Erken Açlık Tepki Koronin A Fonksiyonu incelenmesi Dictyostelium discoideum Toplama Tahliller
June 18th, 2016
Sosyal amip Dictyostelium discoideum açlıktan öldüğünde gelişimsel olarak çok hücreli bir organizmaya geçiş yapar. Evrimsel olarak korunmuş protein koronin A, gelişimin başlangıcında çok önemli bir rol oynar. Agregasyon testlerini ana yöntemimiz olarak kullanarak, koronin A'nın erken gelişimdeki rolünü aydınlatmayı amaçlıyoruz.
Bu deneysel prosedürün genel amacı, Dictyostelium discoideum'un Coronin-A'ya bağlı erken açlık tepkisini araştırmaktır. Bu yöntem, Dictyostelium discoideum'un erken gelişiminde rol oynayan sinyal yollarının ve faktörlerin tanımlanması gibi Gelişim Biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, erken gelişimsel sinyallemede yer alan gelişimi indükleyen faktörlerin ve proteinlerin otomatik ve yüksek verimli taraması için bir araç sağlama potansiyeline sahip olmasıdır.
Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, hücre yoğunlukları, yapışma süresi ve gelişme zamanı gibi teste özgü çoklu değişkenler nedeniyle mücadele edeceklerdir. Bu işleme başlamak için, HL-5 ortamı içeren bir Erlenmeyer şişesinde, 22 santigrat derecede, 160 rpm'de çalkalama inkübatöründe DH1.10 hücrelerini veya corA eksikliği olan hücreleri büyütün. Hücreleri mililitre başına bir çarpı 10 ila dört ve iki çarpı 10 ila altı hücre arasında bir yoğunlukta tutun.
Hücre agregasyonunu incelemek için, DH1.10 arka planında üretilen 10 ila 50 mililitre log faz büyüyen DH1.10 hücrelerini veya corA eksikliği olan hücreleri hasat edin. Onları 400 kez g'de üç dakika santrifüjleyin. Sonra hücreler BSS'de iki kez oldu.
Daha sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, hücreleri 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin. BSS'de 22 derece Celsuis'te bir saat yapışmalarına izin verin.
Ardından, hızlandırılmış mikroskopi ile hücre agregasyonunu görselleştirin ve her 135 saniyede bir görüntü çekin. Dışarıdan uygulanan döngüsel AMP darbelerinin DH1.10 hücrelerinin veya DH1.10 corA eksikliği olan hücrelerin gelişimi üzerindeki etkisini incelemek için, hücrelerin 10 ila 50 mililitresini toplayın ve bunları 400 kez g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Bundan sonra, onları BSS'de iki kez yıkayın.
Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, hücreleri BSS'de mililitre başına yedi hücreye bir kez 10 ila yedi hücre yoğunluğuna yeniden askıya alın. Ardından, bakliyat uygulamadan önce kültürleri 22 santigrat derecede 160 rpm'de iki saat çalkalayın.
Ardından, zamanlayıcı kontrollü bir peristaltik pompa kullanarak döngüsel AMP darbeleri uygulayın. Pompayı, beş saatlik bir süre boyunca her altı buçuk dakikada bir beş saniyelik bir döngüsel AMP darbesi verecek şekilde programlayın. Kritik bir adım, döngüsel AMP enjeksiyonunun ucunun sürekli olarak çözeltiye daldırılmamasını, ancak çalkalayıcı tarafından üretilen dalgalara yalnızca periyodik olarak daldırılmasını sağlamaktır.
Döngüsel AMP uygulamasından sonra, bir hemositometre kullanarak hücreleri tekrar sayın. Daha sonra, hücreleri 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve BSS'de bir saat boyunca yapışmalarına izin verin. 16 saat sonra, hücre agregasyonunu 22 santigrat derecede, beş x subjektif kullanarak parlak alan mikroskobu ile görselleştirin.
Bu prosedürde, 22 santigrat derecede HL5 ortamı ile çalkalama kültürlerinden log fazı DH1.10 hücreleri veya DH1.10 corA eksikliği olan hücreleri toplayarak taze şartlandırılmış ortam hazırlayın. Hücreleri 400 kez g'de üç dakika santrifüjleyin. Bundan sonra, PBM'de üç kez yıkayın.
Daha sonra, hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın, Ardından, mililitrede 10 ila yedi hücre yoğunluğunda PBM'de yeniden askıya alın ve 110 rpm'de 22 santigrat derecede 20 saat boyunca sallayın. Daha sonra, hücreleri üç dakika boyunca 400 kez g'de santrifüjleyin, ardından şartlandırılmış ortamı toplayın. Daha sonra, ortamı dört derece Celsuis'de 15 dakika boyunca 8.000 kez g'de santrifüjleme ile netleştirin.
Ardından, şartlandırılmış ortamı 0,45 mikrometrelik bir filtreden süzün ve PBM'de üç kat seyreltin. Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın, 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve 22 santigrat derecede bir saat boyunca yapışmalarına izin verin. Daha sonra, hücrelerin süpernatantını önceden hazırlanmış şartlandırılmış bir ortamla değiştirin.
16 saat sonra, beş x subjektif kullanarak parlak alan mikroskobu ile hücre agregasyonunu görselleştirin. Burada, Coronin-A'da eksik olan hücreler erken gelişimde bir kusur gösterir ve Dictyostelium discoideum'un gelişim döngüsü sırasında ilk adım olan çok hücreli agregalar oluşturamazlardı. Bu şekilde, vejetatif Yabani tip ve korA eksikliği olan hücreler, süspansiyonda beş saat boyunca her altı buçuk dakikada bir 15 hayvan veya siklik AMP ile veya 15 hayvan veya siklik AMP olmadan nabız atılmadan önce iki saat boyunca yıkandı ve aç bırakıldı.
Eksojen döngüsel AMP darbelerinin uygulanması, Wild tipi fenotipini tamamen restore etti. Bu şekilde, katlanarak büyüyen Yabani tip ve corA eksikliği olan hücreler, PBM'de yıkandı, çok kuyucuklu plakalara ekildi ve Yabani tip veya corA eksikliği olan açlık çeken hücrelerden elde edilen şartlandırılmış ortamda inkübe edildi. Görüntüler, hücrelerin tohumlanmasından 16 saat sonra çekildi.
corA eksikliği olan Dictyostelium discoideum, gelişimsel indüksiyon için gerekli tüm faktörleri üretebildi, ancak bunlara cevap veremedi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, kuluçka süresi de dahil olmak üzere 20 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, farklı suşlar için hücre yoğunlukları, yapışma süresi, gelişme zamanı gibi testin birden fazla değişkeninin ayarlanması gerekeceğini hatırlamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, Dictyostelium discoideum'un erken açlık tepkisinde rol oynayan faktörleri belirlemek için biyokimyasal fraksiyonlama ve müteakip proteomik analiz yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, Dictyostelium discoideum'da batık koşullar altında, koşullu ortamların yanı sıra döngüsel AMP darbeleri kullanılarak erken gelişimin nasıl indükleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olunmalıdır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, sosyal amebanın Dictyostelium discoideum'unun açlık tepkisindeki erken evrede coronin A'nın rolünü araştırmaktadır. Araştırma, açlık sırasında organizmanın çok hücreliliğe geçişinde yer alan sinyal yollarını açıklamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gelişimsel Biyoloji
- Hücre Biyolojisi
- Mikrobiyoloji
Arka Plan
- Dictyostelium discoideum, hücresel gelişimi incelemek için kullanılan bir model organizmadır.
- Coronin A, gelişimin başlaması için evrimsel olarak korunmuş önemli bir proteindir.
- Organizma, açlık koşullarında tek hücreliden çok hücreli formlara önemli bir geçiş yapar.
- Bu süreci anlamak, gelişimsel sinyal mekanizmaları hakkında bilgi sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Dictyostelium discoideum'da Coronin-A bağımlı erken açlık tepkisini araştırmak.
- Erken gelişimde yer alan temel sinyal yollarını ve faktörleri tanımlamak.
- Gelişimi indükleyen faktörlerin yüksek verimli taraması için bir yöntem geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Gelişimsel geçişleri incelemek için agregasyon tahlilleri.
- HL-5 ortamında DH1.10 ve corA-eksikliği olan hücrelerin büyütülmesi.
- Deney boyunca belirli hücre yoğunluklarının korunması.
- Optimal büyüme koşulları için bir sallanan inkübatör kullanmak.
Ana Sonuçlar
- Coronin A, Dictyostelium discoideum'un erken gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır.
- Açlık tepkisinde yer alan temel faktörler ve yollar belirlenmiştir.
- Gelişimsel faktörlerin otomatik taraması için potansiyel gösterilmiştir.
- Yönteme yeni başlayanların karşılaştığı zorluklara değinilmiştir.
Sonuçlar
- Çalışma, Dictyostelium discoideum'da gelişimsel biyolojiyi anlamamızı artırmaktadır.
- Coronin A, çok hücreli gelişimin başlaması için gereklidir.
- Bulgular, gelişimsel sinyal yolları üzerinde daha fazla araştırmaya yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Early-stage aggregation assays in Dictyostelium discoideum enable mechanistic de-risking of protein function upstream of key signaling cascades. This approach supports predictive confidence in target validation by isolating the role of coronin A in multicellular development initiation. The method provides a robust platform for functional interrogation of signaling components relevant to developmental and cell signaling research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional dissection of protein roles in early developmental signaling.
- Supports biological de-risking by clarifying upstream pathway dependencies.
- Facilitates predictive confidence in target selection for further study.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for high-throughput screening of development-inducing factors.
- Standardizes aggregation readouts for reproducibility and quantitative comparison.
- Enables scalable evaluation of protein function in multicellular transition models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early mechanistic findings with downstream pathway analysis in disease-relevant systems.
- Provides continuity from discovery-stage functional assays to preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying pathway bottlenecks.
Pipeline & Workflow Integration
This aggregation assay positions upstream of cAMP signaling, bridging early discovery biology with downstream screening and analytics in the developmental signaling workflow.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for protein function in starvation-induced development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative aggregation outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables measurement of aggregation phenotypes and response to exogenous factors.
- Translational Research: Provides mechanistic insights that inform preclinical model selection.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable assay platform for functional genomics and pathway interrogation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes assay conditions for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of signaling targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, aggregation assays, and time-lapse microscopy.
- Needs access to controlled incubators, peristaltic pumps, and quantitative imaging systems.
- Demands cross-team standardization of cell densities, adherence times, and development intervals.
- May require adaptation of assay variables for different genetic backgrounds or model systems.
- Dependent on precise control of exogenous factor delivery and environmental conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Observe the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Time-lapse Microscopy
2:14
cAMP Pulsing of Dictyostelium discoideum Cells During Starvation
3:54
Induction of Dictyostelium discoideum Development Through Exposure to Conditioned Medium
5:32
Results: cAMP Pulses Rescue the Early Developmental Defect of corA- Dictyostelium discoideum
6:45
Conclusion
