Kan işleme için hızlı bir yöntem insan kanı plazma peptid düzeylerinin veriminin arttırılması için

Bu RAPID yönteminin genel amacı, insan kanında ölçülecek endojen peptit hormonlarının verimini artırmaktır. RAPID yöntemi yakın zamanda sıçanlarda kullanım için kurulmuştur ve aynı zamanda insan kanında kullanım için de uygundur. RAPID yöntemi verimi artırır ve endojen peptidin doğru moleküler formunun tespit edilmesini sağlar.

RAPID yönteminin kullanımı kolaydır. Bununla birlikte, RAPID yöntemi standart kan örneklemesine kıyasla daha fazla zaman alıcı ve daha pahalıdır. Bu yüzden araştırma ortamında daha uygulanabilir olabilir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü numunelerin zamanında seyreltilmesi ve uygun bir peptit seviyesinin sağlanması için büyük önem taşıyan elüsyon önemlidir. Bir önkol damarından gece boyunca oruç tuttuktan sonra standart bir zamanda venöz kan toplayın. Ve standart prosedürlere veya RAPID yöntemine göre işleyin.

Kan almadan önce deneklere egzersiz yapmamalarını veya sigara içmemelerini söyleyin. Standart işleme için, soğutulmuş EDTA içeren tüplerde kan toplayın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 3000 Gs'de 10 dakika içinde santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve radyoimmunoassay ile daha fazla işlenene kadar eksi 80 santigrat derece tutun.

HIZLI işleme için, kanı hemen buz gibi soğuk RAPID tamponunda bir ila 10 arasında seyreltin. PH üç nokta altı, sıfır nokta bir molar amoniumasitat içerir. Sıfır noktası beş molar sodyum klorür ve enzim inhibitörleri.

10 dakika içinde, RAPID numunesini 3000 Gs'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve bir pipet kullanarak süpernatanı toplayın. Ardından, kromatografi kartuşlarını dakikada 10 mililitrede% 100 aktitonitril ile şarj edin. % 0.1 trifloroasetik veya TFA ile dengelemeyi takiben.

Bir şırınga pompası kullanarak dakikada bir mililitre sabit hızında RAPID numune süpernatanı ile yükleyin. Kartuşları dakikada 10 mililitrede üç mililitre %0,1 TFA ile yıkadıktan sonra, RAPID numunesini dakikada iki mililitrede %0,1 TFA içeren iki mililitre %70 asetonitril ile yavaşça boşaltın. Ayrıştırılan numuneleri vakumlu santrifüjleme kullanarak kurutun ve radyoimmünoassay ile daha fazla işlenene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

İyot 125 radyo etiketli insan peptitleri elde edin. Peptitleri deneye kadar toz halinde tutun. Daha sonra% 0.1 asetik asit ile taze seyreltin.

Standart işleme için, kan alındıktan hemen sonra, soğutulmuş EDTA içeren tüplere, 3000 ila 6000 CPM içeren 50 mikrolitre radyoaktif işaretli bir tüpte bir mililitre kan aktarın. HIZLI işleme için, bir mililitre EDTA içeren kanı dokuz mililitre RAPID tamponu tutan bir tüpe aktarın ve 500 mikrolitre radyo-etiket 30.000 ila 60.000 CPM içerir. Bir ila 10 seyreltme nedeniyle, HIZLI işleme için 10 kat daha yüksek hacimli bir radyolabel kullanın.

RAPID yönteminin farklı adımlarını uyguladıktan hemen sonra, bir gama sayacı kullanarak radyoaktif olarak işaretlenmiş peptitlerin geri kazanımını değerlendirin. Numuneleri vakumlu santrifüjleme ile kurutmayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ölçüm için, süpernatanı gama sayacına uyan tüplere aktarın.

Ve dakika başına sayıları değerlendirin. Standart numunelerde tüm süpernatanı ölçün. RAPID numunelerinde, kullanılan karşılaştırılabilir miktarda radyo-etiket elde etmek için toplam hacmin onda birini analiz edin.

% 100 standart olarak, işleme tabi tutulmayan 50 mikrolitre iyot 125 radyoaktif işaretli peptit içeren iki numune kullanın. Tüm numunelerin radyoaktivitesini aynı anda ölçün. Soğutulmuş EDTA içeren tüplerde kanı çekin ve standart işleme için 15.000 ila 20.000 CPM içeren 200 mikrolitre radyoaktif işaretli asil ghrelin içeren tüplere bir mililitre aktarın.

HIZLI işleme için, bir mililitre kanı, dokuz mililitre hızlı tampon ve 15.000 ila 20.000 CPM içeren 200 mikrolitre radyoaktif işaretli asil ghrelin içeren bir tüpe aktarın. Daha sonra, numuneleri daha önce olduğu gibi işleyin. Ters fazlı HPLC ile daha fazla analiz için, numuneleri doğrudan% 0.1 TFA ile desteklenmiş suda% 17 asetonitril içinde dengelenmiş, stabil bir bağ C18 kolonuna yükleyin.

Beş dakikalık dengelemeden sonra, numuneyi dakikada bir mililitre hızla 40 dakika içinde çıkarmak için %17 ila %40 asetonitril arasında bir gradyan kullanın. Her dakika bir mililitrelik kesirler toplayın ve bir gama sayacı kullanarak radyoaktiviteyi analiz edin. Ayrı bir deneyde, 15.000 ila 20.000 CPM içeren 200 mikrolitre radyoaktif işaretli asil ghrelin doğrudan kolona yükleyin ve daha önce olduğu gibi HPLC gerçekleştirin.

Radyoimmünoassay için, donmuş süpernatanları çözün ve oda sıcaklığında vakumla kurutulmuş tozu çözün. Radyoimmünoassayden hemen önce, orijinal plazma hacmine göre kuru RAPID numunelerini çift damıtılmış suda yeniden askıya alın. Üreticinin protokollerine göre ticari radyoimmünoassay kullanarak kisspeptin ve toplam ghrelin ile asil ghrelini değerlendirin.

Kararlı palet oluşumuna izin veren borosilikat tüpler kullanın. Birinci gün, numuneleri, üretici tarafından sağlanan seyreltmede 24 saatlik bir süre boyunca tahlil tamponu ve birincil alikor ile inkübe edin. İkinci günde, iyot 125 izleyiciyi, girdabı ekleyin ve 24 saatlik bir süre boyunca inkübe edin.

Üçüncü günde, algılayıcı reaktifi, girdabı ekleyin ve üretici tarafından önerildiği şekilde inkübe edin. Daha sonra, tüpleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 3.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanları çıkarın ve bir gama sayacı kullanarak paletlerdeki radyoaktiviteyi sayın.

Desakil ghrelini, toplam ghrelin eksi asil ghrelin farkı olarak hesaplayın. Her bir numune için asil'i desakil grelinle dalarak asil, desakil grelin oranını değerlendirir. Mümkünse, tahliller arası değişkenliği önlemek için tüm numuneleri tek bir partide işleyin.

HIZLI kan işleme, standart kan işlemeye kıyasla insan kanındaki iyot 125 radyoaktif işaretli peptitlerin verimini artırır. Standart kan işleminden sonra, radyoaktif işaretli peptitlerin geri kazanımı, dokuz peptitte% 48 ila% 68 arasında değişmektedir. HIZLI işleme,% 71 ila% 98 arasında değişen bir geri kazanım ile tüm iyot 125 etiketli peptitlerde verimi artırdı Burada, standart veya HIZLI kan işlemeyi takiben insan kanındaki iyot 125 etiketli asil grelin'in elüsyon profili gösterilmektedir.

HIZLI işlemeden sonra, iyot 125 etiketli ghrelin beklenen pozisyonda kaçtı. Standart prosedürden sonra, daha erken bir tepe gözlendi. Muhtemelen desakil ghrelin'e karşılık gelir.

Bu, peptitin %62'lik bir bozunmasını temsil ediyordu. HIZLI kan işleme, standart işlemeye kıyasla asil, desakil grelin oranını iyileştirir. HIZLI işlemden sonra, normal kilolu deneklerin kanındaki asil, desakil ghrelin oranı bir ila üç idi.

Standart kan işlemeyi takiben bir ila 23 ile karşılaştırıldığında. Anoreksik ve obez koşullar altında da benzer sonuçlar gözlendi. HIZLI kan işleme, standart işlemeye kıyasla endojen kisspeptin kan seviyelerinin artmasına neden olur.

Hem anoreksik hem de normal kilolu kişilerde, dolaşımdaki endojen kisspeptin seviyeleri, standart işlemeye kıyasla RAPID'i takiben anlamlı derecede yüksekti. Fark, obezite koşulları altında anlamlılığa ulaşmadı. Bir kez ustalaştıktan ve düzgün bir şekilde uygulandıktan sonra, bu teknik bir saatten daha kısa sürede yapılabilir.

Bu yöntem, peptidin beklenen konsantrasyonu düşük olduğunda veya gruplar arasındaki farklar küçük olduğunda özellikle önemlidir. Peptitler için genel bir öneri verilemez. Her peptit için potansiyel fayda başlangıçta bir kez test edilmelidir.

Bu teknik, farklı alanlardaki araştırmacıların endojen peptit hormonlarının verimini ve daha da önemlisi doğru moleküler formunu keşfetmelerinin yolunu açıyor. Bu videoyu izledikten sonra, insanlarda kan işleme için RAPID yönteminin nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.