Kan işleme için hızlı bir yöntem insan kanı plazma peptid düzeylerinin veriminin arttırılması için

Bu RAPID yönteminin genel amacı, insan kanında ölçülecek endojen peptit hormonların verimini artırmaktır. RAPID yöntemi yakın zamanda sıçanlarda kullanım için geliştirilmiştir ve insan kanında kullanım için de uygundur. RAPID yöntemi verimi artırır ve endojen peptidin doğru moleküler formunun tespit edilmesine olanak tanır.

RAPID yöntemi kullanımı kolaydır. Ancak, RAPID yöntemi standart kan örneklemesine kıyasla daha fazla zaman almakta ve daha maliyetli olmaktadır. Bu nedenle, araştırma ortamlarında daha uygulanabilir olabilir.

Örneklerin zamanında seyreltilmesi ve elüsyonun, uygun peptid düzeyinin sağlanması açısından büyük önem taşıması nedeniyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir. Gece boyu süren bir açlığın ardından, standart bir zamanda bir ön kol veninden venöz kan toplayın. Ve standart prosedürlere veya RAPID yöntemine göre işlem yapın.

Deneklere kan alma işleminden önce egzersiz yapmamaları ve sigara içmemeleri konusunda talimat verin. Standart işlem için, kanı soğutulmuş EDTA içeren tüplere toplayın ve 10 dakika içinde 4 °C'de 3000 Gs hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın ve radyoimmünassay ile daha ileri işleme kadar -80 °C'de saklayın.

RAPID işlemleme için, kanı hemen buz gibi soğuk RAPID tamponu ile 1:10 oranında seyreltin. pH 3,6 olan bu tampon, 0,1 molar amonyum asetat, 0,5 molar sodyum klorür ve enzim inhibitörleri içerir.

10 dakika içinde, RAPID örneğini 4 °C'de 3000 Gs ile 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve bir pipet kullanarak süpernatantı toplayın. Ardından, kromatografi kartuşlarını dakikada 10 mililitre hızla %100 asetonitril ile doldurun. Bunu, %0,1 trifloroasetik asit veya TFA ile dengeleme işleminin ardından gerçekleştirin.

Bir şırınga pompası kullanarak, RAPID örnek süpernatanını dakikada bir mililitre sabit hızda yükleyin. Kartuşları, dakikada 10 mililitre hızla üç mililitre %0,1 TFA ile yıkadıktan sonra, RAPID örneğini, dakikada iki mililitre hızla, %0,1 TFA içeren iki mililitre %70 asetnitril ile yavaşça elüe edin. Elüye edilen örnekleri vakumlu santrifüj ile kurutun ve radyoimmünoyasla daha fazla işlem yapılana kadar eksi 80 derece Celsius'ta saklayın.

İyot-125 radyoaktif olarak işaretlenmiş insan peptidlerini temin edin. Deneye kadar peptidleri toz formunda saklayın. Ardından, %0,1 asetik asit içerisinde taze olarak seyreltin.

Standart işlem için, kan alımının hemen ardından, soğutulmuş EDTA içeren tüplere, 3000 ila 6000 CPM içeren 50 mikrolitre radyolabelli bir tüpe bir mililitre kan aktarın. RAPID işlem için, bir mililitre EDTA içeren kanı dokuz mililitre RAPID tamponu içeren bir tüpe aktarın ve 30.000 ila 60.000 CPM içeren 500 mikrolitre radyolabel kullanın. 1'e 10 dilüsyon nedeniyle, RAPID işlem için 10 kat daha yüksek hacimde radyolabel kullanın.

RAPID yönteminin farklı adımları uygulandıktan hemen sonra, radyoaktif olarak işaretlenmiş peptidlerin geri kazanımını bir gama sayacı kullanarak değerlendirin. Örnekları vakumlu santrifüjasyon ile kurutmayın ve eksi 80 derece Celsius'ta saklamayın. Ölçüm için süpernatantı gama sayacına uygun tüplere aktarın.

Ve dakika başına sayımları değerlendirin. Standart örneklerde süpernatantın tamamını ölçün. RAPID örneklerinde, kullanılan radyolabel miktarının karşılaştırılabilir olması için toplam hacmin onda birini analiz edin.

%100 standart olarak, işleme tabi tutulmayan 50 µL iyot 125 radyoetiketli peptit içeren iki örnek kullanın. Tüm örneklerin radyoaktivitesini aynı anda ölçün. Kanı, soğutulmuş EDTA içeren tüplere çekin ve standart işlem için 15.000 ile 20.000 CPM içeren 200 µL radyoetiketli açil grelin tutan tüplere bir mililitre aktarın.

RAPID işlemleme için, bir mililitre kanı dokuz mililitre hızlı tampon ve 15.000 ile 20.000 CPM içeren 200 mikrolitre radyolojik olarak işaretlenmiş asil ghrelin bulunan bir tüpe aktarın. Ardından, örnekleri daha önce olduğu gibi işlemleyin. Ters faz HPLC ile yapılacak ileri analizler için, örnekleri doğrudan 0.1% TFA ile desteklenmiş suda %17 asetonitril ile dengelenmiş bir stable bond C18 kolonuna yükleyin.

Beş dakikalık dengeleme sonrası, örneği 40 dakikada, dakikada bir mililitre akış hızıyla elüe etmek için %17 ile %40 arasında bir asetonitril gradyanı kullanın. Her dakika bir mililitrelik fraksiyonlar toplayın ve radyoaktiviteyi bir gama sayıcı kullanarak analiz edin. Ayrı bir deneyde, 15.000 ile 20.000 CPM içeren radyolojik olarak işaretlenmiş açlık ghrelin'inden 200 mikrolitreyi doğrudan kolona yükleyin ve HPLC işlemini daha önce yapıldığı gibi gerçekleştirin.

Radyoimmün analiz için, dondurulmuş süpernatantları ve vakumla kurutulmuş tozları oda sıcaklığında çözdürün. Radyoimmün analizden hemen önce, kurutulmuş RAPID örneklerini plazmanın orijinal hacmine uygun olarak çift distile su içerisinde yeniden süspanse edin. Kisspeptin ve total ghrelin ile asil ghrelin düzeylerini, üretici protokollerine uygun olarak ticari radyoimmün analiz kitlerini kullanarak değerlendirin.

Stabil pellet oluşumuna izin veren borosilikat tüpler kullanın. Birinci gün, örnekleri assay tamponu ve birincil antikör ile üretici tarafından belirtilen dilüsyonda 24 saat boyunca inkübe edin. İkinci gün, iyot 125 izleyicisini ekleyin, vorteksleyin ve 24 saat boyunca inkübe edin.

Üçüncü günde, çöktürme reaktifini ekleyin, vorteksleyin ve üreticinin önerdiği şekilde inkübe edin. Ardından, tüpleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 3,000 G'de santrifüjleyin. Süpernatantları uzaklaştırın ve bir gama sayıcı kullanarak peletlerdeki radyoaktiviteyi sayın.

Toplam ghrelin değerinden asil ghrelin değerini çıkararak desasil ghrelin miktarını hesaplayın. Her bir bireysel örnek için asil ghrelini desasil ghrelinine bölerek asil/desasil ghrelin oranını belirleyin. Analizler arası değişkenliği önlemek için mümkünse tüm örnekleri tek bir grup halinde işleyin.

RAPID kan işleme yöntemi, standart kan işlemesine kıyasla insan kanındaki iyot 125 radyoetiketli peptidlerin verimini artırır. Standart kan işleminden sonra, dokuz peptidde radyoetiketli peptidlerin geri kazanımı %48 ile %68 arasında değişmiştir. RAPID işlemlemesi, iyot 125 etiketli tüm peptidlerde verimi artırarak geri kazanımı %71 ile %98 arasına çıkarmıştır. Burada, standart veya RAPID kan işleminden sonra insan kanındaki iyot 125 etiketli açil ghrelinin elüsyon profili gösterilmektedir.

RAPID işleminin ardından, iyot 125 ile işaretlenmiş ghrelin beklenen konumda elüe oldu. Standart prosedür uygulandığında ise daha erken bir pik gözlemlendi. Bunun muhtemelen desasil ghrelin ile ilişkili olduğu düşünülmektedir.

Bu durum, peptidin %62 oranında yıkımını temsil etmiştir. RAPID kan işleme yöntemi, standart işlemeye kıyasla açil ve desaçil grelin oranını iyileştirir. RAPID işlem sonrası, normal kilodaki deneklerin kanındaki açil ve desaçil grelin oranı birden üçe kadar çıkmıştır.

Standart kan işleme sonrası 1 ila 23 ile karşılaştırıldığında. Benzer sonuçlar anorektik ve obez koşullar altında gözlemlenmiştir. RAPID kan işleme, standart işlemeye kıyasla endojen kisspeptin kan seviyelerinde artışla sonuçlanır.

Hem anoreksik hem de normal kilodaki deneklerde, dolaşımdaki endojen kisspeptin seviyeleri, standart işleme kıyasla RAPID sonrası anlamlı derecede daha yüksek bulunmuştur. Fark, obezite koşulları altında anlamlılık düzeyine ulaşmamıştır. Uzmanlaşıldığında ve uygun şekilde uygulandığında, bu teknik bir saatten kısa sürede tamamlanabilir.

Bu yöntem, özellikle peptidin beklenen konsantrasyonu düşük olduğunda veya gruplar arasındaki farklar küçük olduğunda önem taşır. Peptitler için genel bir tavsiye verilemez. Her bir peptit için potansiyel fayda, başlangıçta bir kez test edilmelidir.

Bu teknik, farklı alanlardaki araştırmacıların endojen peptid hormonların verimini ve daha da önemlisi, doğru moleküler formunu keşfetmelerinin yolunu açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, insanlarda kan işleme için RAPID yönteminin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.