Name: intra-trakeal İdaresi Haemophilus influenza Fare Modelleri Havayolu inflamasyonu Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Öğrenin fare modellerinde Haemophilus influenzae ile intra-trakeal inokülasyon yöntemini. Bu teknik havayolu iltihabındaki bağışıklık yanıtlarını ve düzenleyici mekanizmaları incelemek için verimli ve tekrarlanabilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El yazmasını eleştirel bir şekilde okuduğu için Dr. Carson Harrod'a teşekkür ederiz. Ayrıca katkılarından dolayı Sayın Minghui Zeng ve Dr. Mahesh Kathania ve Prashant Khare'ye de teşekkür ederiz. Bu çalışma, Amerikan Kanser Derneği'nden (Araştırma Bursu hibesi, 122713-RSG-12-260-01-LIB) ve Sammons Kanser Merkezi'nden (Pilot Proje hibesi) K. Venuprasad'a verilen hibelerle desteklenmiştir.

Tüm deneyler Baylor Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak yapıldı. 1. Kültürleme tipi belirsiz Haemophilus influenzae (NTHi) ve aşı hazırlama <ol><li> Bir çikolata agar plakası üzerinde Plaka NTHi ve 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 seviyesinde bir gece boyunca nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde başaşağı plaka tutun. Ertesi gün, kültür beyin kalp infüzyon suyu bakteri. Daha sonra, steril 1.5 ml&#39;lik tüp içine suyu 1 ml. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 4000 x g&#39;de santrifüjleyin. Sonra, süpernatantı atmak ve steril 1x PBS 1 ml pelet yeniden askıya. kez bu adımı yineleyin. </li><li> Bir spektrofotometrede 600 nm dalga boyunda seyreltilmiş kültür absorbansı 1x PBS 900 ul içinde yeniden süspansiyon haline çözeltisi 100 ul aktarın ve ölçün. </li><li> canlılık ve koloni oluşturan birim belirleyinçukulata agar plakaları üzerinde 1:10 seri dilüsyonları kültürlenmesi ve CO2 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe ve% 5 inokulum S (CFU). </li><li> Önceki aşamada belirlenen canlılık ve CFU göre, 20 x 10 6 CFU / ml&#39;lik bir son konsantrasyona inokulum ayarlayın. </li></ol> 2. İçi trakea (o) damlatma <ol><li> 150 mg / ml ketamin + 20 mg / ml ksilizin çözeltisi ile fare, 0.1 ml / 10 g vücut ağırlığına sahip intraperitonal fare (ip) enjekte edilir. prosedür hayvan sıcak tutmak için bir ışık kaynağı ile kaputu yapılmalıdır. </li><li> Fare yeterli anestezi olduğunu doğrulamak için fare birlisme alan sıkıştırın. </li><li> Sırtında fare yerleştirin. boyun ventral alan tıraş ve klorheksidin ve% 70 etil alkol ile dezenfekte edin. </li><li> Sıçan diş forseps kullanarak boyun üst karın kısmının cilt kaldırın. Bir neşter kullanılarak timus üzerinde küçük bir kesi (0.5-1.0 cm) yapmakve dikkatle trakea maruz kas teşrih. <ol><li> 27 G iğne ile 1 ml hava ile yavaş yavaş başka bir 0.05 ml hava ve ardından, bir kontrol olarak, Bölüm 1 veya tuz elde edilen 0.05 mi NTHi, ardından 0.05 mi hava, enjekte edilir. yaklaşık 1 dakika boyunca dikey hayvan tutun. </li></ol></li><li> cerrahi yapıştırıcı ile kesi kapatın. yaklaşık 10 dakika yanal yaslanmış ve sıcak fare tutmak. </li></ol> 3. BALS Koleksiyonu <ol><li> enfeksiyondan sonra servikal dislokasyon 24 saat ile fare Kurban. </li><li> anatomik makas ile fare karın boşluğuna açın ve kanamaya ventral aort kesti. Akciğerin ventral kısmını Açığa. </li><li> trakea Açığa ve 20 gauge kateter ile entübe. BALF tamponu 0.8 ml (1 x PBS,% 0.1 dekstroz, 10 U / ml heparin) aşılamak ve yumuşak aspirasyon ile lavaj toplanır. Bu işlemi üç kez tekrarlayın. </li><li> Bir hemocyto kullanılarak BALF süspansiyon 100 ul toplam hücre sayısınıTripan Mavisi boyama ile 10X büyütme altında ölçer. </li><li> modifiye Giemsa boyama için slaytlar hazırlayın. 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de Sitospin ve santrifüj uygun oyuklarına BAL&#39;da alikosu 100 ul. 10 dakika için slaytlar kurutun ve üretici protokollerine göre modifiye Giemsa kullanarak hücreleri leke. </li><li> Bu floresans (FACS) aktive hücre, konfokal mikroskopi, gen ifadesi ve western blot 11-13 kadar bir sonraki analiz için geri kalan hücreler, kullanın. </li></ol> 4. Histopatolojisi Hazırlık <ol><li> Adım 2.4 açıklandığı gibi histopatoloji analizi için, NTHi ile fareleri enfekte. enfeksiyonun 24 saat sonra, servikal dislokasyon ile hayvanlar kurban. akciğerler ve daha önce de belirtildiği gibi trakea maruz anatomik makas ile göğüs boşluğu açmak kesin. Sonra, trakea içine 20 gauge kateter yerleştirin. </li><li> % 4 formalin içinde hazırlanan% 2 sıcak agaroz çözeltisi ile akciğer doldurun. Bir kereAkciğerler tam agaroz çözüm katılaşmaya akciğerlere üstüne yeri buz, şişirilmiş. </li><li> Sonra, dikkatle göğüs fişi çıkarın ve hematoksilen ve eozin (H &amp; E) bölümleri için işlenir kadar 1x PBS içinde% 4 formalin 50 ml çözelti koydu. </li></ol> BAL&#39;da Hücreleri Boyama 5. FACS <ol><li> 96 oyuklu V-tabanlı mikro titre plaka BALS sıvısından 1 x 10 5 hücre koyun. </li><li> 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 4000 x g&#39;de 300 soğuk 1 x PBS ul ve spin hücreleri yıkayın. </li><li> (1: 1000 seyreltme) 100 ul 1x PBS hücre leke çözeltisi ile hücreleri leke ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında tutulması. </li><li> 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 4000 x g&#39;de soğuk 1 x PBS, 300 ul hücre yıkayın. </li><li> 1 içeren FACS yıkama tamponu [Yıkama tamponu (1 x PBS,% 2 FBS, 1 mM EDTA,% 0.1 sodyum azid] 100 ul hücre edin: 100 seyreltilmiş Fc Block, 4 ° C&#39;de 15 dakika karıştırıldı. </li><li> 4.000 xg&#39;de Santrifüj hücreleri 3 dakika ve sup atınernatant. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca bir FACS yıkama tamponu (100 seyreltme 1) 100 ul yüzey boyama kokteyli ile Leke hücreleri. </li><li> 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 4000 x g&#39;de FACS yıkama tamponu 300 ul ile üç kez hücreleri yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid, 100 ul hücre düzeltildi. </li><li> 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 400 x g&#39;de PBS 1X 300 ul hücreler iki kez yıkanır ve FACS yıkama tamponu 300 ul içinde yeniden askıya. </li><li> boncuk flow sitometri kullanılarak tek renkli boyama kontrolleri yapın. <ol><li> 96 oyuklu V-tabanlı mikrotiter plakası içine tanelerin bir damla ekleme ve PBS 1X 200 ul ile yıkayın. </li><li> PBS ve boncuk 1x 100 ul lekeleme antikorun 1 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> PBS 1X 300 ul iki kez boncuk yıkayın. </li></ol></li><li> 14 flow sitometri tek lekeli kontrolleri ve hücreleri analiz edin. </li></ol> RNA izole etmek Akciğer Doku 6. Homojenizasyon <ol><li> Enfeksiyondan sonra, akciğer (20-40 mg), küçük bir parça toplamak ve gece boyunca 4 ° C &#39;de reaktif stabilize edici RNA tutun. Daha sonra, bir sonraki aşamada kadar -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> RNA stabilizasyonu ayıracı kurtulmak için soğuk 1x PBS akciğer dokuları yıkayın. </li><li> 1.5 ml santrifüj tüpü ihtiva eden liziz tamponu (1 mi liziz tamponu, 10 ul β-merkaptoetanol) halinde doku yerleştirin. </li><li> sivri makas kullanarak küçük parçalar halinde doku doğrayın ve 20-40 saniye boyunca bir kablosuz motorlu pelet havaneli kullanarak homojenize. </li><li> 5 dakika boyunca buz üzerinde lizat tutun ve adım 7.1 ile devam edin. </li></ol> Akciğer 7. RNA İzolasyon <ol><li> 3 dakika boyunca 18.000 x g&#39;de lizat santrifüjleyin. pipetle ile süpernatantı ve dikkatle yeni bir 1.5 ml tüp aktarın. </li><li> lizat% 70 etanol içinde 1 hacim. Pipetleme tarafından hemen karıştırın ve 2-4 dakika bekleyin. </li><li> yerleştirilmiş bir döndürme kolonuna lizat 700 ul kadar transfer2 ml&#39;lik bir toplama tüpü içinde. </li><li> 15 saniye boyunca 9.600 xg&#39;de Santrifüj ve flow-through atın. </li><li> 15 saniye boyunca 9.600 xg&#39;de 350 mcL sıkı yıkama tamponu ve santrifüj ekleyin. flow-through atın. </li><li> Doğrudan spin kolon zarına 80 ul DNaz eklenir ve 15 dakika için oda sıcaklığında saklayın. </li><li> 15 saniye boyunca 9.600 xg&#39;de spin kolon ve santrifüj 350 ul sıkı yıkama tamponu ekleyin. flow-through atın. </li><li> 15 saniye boyunca 9.600 xg&#39;de 500 ul RNA yıkama tamponu ve santrifüj ekleyin. flow-through atın. </li><li> 2 dakika süreyle 9600 xg&#39;de 500 ul RNA yıkama tamponu ve spin ekleyin. flow-through atın. </li><li> 1 dakika boyunca 9.600 xg&#39;de yeni 2 ml toplama tüpü ve santrifüj spin kolon yerleştirin. flow-through atın. </li><li> 1 dakika boyunca 9.600 x g&#39;de spin kolon ve santrifüj doğrudan 30-50 mL RNaz içermeyen su ilave edilir. -80 ° C&#39;de saklayın RNA. </li><li> RNAseq analizi 14 gerçekleştirin. </li></ol>

<ol><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454, 428-435 (2008).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li>
<li>Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+asthma+and+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease.</a> Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).</li>
<li>Sethi, S., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+the+pathogenesis+and+course+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease.</a> N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).</li>
<li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lung+Immune+Response+to+Nontypeable+Haemophilus+influenzae+%28Lung+Immunity+to+NTHi%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi).</a> J Immunol Res. 2015, 706376(2015).</li>
<li>Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+airway+microbiology+and+cellularity+in+children+with+newly+diagnosed+non-CF+bronchiectasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis.</a> Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).</li>
<li>King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+PT+%22Respir+Med%22">Respir Med</a>. 101, 1633-1638 (2007).</li>
<li>Shuto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NF-kappa+B+by+nontypeable+Hemophilus+influenzae+is+mediated+by+toll-like+receptor+2-TAK1-dependent+NIK-IKK+alpha+%2Fbeta-I+kappa+B+alpha+and+MKK3%2F6-p38+MAP+kinase+signaling+pathways+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).</li>
<li>Moghaddam, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemophilus+influenzae+lysate+induces+aspects+of+the+chronic+obstructive+pulmonary+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+exposure+to+bacterial+superantigens+induces+airway+inflammation+in+HLA+class+II+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice.</a> Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).</li>
<li>Ganesan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase%2FLPS-exposed+mice+exhibit+impaired+innate+immune+responses+to+bacterial+challenge%3A+role+of+scavenger+receptor+A%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A.</a> Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).</li>
<li>Hogner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-expressed+IFN-beta+contributes+to+apoptotic+alveolar+epithelial+cell+injury+in+severe+influenza+virus+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia.</a> PLoS Pathog. 9, e1003188(2013).</li>
<li>Karisola, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+Natural+Killer+T+Cells+Play+a+Role+in+Chemotaxis%2C+Complement+Activation+and+Mucus+Production+in+a+Mouse+Model+of+Airway+Hyperreactivity+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation.</a> PloS one. 10, e0129446(2015).</li>
<li>Theivanthiran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E3+ubiquitin+ligase+Itch+inhibits+p38alpha+signaling+and+skin+inflammation+through+the+ubiquitylation+of+Tab1%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1.</a> Sci Signal. 8, 22(2015).</li>
<li>Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+role+of+the+ubiquitin+ligase+Itch+in+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation.</a> Immunol Cell Biol. , (2015).</li>
<li>Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chronic obstructive pulmonary disease.</a> Lancet. 379, 1341-1351 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu yazıda, bakteriyel akciğer patojen ile farelerin akciğerleri aşılamak için eşsiz ve minimal invaziv prosedürü açıklar. Bu prosedür, inflamatuar sinyal yollarının genleri eksik olan fareler kullanılarak, farklı genlerin fonksiyonunu incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu prosedür, aynı zamanda, viral ve mantar akciğer enfeksiyonu enflamatuvar yanıtları incelemek için kullanılabilir. Böyle intranazal veya aerosol inhalasyon gibi diğer yöntemlere göre bu prosedürün avantajları (1) Bu prosedürde, patojenik...

Enflamasyon enfeksiyöz ajanlara karşı savunma temel bir bağışıklık mekanizmadır. Bu patojen ortadan kaldırılması ve hasarlı doku onarımını teşvik eder. Aynı zamanda normal sağlıklı durumuna 1&#39;e kurtarma kolaylaştırır. Ancak, düzensiz inflamasyon sıklıkla kronik enflamatuar hastalıklar 2 yol açar. Hava yolu inflamasyonu, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (COPD), astım ve pulmonar fibrosis 3 farklı akciğer hastalıkları için bir başlangıç ​​tetikleyicidir. Tiplendirilemeyen (kapsüllenmemiş), Haemophilus influenzae (NTHi) kronik üst ve alt akciğer enflamatuar hastalıklar 4,5 ile ilişkilidir. Kronik obstrüktif akciğer hastalığı 4,6,7 çocuk ve yetişkinlerin alt solunum yolları izole baskın türdür. NTHi enfeksiyon sonrası inflamatuar yanıtı (örneğin, TNF ve IL-1 gibi) proenflamatuar sitokinlerin regülasyonu ile karakterize edilir ve b aracılıky mitojen aktive protein kinaz (MAPK) ve toll benzeri reseptörler aracılığıyla nükleer faktör-KB (NF-KB) (TLR) 8. Fare modelleri nedeniyle farklı gen eksikliği hatlarının durumu akciğer inflamatuar hastalığın altında yatan patolojiyi analiz etmek için çok yararlı araçlardır. Çeşitli metotlar, intranazal uygulaması ve aerosol haline getirilmiş inhalasyon 9,10 dahil olmak üzere, canlı / zayıflatılmış bakterileri ve bakteriyel ürünler, aşılamak için kullanılmıştır. Burada, içi trakeal instilasyon göstermektedir. daha az sıklıkta kullanılmasına rağmen, bu yaklaşım daha verimli ve çünkü daha düşük solunum sistemine inokulum doğrudan teslimat yüksek tekrarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>Çikolatalı agar plakası</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz Susuz</td><td>Themo Scientific</td><td>R01300</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Hospira,Inc</td><td>RL-3010</td><td></td></tr><tr><td>Deft hızlı çözüm</td><td>Sigma</td><td>GS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga iğnesi 20 / 26G & nbsp;</td><td>BD</td> <td>(REF305115 / 175)</td><td></td></tr> <tr><td>Iml şırınga</td><td>BD</td><td>REF 309602</td><td></td></tr><tr><td>Kateter 20GA</td><td>BD</td><td>REF</td><td></td></tr><tr><td>381433 Diseksiyon Makası, düz, 10 cm uzunluğunda</td><td>kentscientific</td><td>INS600393</td><td></td></tr><tr><td>İris Forseps, tırtıklı, 10 cm uzunluğunda</td><td>kentscientific</td><td>INS650915</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız #5 Paslanmaz çelik, 11 cm uzunluğunda</td><td>kentscientific</td><td></td><td></td>INS600095</tr><tr><td>%10 Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>5ml polistiren yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>BD</td><td>REF 352058</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Light Labs</td><td>A-7001-R</td><td></td></tr><tr><td>Reasy Mini&nbsp; kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Pelet pestil motor (Doku homojenleştirici)</td> <td>Sigma</td><td>Z359971-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu mikrotitre plakaları V alt</td><td>Thermo</td><td>2605</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0454-81</td><td>Çalışma seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>Ly-6G-eFlor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Çalışma seyreltmesi 1:100</td></tr><tr><td></td><td>BSA HyClone</td><td>SH30574.03</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lizis Tamponu (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Canlı/Ölü sabitlenebilir aqua ölü hücre leke kiti</td><td>Invitrogen</td><td>L-34957</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5M)</td><td>lifetechnologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>CD16/ CD32 FcBlock</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Facs tüpleri polistiren yuvarlak alt tüp</td><td>BD</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Polyscience</td><td>4018</td><td></td></tr></tbody></table>

intra-trakeal İdaresi<em&gt; haemophilus influenza</em&gt; fare modelleri havayolu inflamasyonu eğitim için

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Burada, verimli ayrıntılı bir prosedür tanımlamak ve doğrudan Haemophilus influenzae teslim farelerin alt solunum yollarına. Biz H. hazırlanması için prosedür göstermek influenza aşı, H. içi trakeal damlatma akciğere influenzae, farklı gen ekspresyon analizi için bronko-alveolar lavaj sıvısı (BALF), BAL sıvısında bağışıklık hücrelerinin analizi ve RNA izolasyonu toplanması. Bu prosedür, bir bakteri, virüs ya da mantar akciğer enflamatuar yanıtı çalışma için kullanılabilir. daha az belirsizlik ile daha verimli alt solunum yollarına bakteriyel inokulum sunar, çünkü doğrudan trakea damlatma çoğunlukla burun veya aerosol inhalasyon prosedürleri tercih edilir.

Intra-trakeal instilasyon tuzlu su ile yükleme daha BALS (Şekil 1A, sol panel) lökositlerin belirgin artan sayıda sonuçlandı. Lökositlerin diferansiyel sayısı analizi açık bir şekilde artmış nötrofil infiltrasyon (Şekil 1, sağ panel) göstermiştir. BAL sıvısında hücrelerinin FACS analizi daha da nötrofillerin sayısını (Şekil 1B) doğruladı. Akciğer dokusunda H &amp; E-boyanan kesitler histolojik analiz havayolu inflamasyonu (Şekil ...

Haemophilus influenzae'nin farelerin alt solunum yollarına intra-trakeal inokülasyon prosedürünü gösteriyoruz. Bu, fare modellerinde hava yolu iltihabını düzenleyen sinyal yollarını incelemek için çok kullanışlı bir araçtır.

intra-trakeal İdaresi<em&gt; Haemophilus influenza</em&gt; Fare Modelleri Havayolu inflamasyonu Eğitim için

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Bu deneyin genel amacı, bakteriyel enfeksiyon sırasında akciğerdeki immün yanıtları incelemektir. Bu konu, akciğer inflamasyonunu inhibe eden veya teşvik eden temel düzenleyici mekanizmalar ve genlerin neler olduğu gibi, akciğer inflamasyonu alanındaki bazı temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bakteriyel inokülümün alt solunum yollarına doğrudan verilmesi sayesinde çok verimli ve yüksek düzeyde tekrarlanabilir olmasıdır.Başlamak için, NTHi'yi bir çikolata agar plağına ekiniz. Plağı ters çevrilmiş şekilde, 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren ortamda gece boyunca inkübe ediniz. Ertesi gün, bakterileri bir beyin-kalp infüzyon besiyerinde kültüre ediniz.Ardından, bir mikrosantrifüj tüpüne bir mililitre besiyeri ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 4,000 g'de santrifüjleyin. Sonrasında, süpernatanı atın ve peleti bir mililitre PBS içinde yeniden süspande edin.Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın. Ardından, resüspande edilen çözeltiden 100 µL'yi 900 µL PBS ile seyreltin ve kültürün absorbansını 600 nm'de ölçün. İnokülumu mililitre başına 20 milyon CFU olacak şekilde ayarlamak için bu bilgileri kullanın.Ardından, inokülumun viabilite ve CFU değerlerini belirleyin. Brotun bir ila on adet seri dilüsyonunu çikolata agar plaklarına kültüre edin ve plakları gece boyunca inkübe edin. Fareyi anestezi ederek başlayın ve ayak parmağı sıkma testi ile yeterli düzeyde anestezi altında olduğunu doğrulayın.Ardından, fareyi sırt üstü pozisyonlandırın ve boynun ventral bölgesini tıraş edin. Açığa çıkan cildi dezenfekte edin. Şimdi, boynun üst ventral kısmındaki cildi fare diş pensi ile kaldırın ve bir bistüri kullanarak timusun üzerine yarım ila bir santimetrelik bir insizyon yapın.Ardından, trakeyeyi açığa çıkarmak için kası dikkatlice ayırın. Trakeye önce 50 µL hava, ardından 50 µL hazırlanmış NTHi ve son olarak tekrar 50 µL hava yavaşça enjekte edin. Negatif kontrol prosedürü için NTHi yerine salin enjekte edin.Enjeksiyondan sonra hayvanı yaklaşık bir dakika boyunca dikey tutun. Ardından, insizyonu doku yapıştırıcısı ile kapatın ve fareyi yaklaşık 10 dakika boyunca yan yatar pozisyonda ve sıcak tutun. Enfeksiyondan 24 saat sonra, enfekte hayvanı ötanize edin ve abdominal boşluğu anatomik makasla açın.Ardından, hayvanın kanını boşaltmak için ventral aortayı kesin. Daha sonra, trakeaya erişmek için akciğerin ventral kısmını açığa çıkarın. Trakeayı 20 gauge bir kateter ile entübe edin.Kateteri kullanarak 0,8 mililitre BALF tamponu instilasyon yapın ve lavajı dental aspirasyonla toplayın. Bu işlemi üç kez daha tekrarlayarak dört lavaj örneğini tek bir süspansiyonda birleştirin. 100 mikrolitrelik bir aliquot alın ve 2.000 RPM'de iki dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve RBC liziz tamponu içerisinde yeniden süspanse edin. Santrifüjle çöktürün ve pelletle 1x PBS ile yeniden süspanse edin. Şimdi, trypan blue boyamasıyla, 10x büyütmede bir hemositometre kullanarak süspansiyonun 100 microliters içindeki toplam hücre sayısını belirleyin.Ardından, hücreleri boyamak için lamları hazırlayın. 100 µL BALF süspansiyonunu sitospinin uygun kuyucuklarına paylaştırın ve lamları 500 g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, lamları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kurutun ve hücreleri üretici protokollerine uygun olarak modifiye Giemsa boyası ile boyayın.Kalan hücreleri FACS, konfokal mikroskopi ve benzeri sonraki analizler için kullanın. Enfekte akciğerden lavaj topladıktan sonra, 20-40 miligramlık bir akciğer parçası alın ve bunu RNA stabilizasyon reaktifinde dört °C'de gece boyunca inkübe edin, ardından 80 °C'de uzun süreli saklama yapın. Hazır olduğunda, RNA stabilizasyon reaktifini uzaklaştırmak için akciğer doku örneklerini soğuk PBS ile yıkayın.Ardından, dokuyu beta merkaptoetanol içeren lizis tamponu bulunan 1.5 milliliter santrifüj tüpüne yerleştirin. Sonra, küçük bir makasla dokuyu parçalara ayırın ve parçaları motorlu bir havan eli kullanarak 20-40 saniye boyunca homojenize edin. Lizatı beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin, ardından 18, 000 g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve yeni bir tüpe aktarın. Ardından bir hacim %70 etanol ekleyin ve karışımı tritüre edin. Karışımın 25 °C'de iki ila dört dakika boyunca dinlenmesini sağlayın.Ardından, 700 µL'ye kadar olan hacmi iki mililitrelik bir toplama tüpü üzerindeki spin kolonuna aktarın ve kolonu 9600 g'de 15 saniye boyunca santrifüjleyin. Akış sıvısını atın, 350 µL yıkama tamponu ekleyin ve santrifüj işlemini tekrarlayın. Daha sonra, membranı 80 µL DNase I Solüsyonu ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, kolona 350 microliter yıkama tamponu ekleyin ve santrifüj işlemini tekrarlayın. Daha sonra, 500 microliter RNA yıkama tamponu ekleyin. Kısa süreli santrifüj işlemini tekrarlayın ve akış sıvısını atın.RNA yıkama tamponu ile iki kez yıkama yapın. Son olarak, yeni bir toplama tüpü üzerinde, kolona doğrudan 30-50 µL RNase-free su ekleyin ve RNA örneğini akışla toplamak için bir dakika boyunca santrifüjleyin. İşlem, normal, sağlıklı farelerle açıklandığı şekilde gerçekleştirilmiştir.NTHi ile inoküle edilen farelerin bronkoalveoler lavaj sıvısındaki lökosit sayısı, salin uygulanan kontrol grubuna kıyasla intratrakeal instillasyon sonucunda belirgin şekilde artmıştır. Lökositlerin diferansiyel sayım analizi, nötrofil infiltrasyonunun arttığını açıkça göstermektedir. BALF içerisindeki hücrelerin FACS analizi, artan nötrofil sayısını ayrıca doğrulamaktadır.Akciğer dokusunun HNE ile boyanmış kesitleri, artmış havayolu inflamasyonunu göstermektedir. Toplu olarak bu veriler, intratrakeal instilasyonun farelerde havayolu inflamasyonunu tetiklediğini düşündürmektedir. Mutant ve kontrol farelerle yapılan benzer bir deneyde, akciğer dokusu RNA'sı tüm transkriptom dizileme ile analiz edilmiştir.Yaban tip kontrollerle karşılaştırıldığında, Itch eksikliği birkaç genin diferansiyel ekspresyonu ile sonuçlanmıştır. Itch'in inflamatuar sinyal yolaklarının bir düzenleyicisi olduğu düşünülmektedir, bu nedenle bu sonuç yeni çalışmaların teşvik edilmesi için kullanılabilir. Gelişim süreci boyunca bu teknik, akciğer hastalıkları alanındaki araştırmacıların akciğer enfeksiyonu ve inflamasyonu sırasında immün hücrelerdeki hücre sinyalizasyonunu keşfetmelerine olanak sağlamıştır.Bu prosedürü uygularken, trakenin açığa çıkarılması ve trakeaya bakteri verilmesi gibi işlemler sırasında ekstra önlemler almayı hatırlamak önemlidir. Uzmanlaşıldığında, intratrakeal uygulama on dakika içinde gerçekleştirilebilir ve flakon sıvısı 10-15 dakika içinde toplanabilir. Bu prosedürden sonra; hangi genlerin ekspresyonunun arttığı veya azaldığı gibi ek soruları yanıtlamak için RNA dizileme, akış sitometrisi ve immünbloklama gibi ek işlemler gerçekleştirilebilir.

intra-tracheal-administration-haemophilus-influenzae-mouse-models-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Venuprasad, K., ve diğerleri. Hava Yolu Enflamasyonunu İncelemek İçin Fare Modellerinde Haemophilus influenzae'nin Trakeal İçi Uygulaması. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, alt solunum yolu enfeksiyonunu modellemek için akciğer patojenik bir bakteri inokulumunun anestezi uygulanmış bir fareye intratrakeal olarak verilmesini göstermektedir.

Bir Fare Modelinde İntratrakeal Bakteri Dağıtımının Gerçekleştirilmesi

Kaynak: Venuprasad, K., ve diğerleri. Hava Yolu Enflamasyonunu İncelemek İçin Fare Modellerinde Haemophilus influenzae'nin Trakeal İçi Uygulaması. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, aşağı akış analizi için tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae ile enfekte ötenazi uygulanmış bir fareden bronkoalveoler lavaj sıvısının toplanmasını ve işlenmesini göstermektedir.

Tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae ile Enfekte Bir Fare Modelinden Bronkoalveoler Lavaj Sıvısı Toplanması

Kaynak: Lenhard, A. ve diğerleri. Streptococcus pneumoniae'nin viral eş-enfeksiyon sonrası kolonizerden patojene geçişi için fare modeli, yaşa bağlı hastalığı özetliyor. J. Vis. Exp. (2022)Bu video, grip virüsünün Streptococcus pneumoniae'nin kolonizatordan patojene geçişini tetiklediği bir fare ortak enfeksiyon modelini gösteriyor. Bakteriyel kolonizasyon, viral enfeksiyon ve hastalık ilerlemesiyle ilgili adımları özetler.

Viral Ortak Enfeksiyon Sonrası Streptococcus pneumoniae'nin Patojenik Geçişini İnceleyen Fare Modeli

Biz 2.0 mm spekulum ile bir otoskop kullanarak direkt laringoskopi yoluyla farelerde entübasyon için, basit, güvenilir ve nispeten ucuz bir yöntem geliştirdik. Bu teknik, atravmatik ve kronik deneylerde tekrarlanan ölçümler için de kullanılabilir. Biz üstün trakeostomi veya daha önce cerrahi dışı teknikler bildirdi bulabilirsiniz.

Farelerde Endotrakeal Entübasyon<em&gt; Via</emBir Otoskop Kullanma&gt; Doğrudan Larengoskopi

Patojen enfeksiyonuna karşı konak bağışıklık tepkisi sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Farelerde bir lipopolisakarit akciğer maruz modeli kullanarak, bu hastalığın patojenezi ile ilgili kompleks mekanizmalar yüksek çözünürlüklü değerlendirme yapmak mümkündür.

Farelerde Host immün yanıtı değerlendirmek için Orofarengeal intratrakeal PAMP İdaresi ve Bronchoalveolar Lavage Kullanımı

Reaktiflerin Entübasyon aracılı intratrakeal (IMIT) instilasyon solunum yolu hastalıkları, hem de akciğer içine doğrudan tedavi reaktifler aşılamak için bir yöntem incelenmesi için mükemmel, invazif olmayan bir yöntemdir. Bu klinik öncesi test için uygun bir hızlı ve yüksek oranda çoğaltılabilir bir yöntemdir.

Entübasyon-aracılı intratrakeal (IMIT) damlatma: A Noninvaziv, Lung-özel Dağıtım Sistemi

Aşıların nasıl çalıştığı hakkında genel bir bilgi eksikliği var. Burada, dendritik hücrelere ve T hücresi bağışıklığına özel olarak odaklanarak, aşılara karşı erken konak bağışıklık tepkileri hakkında fikir edinmek için ters genetik ve kemik iliği kimerik farelerin birlikte kullanılmasını öneriyoruz.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Çeşitli yöntemler, farelerde bakteriyel pnömoni modelleme için literatürde tarif edilmiştir. Bu yazıda, orofarinksin pipetle bakteriyel inokulum aspirasyonu (yani, inhalasyon) yoluyla zatürree uyarılması için bir non-invaziv, ucuz, hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. akciğer doğal bağışıklık yanıtının değerlendirilmesi için aşağı akış yöntemleri de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Farelerde Deneysel Bakteriyel Pnömoni İndüksiyonunun ve fenotipleme bir Non-invaziv ve Teknik Olmayan yoğun Yöntem

Bu çalışmada, biz iki fotonlu intravital görüntüleme ve hücre etkileşim fare trakeal mukoza grip virüsü ile enfeksiyon sonra çözümlemesi için bir protokol mevcut. Bu iletişim kuralı bağışıklık hücre dynamics sırasında solunum yolu enfeksiyonları eğitim araştırmacılar için ilgili olacaktır.

İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi

Burada etkinliği ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtı aşı vivo içinde değerlendirilmesi için zarif bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı eğitim viral, bakteriyel aşı modelleri veya paraziter patojenler için adapte edilebilir.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Bu protokol, IAV'nin intranazal uygulaması ve fare akciğer hasarının aşağı akış analizi ve akciğer hücre tiplerinde ilişkili transkripsiyonel değişiklikler için talimatlar sağlar.

İnfluenza Enfeksiyonu Sonrası Displastik ve Fonksiyonel Akciğer Alveoler Onarımının Modellenmesi

Öğrenin fare modellerinde Haemophilus influenzae ile intra-trakeal inokülasyon yöntemini. Bu teknik havayolu iltihabındaki bağışıklık yanıtlarını ve düzenleyici mekanizmaları incelemek için verimli ve tekrarlanabilir bir model sunar.

intra-trakeal İdaresi

Daha fazla video keşfet