Glycan Düğüm Analizi: Glikomik A Aşağıdan yukarı Yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, monosakkarit bileşimini ve bağlantı bilgilerini korurken biyolojik bir numunedeki tüm glikanları parçalamaktır. Hasta silindirikleşmesi ve N-Asetilglukozaminin tek analitik sinyallere bölünmesi gibi ilginç glikan özelliklerinin damıtılmasının kolaylaştırılması. Bu yöntem, belirli hastalık durumlarında hangi benzersiz glikan özelliklerinin değiştirildiği gibi glikomitler alanındaki temel soruları doğrudan yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, beta 1-6 dallanması ve korfulkozatasyon gibi hastalıkta değişme eğiliminde olan glikan özelliklerinin, birden fazla sağlam glikana yayılmak yerine tek analitik sinyallere damıtılmasıdır. Genel olarak, bireylerin bu yöntemi yapması gerekir, taze permetillenmiş glikanların yanlış işlenmesi nedeniyle zayıf N-Asetilsisteinlerle gerçekten mücadele eder. Önce her bir biyolojik analitin dokuz mikro litresini ayrı 1,5 mililitrelik test tüplerine aktararak numuneleri hazırlayın.

Her numuneye bir mikro litre deiyonize su ve 270 mikro litre yüksek saflıkta DMSO ekleyin. Ve onları girdaplayarak kuvvetlice karıştırın. Numune hazırlandıktan sonra, sodyum hidroksit yüklü spin kolonlarını metin protokolünde açıklandığı gibi birleştirin.

Analitik şırınga kullanarak, her analite 105 mikro litre iyodometan ekleyin ve hemen tüpleri kapatın. Numuneleri iyice girdaplayın. Önceden hazırlanmış spin kolonlarının fişini çekin ve 2.400 Gs'de 15 saniye boyunca santrifüjleyin.Rezervuar tüplerini ve varlıklıları attıktan sonra, kolonları yeniden takın ve her analit için etiketlenmiş yeni bir tüp setinin içine yerleştirin.

Her bir analit çözeltisini karşılık gelen döndürme kolonuna aktarmak için 1000 mikro litrelik bir boru kafası kullanın. Analit çözeltisi eklendikten sonra, 200 mikro litrelik bir boru kafası ucunun ucundan yaklaşık iki mililitre kıvırın ve karıştırıcı olarak kullanmak için ucu sütunda bırakın. Sütunları iki ila üç dakikada bir hafifçe karıştırmak için boru kafası uçlarını kullanın.

11 dakika sonra, sütunları fişten çekin ve 2.400 Gs'de 15 saniye boyunca santrifüjleyin.Döndürme sütunlarını hemen çıkarın ve yeni rezervuar tüplerine yerleştirin, akış solüsyonunu koruyun, ancak tapaları atın. Sütunlara 300 mikro litre asetonenitril ekleyin ve bunları 9.600 Gs'de 30 saniye santrifüjleyin.Şimdi ilk permetillenmiş akış çözeltilerini 3.5 mililitre sodyum fosfat tamponu içeren silanize cam test tüplerine aktarın. Aktarılan süpernanedin şeffaf olduğundan ve hiçbir katı maddenin aktarılmadığından emin olun.

Plastik tüplerin dibinde küçük beyaz bir pelet oluşmuş olacaktır. Belirgin herhangi bir katı malzemeyi aktarmaktan kaçının. Bunun yapılmaması, N-Asetilsistein-glukozamin glikan notalarının düşük verimine neden olacaktır.

Tüm numuneler aktarıldıktan sonra partideki her numuneyi hemen vorteksleyin. Daha sonra asetonnitril akış solüsyonlarını ilgili test tüplerindeki sıvının geri kalanıyla birleştirin. Yine, bu adım sırasında herhangi bir katı, beyaz kalıntıyı aktarmaktan kaçının.

Bir sonraki numuneye geçmeden önce birleştirilmiş çözeltileri hemen kapatın, çalkalayın ve girdaplayın. Permetilasyondan sonra, çeker ocak içindeki her bir test tüpüne 1.2 mililitre kloroform ekleyin. Ardından tüpleri kapatın ve içindekileri kuvvetlice karıştırın.

Katmanları ayırmak için, çözeltileri 3.000 Gs'de kısaca santrifüjleyin.Üst sulu katmanın çoğunu çıkarmak ve atmak için bir mera borusu kafası kullanın ve katmanın yaklaşık üç mililitresini geride bırakın. 3.5 mililitre 0.2 molar sodyum fosfat tamponu ekleyin ve ardından test tüpünü kapatın, karıştırın ve santrifüjleyin. Bu sıvı/sıvı çıkarma adımını toplam üç kez gerçekleştirin.

Son ekstraksiyonda sulu tabakanın yaklaşık bir mililitresini bırakmak. Şimdi, kloroform tabakasını metin protokolünde açıklandığı gibi temiz ve etiketli silanize cam test tüpüne dikkatlice aktarmak için temiz bir silanize mera borusu kafası kullanın. 75 santigrat dereceye ayarlanmış önceden ısıtılmış bir buharlaşma manifoldunda, numuneleri hafif bir nitrojen gazı akışı altında kurutun.

Gaz akışının sıvı yüzeyini bozduğundan, ancak sıçramadan emin olun. Numuneler kuruduktan sonra hidrolize hazır hale gelirler. Her numuneye 325 mikro litre 2 Molar trifloro asetik asit veya TFA ekleyin ve iyice karıştırın.

Sonraki ısıtma adımı sırasında TFA buharlaşmasını ve numune kaybını önlemek için tüm numunelere eklendikten hemen sonra her bir numune tüpünü sıkıca kapatın. Glikanları hidrolize etmek için numuneleri 121 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Numuneler inkübe edilirken, buharlaşma manifoldunu tekrar 75 santigrat derecede hazırlayın.

İnkübasyondan sonra, numuneleri buharlaşma manifoldunda sabit bir nitrojen akışı altında kurutun. Mümkün olan minimum kurutma süresi kullanılarak kurutulduklarından emin olmak için numuneleri sık sık kontrol edin. Her numuneye, litre başına 475 mikro litre 10 gram sodyum borohidrür ekleyin.

Ardından, herhangi bir kalıntıyı çözmek için numuneleri iyice karıştırın. Test tüplerini kapatın ve indirgeme reaksiyonunun bir saat devam etmesine izin verin. Ardından, her numuneye 63 mikro litre metanol ekleyin.

Numuneleri karıştırın ve ardından nitrojen altında 75 santigrat derecede kurutun. Her numuneye asetik asit çözeltisine 125 mikro litre metanol ekleyin. Numuneleri karıştırın ve ardından nitrojen altında 75 santigrat derecede tekrar kurutun.

20 dakika boyunca vakum altına koyarak numunelerin tamamen kuru olduğundan emin olun. Kuruduktan sonra, her numuneye 18 mikro litre deiyonize su ekleyin. Daha sonra numuneleri kısa bir süre santrifüjleyin ve bir çökeltiyi çözmek için iyice karıştırın.

Ardından, her tüpe 250 mikro litre asetik anhidrit ekleyin. Tüpleri kapatın, iyice girdap yapın ve herhangi bir kalıntının tamamen çözünmesini sağlamak için numuneleri bir su banyosunda iki dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra numuneleri 50 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

Şimdi her numuneye 230 mikro litre konsantre TFA ekleyin. Numuneleri kapattıktan ve karıştırdıktan sonra, 50 santigrat derece iç sıcaklıkta 10 dakika inkübe edin. Her numuneye 1.8 mililitre diklorometan ekleyin ve iyice karıştırın.

Ardından, tüpe iki mililitre dionize su ekleyin ve iki kez sıvı / sıvı ekstraksiyonu gerçekleştirin. Diklorometan tabakasını silanize bir mera borusu kafası ile geri kazanın. Bir otomatik numune alma şişesine aktarın ve ardından numuneyi 74 santigrat derecede nitrojen altında kurutun.

GC-MS'den önce, numuneleri her biri 120 mikro litre asetonla sulandırın, kapatın ve iyice karıştırın. Bölünmüş modda, GC bölünmüş modlu astara her numuneden bir mikro litre enjekte etmek için bir otomatik numune alıcı kullanın. Uçuş süresi kütle spektrometreleri için, dakikada 0.8 mililitrede sabit akış modunda kırk ve helyum gazının bölünmüş bir oranı önerilir.

Numuneyi, 325 santigrat dereceye ulaşan iki aşamalı bir gradyan kullanarak analiz edin. Kaçan numune bileşenlerini elektron iyonizasyonuna tabi tutun. Uçuş süresi kütle analizörü için, 0,1 saniyelik bir darbe toplama hızıyla Z 40 ila 800 arasındaki M parçalarını analiz edin.

Bu protokolün hassasiyetini göstermek için biyolojik bir numune dikkatli bir şekilde işlendi. Elde edilen kromatogram, karşılaştırma ve analiz kolaylığı için istenen ürün pikleri arasında yeterli yoğunluğu verir. Aynı başlangıç biyolojik numunesi daha sonra aynı prosedürle işlendi.

Ancak NAOH kolonundan geçirilen permetilasyon çözeltisindeki beyaz kalıntı, sıvı/sıvı ekstraksiyonu için sonraki karışıma taşındı. Kromatogram, aynı anahtar numune ürünlerinin farklı bir tepe yoğunluğu oranını verir. Doğrudan karşılaştırıldığında, fark çok belirgindir.

İkinci kromatogramdaki 4 pozisyonlu bağlı N-asetilglukozamin zirvesinin açık depresyonu, başarısız bir permetilasyon ve ekstraksiyonun tanınabilir bir özelliğidir. Bu yaklaşımın hastalık durumlarında glikan bileşimindeki farklılıkları tespit etmeye yönelik faydasını takdir etmek için, normal bir kan plazması örneğinden ve bir kanser hastası kan plazması örneğinden ekstrakte edilen iyon kromatogramları, 2 bağlı manos için normalleştirilir ve üst üste bindirilir. Beta 1-6 dallanması ve hasta siyalasyonu gibi benzersiz glikan özelliklerindeki kantitatif farklılıklar kolayca görülebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, aşağıdan yukarıya glisikmik glikan düğümü analizinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. Korfulkozulasyon, hasta cyalation ve glikanitin tek analitik sinyallere bölünmesi gibi ilginç glikan özelliklerinin damıtılmasının kolaylaştırılması.