buz üzerinde EDTA kan) göre geliştirilmiştir. gözlemlenen gelişme, özellikle peptid verimi düşük olduğunda maskelenebilir olabilecek tek ince farklar beklenen koşullar altında ilgili olmas...

Obezitenin 1,2 dünya çapında giderek yaygınlaşması ışığında, gıda alımı düzenleme alanında araştırma önem kazanmaktadır. Şimdiye kadar sadece bir peptit periferik üretilen bilinmektedir ve merkezi geçmiş yıl içinde, gıda alımını, yani ghrelin 3 uyarmak için hareket ederken, peptidler geniş bir yelpazede, örneğin, gıda alımını azalttığı tespit edilmiştir. Leptin, peptid YY (PYY) ve glukagon-benzeri peptit-1 (GLP-1) ve insülin 4 Bu nedenle, açlık ve tokluk peptit seviyelerinin düzenleyici mekanizmaların araştıran çalışmalarda genellikle değerlendirilir, aynı zamanda, kabul edilir çalışılan peptid stabil ve plazma oluşumu sırasında, yüksek verimlerle geri alınacak. Eg önce gösterildiği gibi Ancak, çok sık bu durum hızlı endojen arıza durum böyle değil. ghrelin 5 desasil için asil, parçalanır ghrelin. Bu nedenle, son zamanlarda kan işlenme HIZLI yöntemi tarifR educed sıcaklıkları, bir cidification kullanılarak sıçanlarda şarkı, P dışsal kontrol ve D ilution 6 sotopic inhibisyonu rotease. Bu yöntem, 11 12 peptidlerinin test edilmiş ve (buz üzerinde EDTA kan) standart kan işleme göre doğru dolaşan moleküler biçimde belirlenmesi için izin verilen 6 iyileşme gösterilmektedir. Bu yöntem, kortikotropin salıveren faktör 13 gibi grelin sirküle saptanması için sonraki birçok araştırmada 7-12 kullanılmıştır. Bu nedenle, yöntem, kemirgenlerde peptid araştırma için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Kemirgen çalışmaları başka türden her zaman çevrilebilir değildir Bununla birlikte, yöntem, aynı zamanda, insan kanında kullanım için oluşturulmalıdır. Bu çalışmanın amacı, yaygın 14 ve sık sık u tavsiye edilir standart kan işleme, buz üzerinde EDTA kan ile karşılaştırıldığında insanlarda kan işleme HIZLI yöntemi test etmek olduKlinik yanı sıra araştırma ortamında sed. Son zamanlarda, aşağıdaki işleme (gıda alımı üzerine etkileri Tablo 1&#39;de gösterilmiştir) düzenlenmesi besleme bir rol oynadığı düşünülmektedir oluşturulan peptidler ve yeni aday dahil olmak üzere gıda alımının düzenlenmesi yer 125I-işaretli peptidlerin seçimi kurtarma test Her iki yöntem ile. Hormonlar, farklı uzunluk ve şarj (Tablo 2) peptidleri temsil eden seçilmiştir. Ayrıca, ghrelin için biz standart ve HIZLI metodu izleyerek moleküler formu (ler) araştırıldı. Son olarak, endojen grelin (asil ve desasil grelin) yanı sıra Kisspeptin seviyeleri, aynı zamanda en son HIZLI ya da standart işlem, aşağıdaki yiyecek alımı 15,16 düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir bir peptit değerlendirildi. Buna ek olarak, biz de possib incelemek için (10,2-67,6 kg arasında değişen / m 2) vücut kitle indeksi geniş bir yelpazede konular nüfusu bu peptid seviyeleri incelendiKronik değişmiş vücut ağırlığına bağlı le farklar. <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/53959/53959table1.jpg" /><img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/53959/53959table2.jpg" /> Tanı, Değerlendirme ve Plan: Çalışmaya katılanlar Tüm çalışma katılımcıları yeni Charité-Universitätsmedizin Berlin Psikosomatik Tıp Bölümü (içerme hastaneye yatış iki gün içinde oldu) hastaları hastaneye ve yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. cinsiyet herhangi bir etkisi yalnızca kadın hasta dahil edildi önlemek için. 42 denek toplam Çalışmaya katılan ve üç gruba ayrıldı: normal kilolu (BMI 18,5-25 kg / m2, n = 12), anoreksiya nervoza (VKİ &lt;17.5 kg / m2, n = 15) ve obezite (BMI&gt; 30 kg / m2, n = 15). Anoreksik ve obez hastalar vardıHastalıkların-10 Uluslararası Sınıflandırması göre tanı ve sırasıyla kilo (anoreksiya nervoza) ya da kilo (obezite), hastanede. Tüm normal kilolu hastalar nedeniyle ilgili somatik bozukluklar olmadan somatoform belirtiler münhasıran hastaneye kaldırıldı. Gastrointestinal somatoform belirti veya gastrointestinal cerrahi öyküsü olan hastalar çalışma dışı bırakıldı. Dışlama kriterleri de bir yaş &lt;18 yıl, mevcut gebeliği ve işlenmemiş psikotik hastalıklar kapsıyor. Kan toplama artırmak veya sırasıyla, vücut ağırlığını azaltmak için diyet tedavisi almadan önce hastaneye yat gün sonra 2 veya 3 gerçekleştirildi. Antropometrik parametreler aynı gün değerlendirildi.

<table><tbody><tr><td>Diprotin A</td><td>Peptitler Uluslararası, Louisville, KY, ABD</td><td>IDP-4132</td><td></td></tr><tr><td>E-64-d</td><td>Peptitler Uluslararası, Louisville, KY, ABD</td><td>IED-4321-V</td><td></td></tr><tr><td>Antiağrı</td><td>Peptitleri Uluslararası, Louisville, KY, ABD</td><td>IAP-4062</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Peptitler Uluslararası, Louisville, KY, ABD</td><td>ILP-4041</td><td></td></tr><tr><td>Kimostatin</td><td>Peptides International, Louisville, KY, ABD</td><td>ICY-4063</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C18 kartuşları</td><td>Waters Corporation, Milford, MA, ABD</td><td>WAT051910</td><td>360 mg, 55-105 ve mikro; m</td></tr><tr><td>Açil-ghrelin</td><td>Millipore, Billerica, MA, ABD</td><td>9088-HK</td><td>Radyoaktif</td></tr><tr><td>GLP-1</td><td>Millipore, Billerica, MA, ABD</td><td>9035-HK</td><td>Radyoaktif</td></tr><tr><td>Glukagon</td><td>Millipore, Billerica, MA, ABD</td><td>9030</td><td>Radyoaktif</td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Millipore, Billerica, MA, ABD</td><td>9011S</td><td>Radyoaktif</td></tr><tr><td>Leptin</td><td>Millipore, Billerica, MA, ABD</td><td>9081-HK</td><td>Radyoaktif</td></tr><tr><td>Kisspeptin-10</td><td>Phoenix İlaçları, Burlingame, CA, ABD</td><td>T-048-56</td><td>Radyoaktif</td></tr><tr><td>Nesfatin-1</td><td>Phoenix İlaçları, Burlingame, CA, ABD</td><td>T-003-26</td><td>Radyoaktif</td></tr><tr><td>PYY3-36</td><td>Phoenix İlaçları, Burlingame, CA, ABD</td><td>T-059-02&nbsp;</td><td>radyoaktif</td></tr><tr><td>Somatostatin-28</td><td>Phoenix İlaçları, Burlingame, CA, ABD</td><td>T-060-16&nbsp;</td><td>radyoaktif</td></tr><tr><td>ZORBAX Hızlı Çözünürlük HT SB-C18 sütun</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ABD</td><td>822700-902</td><td>2,1 mm x 50 mm, 1,8 ve mikro; m</td></tr><tr><td>Agilent 1200 LC&nbsp;</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ABD</td><td>HPLC, birkaç bileşen, bu nedenle tek</td>bir <td></td> katalog numarası</tr><tr><td>yok Kisspeptin&nbsp; RIA</td><td>Phoenix İlaç, Burlingame, CA, ABD</td> <td># RK-048-56</td><td>Radyoaktif</td></tr><tr><td>Toplam ghrelin RIA</td><td>Millipore, Billerica, MA, ABD</td> <td># GHRT-89HK ve nbsp;</td><td>radyoaktif</td></tr><tr><td>Aktif ghrelin RIA</td><td>Millipore, Billerica, MA, ABD</td> <td># GHRA-88HK</td><td>Radyoaktif</td></tr><tr><td>SigmaStat 3.1</td><td>Systat Yazılımı, San Jose, CA, ABD</td><td>çevrimiçi indirme</td><td></td></tr></tbody></table>

kan işleme için hızlı bir yöntem insan kanı plazma peptid düzeylerinin veriminin arttırılması için

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

gıda alımı düzenleme alanındaki araştırmalar önem kazanmaktadır. Bu genellikle gıda alımını düzenleyen peptidlerin ölçümü yapılacaktır. Bir peptidin konsantrasyonu, doğru belirlenmesi için, kan işleme sırasında dayanıklı olması gerekir. Bununla birlikte, bu hızla endojen peptidazlar tarafından parçalanan çok peptidler için durum böyle değildir. Son zamanlarda, biz Ar educed sıcaklıkları, Bir cidification kullanan bir kan işleme yöntem geliştirdi, P eksojen kontrolleri ve sıçanlarda kullanmak için D ilution (HIZLI) sotopic, inhibisyon rotease. Burada, insanlarda kullanım için, bu teknik tesis ve kurtarma, moleküler form ve gıda alımı, düzenleyici hormon dolaşımdaki konsantrasyonunu araştırdık. Hızlı yöntem önemli ölçüde 125l-etiketli somatostatin-28 (+% 39), glukagon benzeri peptit-1 (+% 35) için kurtarma, asil ghrelin ve glukagon (+% 32), insülin ve Kisspeptin (+% 29 geliştirilmiş ), nesfatin-1 (+% 28), leptin(+% 21) ve standart işleme (buz üzerinde EDTA kan, p &lt;0.001) peptid YY 3-36 (+% 19). Standart işlemden sonra asil ghrelin% ​​62 olasılıkla desasil ghrelin temsil önceki bir tepe elde bozulmuş ise yüksek performanslı sıvı kromatografisi, hızlı işlenmesi sonra istenen pozisyonda endojen asil grelin elüsyon göstermiştir. Standart işleme (p = 0.03) Aşağıdaki 1:23 ile karşılaştırıldığında 3: HIZLI işlendikten sonra normal kilolu bireylerde kandaki asil / desasil ghrelin oranı 1 oldu. Ayrıca endojen Kisspeptin seviyeleri standart işleme kıyasla, hızlı sonrası daha yüksek (+% 99, p = 0.02). Hızlı kan işleme yöntemi insanlarda kullanılabilir yüksek peptid seviyeleri verir ve doğru moleküler biçiminin değerlendirilmesi için izin verir.

HIZLI kan işleme standart kan işleme göre insan kanında 125 I-radyoetiketli peptidlerin verimini artırır. Standart kan işleme (buz üzerinde EDTA kan) sonra, radyo-etiketli peptidleri ve geri (- K 48-68%, Şekil 1A arasında) 9/9 peptitlerde ~% 60 idi. Hızlı işlem, yani somatostatin-28, 125-etiketli peptidde (+% 39, Şekil 1A) elde geliştirilmiş, glukagon benzeri peptid-1 (+% 35, Şekil 1B), asil ...

Hızlı kan işleme yöntemi, insanlarda kullanılan ve daha yüksek peptit seviyelerini veren ve doğru moleküler biçiminin değerlendirilmesi için sağlar edilebilir. Bu nedenle, bu yöntem peptid araştırmalarında değerli bir araç olacaktır.

Kan işleme için hızlı bir yöntem insan kanı plazma peptid düzeylerinin veriminin arttırılması için

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Bu RAPID yönteminin genel amacı, insan kanında ölçülecek endojen peptit hormonların verimini artırmaktır. RAPID yöntemi yakın zamanda sıçanlarda kullanım için geliştirilmiştir ve insan kanında kullanım için de uygundur. RAPID yöntemi verimi artırır ve endojen peptidin doğru moleküler formunun tespit edilmesine olanak tanır.RAPID yöntemi kullanımı kolaydır. Ancak, RAPID yöntemi standart kan örneklemesine kıyasla daha fazla zaman almakta ve daha maliyetli olmaktadır. Bu nedenle, araştırma ortamlarında daha uygulanabilir olabilir.Örneklerin zamanında seyreltilmesi ve elüsyonun, uygun peptid düzeyinin sağlanması açısından büyük önem taşıması nedeniyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir. Gece boyu süren bir açlığın ardından, standart bir zamanda bir ön kol veninden venöz kan toplayın. Ve standart prosedürlere veya RAPID yöntemine göre işlem yapın.Deneklere kan alma işleminden önce egzersiz yapmamaları ve sigara içmemeleri konusunda talimat verin. Standart işlem için, kanı soğutulmuş EDTA içeren tüplere toplayın ve 10 dakika içinde 4 °C'de 3000 Gs hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın ve radyoimmünassay ile daha ileri işleme kadar -80 °C'de saklayın.RAPID işlemleme için, kanı hemen buz gibi soğuk RAPID tamponu ile 1:10 oranında seyreltin. pH 3,6 olan bu tampon, 0,1 molar amonyum asetat, 0,5 molar sodyum klorür ve enzim inhibitörleri içerir.10 dakika içinde, RAPID örneğini 4 °C'de 3000 Gs ile 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve bir pipet kullanarak süpernatantı toplayın. Ardından, kromatografi kartuşlarını dakikada 10 mililitre hızla %100 asetonitril ile doldurun. Bunu, %0,1 trifloroasetik asit veya TFA ile dengeleme işleminin ardından gerçekleştirin.Bir şırınga pompası kullanarak, RAPID örnek süpernatanını dakikada bir mililitre sabit hızda yükleyin. Kartuşları, dakikada 10 mililitre hızla üç mililitre %0,1 TFA ile yıkadıktan sonra, RAPID örneğini, dakikada iki mililitre hızla, %0,1 TFA içeren iki mililitre %70 asetnitril ile yavaşça elüe edin. Elüye edilen örnekleri vakumlu santrifüj ile kurutun ve radyoimmünoyasla daha fazla işlem yapılana kadar eksi 80 derece Celsius'ta saklayın.İyot-125 radyoaktif olarak işaretlenmiş insan peptidlerini temin edin. Deneye kadar peptidleri toz formunda saklayın. Ardından, %0,1 asetik asit içerisinde taze olarak seyreltin.Standart işlem için, kan alımının hemen ardından, soğutulmuş EDTA içeren tüplere, 3000 ila 6000 CPM içeren 50 mikrolitre radyolabelli bir tüpe bir mililitre kan aktarın. RAPID işlem için, bir mililitre EDTA içeren kanı dokuz mililitre RAPID tamponu içeren bir tüpe aktarın ve 30.000 ila 60.000 CPM içeren 500 mikrolitre radyolabel kullanın. 1'e 10 dilüsyon nedeniyle, RAPID işlem için 10 kat daha yüksek hacimde radyolabel kullanın.RAPID yönteminin farklı adımları uygulandıktan hemen sonra, radyoaktif olarak işaretlenmiş peptidlerin geri kazanımını bir gama sayacı kullanarak değerlendirin. Örnekları vakumlu santrifüjasyon ile kurutmayın ve eksi 80 derece Celsius'ta saklamayın. Ölçüm için süpernatantı gama sayacına uygun tüplere aktarın.Ve dakika başına sayımları değerlendirin. Standart örneklerde süpernatantın tamamını ölçün. RAPID örneklerinde, kullanılan radyolabel miktarının karşılaştırılabilir olması için toplam hacmin onda birini analiz edin.%100 standart olarak, işleme tabi tutulmayan 50 µL iyot 125 radyoetiketli peptit içeren iki örnek kullanın. Tüm örneklerin radyoaktivitesini aynı anda ölçün. Kanı, soğutulmuş EDTA içeren tüplere çekin ve standart işlem için 15.000 ile 20.000 CPM içeren 200 µL radyoetiketli açil grelin tutan tüplere bir mililitre aktarın.RAPID işlemleme için, bir mililitre kanı dokuz mililitre hızlı tampon ve 15.000 ile 20.000 CPM içeren 200 mikrolitre radyolojik olarak işaretlenmiş asil ghrelin bulunan bir tüpe aktarın. Ardından, örnekleri daha önce olduğu gibi işlemleyin. Ters faz HPLC ile yapılacak ileri analizler için, örnekleri doğrudan 0.1% TFA ile desteklenmiş suda %17 asetonitril ile dengelenmiş bir stable bond C18 kolonuna yükleyin.Beş dakikalık dengeleme sonrası, örneği 40 dakikada, dakikada bir mililitre akış hızıyla elüe etmek için %17 ile %40 arasında bir asetonitril gradyanı kullanın. Her dakika bir mililitrelik fraksiyonlar toplayın ve radyoaktiviteyi bir gama sayıcı kullanarak analiz edin. Ayrı bir deneyde, 15.000 ile 20.000 CPM içeren radyolojik olarak işaretlenmiş açlık ghrelin'inden 200 mikrolitreyi doğrudan kolona yükleyin ve HPLC işlemini daha önce yapıldığı gibi gerçekleştirin.Radyoimmün analiz için, dondurulmuş süpernatantları ve vakumla kurutulmuş tozları oda sıcaklığında çözdürün. Radyoimmün analizden hemen önce, kurutulmuş RAPID örneklerini plazmanın orijinal hacmine uygun olarak çift distile su içerisinde yeniden süspanse edin. Kisspeptin ve total ghrelin ile asil ghrelin düzeylerini, üretici protokollerine uygun olarak ticari radyoimmün analiz kitlerini kullanarak değerlendirin.Stabil pellet oluşumuna izin veren borosilikat tüpler kullanın. Birinci gün, örnekleri assay tamponu ve birincil antikör ile üretici tarafından belirtilen dilüsyonda 24 saat boyunca inkübe edin. İkinci gün, iyot 125 izleyicisini ekleyin, vorteksleyin ve 24 saat boyunca inkübe edin.Üçüncü günde, çöktürme reaktifini ekleyin, vorteksleyin ve üreticinin önerdiği şekilde inkübe edin. Ardından, tüpleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 3,000 G'de santrifüjleyin. Süpernatantları uzaklaştırın ve bir gama sayıcı kullanarak peletlerdeki radyoaktiviteyi sayın.Toplam ghrelin değerinden asil ghrelin değerini çıkararak desasil ghrelin miktarını hesaplayın. Her bir bireysel örnek için asil ghrelini desasil ghrelinine bölerek asil/desasil ghrelin oranını belirleyin. Analizler arası değişkenliği önlemek için mümkünse tüm örnekleri tek bir grup halinde işleyin.RAPID kan işleme yöntemi, standart kan işlemesine kıyasla insan kanındaki iyot 125 radyoetiketli peptidlerin verimini artırır. Standart kan işleminden sonra, dokuz peptidde radyoetiketli peptidlerin geri kazanımı %48 ile %68 arasında değişmiştir. RAPID işlemlemesi, iyot 125 etiketli tüm peptidlerde verimi artırarak geri kazanımı %71 ile %98 arasına çıkarmıştır. Burada, standart veya RAPID kan işleminden sonra insan kanındaki iyot 125 etiketli açil ghrelinin elüsyon profili gösterilmektedir.RAPID işleminin ardından, iyot 125 ile işaretlenmiş ghrelin beklenen konumda elüe oldu. Standart prosedür uygulandığında ise daha erken bir pik gözlemlendi. Bunun muhtemelen desasil ghrelin ile ilişkili olduğu düşünülmektedir.Bu durum, peptidin %62 oranında yıkımını temsil etmiştir. RAPID kan işleme yöntemi, standart işlemeye kıyasla açil ve desaçil grelin oranını iyileştirir. RAPID işlem sonrası, normal kilodaki deneklerin kanındaki açil ve desaçil grelin oranı birden üçe kadar çıkmıştır.Standart kan işleme sonrası 1 ila 23 ile karşılaştırıldığında. Benzer sonuçlar anorektik ve obez koşullar altında gözlemlenmiştir. RAPID kan işleme, standart işlemeye kıyasla endojen kisspeptin kan seviyelerinde artışla sonuçlanır.Hem anoreksik hem de normal kilodaki deneklerde, dolaşımdaki endojen kisspeptin seviyeleri, standart işleme kıyasla RAPID sonrası anlamlı derecede daha yüksek bulunmuştur. Fark, obezite koşulları altında anlamlılık düzeyine ulaşmamıştır. Uzmanlaşıldığında ve uygun şekilde uygulandığında, bu teknik bir saatten kısa sürede tamamlanabilir.Bu yöntem, özellikle peptidin beklenen konsantrasyonu düşük olduğunda veya gruplar arasındaki farklar küçük olduğunda önem taşır. Peptitler için genel bir tavsiye verilemez. Her bir peptit için potansiyel fayda, başlangıçta bir kez test edilmelidir.Bu teknik, farklı alanlardaki araştırmacıların endojen peptid hormonların verimini ve daha da önemlisi, doğru moleküler formunu keşfetmelerinin yolunu açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, insanlarda kan işleme için RAPID yönteminin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-rapid-method-for-blood-processing-to-increase-yield-plasma-peptide

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

İnsan trombosit lizat, büyüme faktörleri ve hücre kültüründe güçlü bir ek zengin bir kaynak. Bu protokol, zengin plazma, trombosit başlayarak, çeşitli donma-çözülme döngüsünden performans ve trombosit parçaları tüketen insan trombosit lizat büyük bir havuz hazırlama süreci sunar.

Hayvan Serum Ücretsiz İnsan Kök Hücre Kültürleri Verimli Ek olarak Pooled İnsan Trombosit Lizat (pHPL) hazırlanması

Bu plazma / seroloji alınan tam kandan genomik DNA'nın izole edilmesi için yeni bir yöntem tarif edilmektedir. Plazma toplama sonra, sıkıştırılmış kan genellikle atılır. Bizim yeni bir yöntem mevcut yöntemlere göre önemli bir gelişme gösteren ve ek kan almadan, DNA ve tek bir koleksiyon edinilebilir plazma yapar.

Plazma Protein Koruma Kan Alma Kitleri Genomik DNA Ayıklama Pratik ve Yeni Bir Yöntem

Bu video, trombosit sayımı taraması, kanın toplanması ve santrifüjlenmesi ve trombositlerin izole edilmesi yoluyla yüksek kaliteli Trombositten Zengin Plazmanın (PRP) hazırlanmasını göstermektedir. Bu PRP, doku yenilenmesi ve iyileşmesi için terapötik uygulamalarda kullanılır.

İnsan Periferik Kanından Trombositten Zengin Plazma Hazırlanması

Daha fazla analiz için çeşitli bileşenler elde etmek üzere tam kanın işlenmesi için bir metodolojinin ana hatlarını çiziyoruz. Klinik olmayan bir ortamda tam kan örneklerinin hızlı, yüksek verimli eş zamanlı işlenmesini sağlayan kolaylaştırılmış bir protokolü optimize ettik.

Topluluk tabanlı Ayar Elde Edilen Örneklerin hızlı Fraksiyonlama ve Tam Kan Bileşenlerinin İzolasyonu

Burada, kütle spektrometresi tabanlı kantitatif proteomik analiz için otomatik plazma protein sindirim yöntemi salıyoruz. Bu protokolde protein denatürasyonu, redüksiyon, alkillenme ve tripsin sindirim reaksiyonları için sıvı transfer ve kuluçka adımları düzene sokulmuş ve otomatikhale getirilir. İstenilen hassasiyetle 96 kuyulu bir plaka hazırlamak yaklaşık beş saat sürer.

Otomatik İş İstasyonu Kullanarak Kütle Spektrometresi Için Plazma Numune Spektrometresi Hazırlığı

Bu protokol, çevirisel biyobelirteç analizi için kullanılabilecek klinik çalışma alanında yüksek kaliteli PBMC ve plazma biyosampllerinin klinik olarak uygulanabilir hazırlanmasını detaylandırır.

Biyobelirteç Analizi için Klinik Çalışma Alanlarında Tek Bir Kan Çekiminden Periferik Kan Mononükleer Hücre Peletleri ve Plazma Hazırlanması

Bu protokol, %100 otolog fibroblast kültür sisteminde hücrelerin in vitro genişlemesini artırmak için PRP üreten bir cihaz sunar.

In Vitro İnsan Fibroblast Genişlemesini Artırmak için Otolog Trombosit Bakımından Zengin Plazma Üretimi

Trombositten zengin plazma (PRP), at kas-iskelet sistemi rahatsızlıklarının tedavisinde kullanılır. Farklı teknikler, değişen trombosit ve lökosit konsantrasyonları ile PRP verir. Bu makale, at kanından PRP elde etmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

At Kanından Trombositten Zengin Plazma Elde Etmek için Basit Bir Çift Santrifüj Tüpü Yöntemi

Düşük yoğunluklu nötrofiller (LDN) birçok hastalıkta önemli ölçüde artar. LDN genellikle hücre sıralaması yoluyla izole edilir. Saf ve canlı LDN elde etmek için pratik bir yöntem sunuyoruz. Periferik kanın yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesinden sonra, hücreler manyetik mikro boncuklarla inkübe edilir ve daha sonra LDN, manyetik kolonlar aracılığıyla ayrılır.

Düşük Yoğunluklu Nötrofillerin Verimli Saflaştırılması için Hızlı Manyetik-mikro Boncuk Yöntemi

Kendi arıtma genellikle gerekli bağışıklık hücre popülasyonlarının fonksiyonunu etkili bir şekilde incelenmesi. Kompleman tükenmesi, izolasyonu için yüksek saflıkta bağışıklık hücre popülasyonlarının hızlı ve ucuz bir tekniktir.

Kompleman tükenmesi Özel Hücre Populasyonlarının tükenmesi

Öğrenin, insan kanında endojen peptid hormon verimini artırmak için RAPID kan işleme yöntemini. Bu teknik, doğru moleküler form tespiti sağlayarak peptid araştırmalarında değerli bir araçtır.

Kan işleme için hızlı bir yöntem insan kanı plazma peptid düzeylerinin veriminin arttırılması için

Daha fazla video keşfet