Name: Erken Açlık Tepki Koronin A Fonksiyonu incelenmesi Dictyostelium discoideum Toplama Tahliller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Keşfedin, Dictyostelium discoideum'da Coronin A bağımlı erken açlık yanıtını toplanma testleriyle nasıl araştırılacağını. Bu yöntem, gelişimsel biyolojide sinyal yollarını ve çok hücreli geçişi incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Suşlar ve reaktifler için Dictyostelium Stok Merkezi'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı ve Basel Kantonu'ndan alınan hibelerle finanse edilmiştir.

<ol><li> Time-lapse mikroskobu ile Dictyostelium discoideum erken açlık yanıtı gözlemlemek. <ol><li> HPO 4 5 g proteoz pepton, 5g thiotone e pepton, 10 g glukoz 5 g maya özütü, 0.35 g 2 Na: 1 L için HL-5 ortamı (ihtiva eden bir Erlen bölgesi DH1.10 hücreleri ya da CORA-eksikli hücrelerin büyümesine * 7H 2 O, 0.35 gr KH 160 rpm&#39;lik bir rotasyon ile bir çalkalama inkübatöründe 22 ° C&#39;de 2 PO 4, 0.05 g dihidrostreptomisin-sülfat, pH 6.6). 0.01 x 10 6 hücre / ml ve 2 x 10 6 hücre / ml arasında bir yoğunlukta hücreler tutun. </li><li> Hasat log-faz büyüyen DH1.10 hücreleri 21 ya da 22 ° C &#39;de HL-5 orta kültür çalkalama yetiştirilen CORA-eksikli hücrelerin DH1.10 arka oluşturulan 10, hücre toplama inceleyin. Bunu yapmak için, 400 x g&#39;de 3 dakika boyunca hücreler (genellikle 10 ila 50 mi), santrifüj, uygun miktarda almak ve BSS (10 mM NaCI, 10 mM KCl hücreler iki kez yıkayın, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5). </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Daha sonra, (5, 10, 20, ya da 40) bir yoğunlukta plaka hücreleri 24 oyuklu bir plaka içerisinde 10 4 hücre / cm2 x. bunları BSS 22 ° C de 1 saat yapışmaya izin verin. </li><li> Görüntüleri her 135 sn alarak, 10 daha önce açıklandığı gibi zaman atlamalı mikroskobu ile toplanmasını gözünüzde canlandırın. kurmak 5X objektif ve uygun yazılım tarafından otomatik bir elektron-çarparak şarj çiftli aygıt kamera ile donatılmış bir canlı hücre görüntüleme kullanarak (Malzeme Tablo). </li></ol></li><li> açlık sırasında Diktiyostelyum diskodeyum hücrelerinin cAMP nabız gibi atan. <ol><li> Hücrelerin hasat tarafından DH1.10 hücreleri 21 veya DH1.10 Cora -açıklı hücrelerin 10 gelişimine dışarıdan uygulanan cAMP darbelerinin etkisini incelemek. Bunu yapmak için, 400 x g&#39;de 3 dakika boyunca, uygun hücre miktarı (genellikle 10 ila 50 mi), santrifüj almak ve BSS içinde iki kez yıkayın. </li><li> couBSS 1 x 10 7 hücre / ml bir yoğunluğa hücreler bir hemasitometre kullanılarak ve tekrar süspansiyon nt hücreleri. bakliyat uygulamadan önce 2 saat boyunca 22 ° C &#39;de kültür (160 rpm) çalkalayın. Bir zamanlayıcı kontrollü peristaltik pompa kullanılarak cAMP darbeleri ekleyin. 5 saatlik bir süre boyunca 5 sn darbe 50 nM cAMP (son konsantrasyon) 15 ul, her 6.5 dakikada bir Pompayı programlayın. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Daha sonra, (5, 10, 20, ya da 40) bir yoğunlukta hücreler plaka 24 oyuklu bir plaka içerisinde 10 4 hücre / cm 2 x. BSS 1 saat yapışmaya izin verin. </li><li> 5X objektif kullanılarak parlak alan mikroskopi ile 22 ° C de 16 saat sonra toplama görselleştirme. </li></ol></li><li> Durumunu ortama maruz kalma ile Dictyostelium discoideum gelişme indüksiyonu. <ol><li> 22 tarif edildiği gibi, taze koşullu ortam hazırlar. Kült sallayarak gelen log-faz DH1.10 hücreleri 21 veya DH1.10 Cora -açıklı hücreleri 10 topla400 x g&#39;de 3 dakika boyunca bir pipet, santrifüj kullanılarak 22 ° C&#39;de HL-5 ortamı ile etmiş olur ve PBM hücreleri üç defa yıkamak (0.02 M potasyum fosfat, 10 uM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 6.1). </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın mi, 1 x 10 7 hücre / yoğunluğunda PBM bu tekrar süspansiyon ve 110 rpm / 22 ° C&#39;de 20 saat süre ile çalkalanır. </li><li> 3 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj işleminden sonra koşullu ortam toplayın ve 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 8000 x g&#39;da santrifüjleme ile belirler. </li><li> 0.45 um&#39;lik bir filtreden filtre koşullu ortam (Malzeme Tablo) ve PBM üç kat seyreltilir. </li><li> (5, 10, 20, ya da 40) bir yoğunlukta bir hemasitometre ve plaka kullanarak hücreleri sayın 24 oyuklu bir plaka içerisinde 10 4 hücre / cm2 x. bunları 22 ° C de 1 saat yapışmaya izin verin. </li><li> önceden hazırlanmış uygulanmış madde ile hücre değişimi yüzer. </li><li> toplama a görselleştirmek5X objektif kullanarak parlak alan mikroskobu ile fter 16 saat. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Weijer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+cell+movement+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic cell movement in Dictyostelium.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).</li>
<li>Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+discoideum%3A+a+model+system+for+cell-cell+interactions+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development.</a> Science. 245, 1054-1058 (1989).</li>
<li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signal+transduction+pathways+regulating+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum.</a> Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).</li>
<li>Clarke, M., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSF+and+CMF%2C+autocrine+factors+that+regulate+gene+expression+during+growth+and+early+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium.</a> Experientia. 51, 1124-1134 (1995).</li>
<li>Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Aggregation+in+Dictyostelium+discoideum+by+an+External+Periodic+Pulse+of+Cyclic+Adenosine+Monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate.</a> Science. 175, 333-335 (1972).</li>
<li>Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cyclic+AMP+in+Dictyostelium+discoideum+and+Polysphondylium+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum.</a> Nature. 224, 1211-1212 (1969).</li>
<li>Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analyses+of+gene+regulation+during+early+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum.</a> Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).</li>
<li>Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+signals+induce+cell+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).</li>
<li>Mann, S. K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+regulation+of+early+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum%3A+mediation+via+the+cell+surface+cyclic+AMP+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor.</a> Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).</li>
<li>Vinet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+multicellular+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum+is+regulated+by+coronin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A.</a> Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).</li>
<li>Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holistic+phylogeny+of+the+coronin+gene+family+reveals+an+ancient+origin+of+the+tandem-coronin%2C+defines+a+new+subfamily%2C+and+predicts+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function.</a> BMC Evol Biol. 11, 268(2011).</li>
<li>Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+guard%3A+coronin+proteins+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity.</a> Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).</li>
<li>Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+Leukocyte+Plasma+Membrane+with+the+Actin+Cytoskeleton+through+Coiled+Coil-mediated+Trimeric+Coronin+1+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules.</a> Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).</li>
<li>Kammerer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+trimerization+motif+controls+the+topology+of+short+coiled+coils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).</li>
<li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronins%3A+the+return+of+the+crown%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coronins: the return of the crown.</a> Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).</li>
<li>Jayachandran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin+1+Regulates+Cognition+and+Behavior+through+Modulation+of+cAMP%2FProtein+Kinase+A+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling.</a> PLoS Biol. 12, e1001820(2014).</li>
<li>Suo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin-1+is+a+neurotrophin+endosomal+effector+that+is+required+for+developmental+competition+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival.</a> Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).</li>
<li>Mueller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+survival+through+coronin-1-mediated+generation+of+inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate+and+calcium+mobilization+after+T+cell+receptor+triggering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering.</a> Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).</li>
<li>de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin%2C+an+actin+binding+protein+of+Dictyostelium+discoideum+localized+to+cell+surface+projections%2C+has+sequence+similarities+to+G+protein+beta+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits.</a> EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).</li>
<li>Shina, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+unique+roles+of+coronin+proteins+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).</li>
<li>Cornillon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phg1p+is+a+nine-transmembrane+protein+superfamily+member+involved+in+dictyostelium+adhesion+and+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).</li>
<li>Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+80+x+10%283%29+Mr+protein+mediates+sensing+of+cell+density+and+the+onset+of+development+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium.</a> Development. (112), 269-278 (1991).</li>
<li>Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteinous+factor+mediating+intercellular+communication+during+the+transition+of+Dictyostelium+cells+from+growth+to+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+science%22%5BJournal%5D)">A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation.</a> Zoological science. 12, 61-69 (1995).</li>
<li>Mehdy, M. C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+factor+and+cyclic+AMP+jointly+regulate+cell-type-specific+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum.</a> Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).</li>
<li>Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+density-sensing+factor+controls+development+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A density-sensing factor controls development in Dictyostelium.</a> Genes Dev. 6, 390-400 (1992).</li>
<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Dev Biol. 391, 1-16 (2014).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Koronin proteinler ökaryotik dalının en takson bulunurlar. Dictyostelium discoideum Koronin bir memeli Koronin 1 homologu hücreler erken gelişim sırasında çekiş merkezleri oluşturmak mümkün değildir bir eksikliği Koronin yana erken açlık yanıt olarak katılır döngüsü 10. nicel ve doğru bir suşları arasında gelişiminde gecikme değerlendirmek mümkün, otomatik sahne denetleyicisi ile bir mikroskop canlı hücre görüntüleme set-up önemli bir araçtır. D. diskodeyum ömrü ...

Proteinlerin Koronin aile çok ökaryotlarda boyunca muhafaza edilir. Bu proteinler, bir amino-terminali triptofan-aspartat (WD) tekrar-ihtiva eden bir karboksi-terminal halkalaştırılmış halka etki 13,14 bağlı eşsiz bir bölgesi takip bölge (Şekil 1) bulunması ile karakterize edilir. Coronins iskelet düzenlemesi ve sinyal iletimi 12 de dahil olmak üzere hücresel fonksiyonların çeşitli implike edilmiştir. Memelilerde, altı adede kadar kısa Koronin molekülleri (Koronin 1-6) ve 7 Koronin bir tandem, 12,15 birlikte ifade edilebilir. Koronin 1 üzerinde en çok çalışılan aile üyesi ve patojen yok, T hücre hayatta kalma ve nöronal sinyal dahil olduğu gösterilmiştir. Nasıl, tam, Koronin 1 bu faaliyetleri yürütmektedir belirsizliğini koruyor. 1 Koronin Ca 2+ ve cAMP bağımlı sinyal yanı sıra F-aktin olarak hücre iskeleti modülasyonu 16-18, potansiyel işbirliği düzenleyen gösterilmiştir ikenMemelilerde kadar 7 aile üyelerinin -Anlatım zorlu nedeniyle potansiyel işten çıkarmalara, bu sistemlerdeki coronins moleküler fonksiyonunu incelemek için yapmıştır. Memeli organizmalardan farklı, alt ökaryot Diktiyostelyum diskodeyum görünüşte olmayan gereksiz fonksiyonları 15,19,20 ile sadece iki Koronin aile üyelerini (Koronin A, memeli Koronin 1 ve Koronin B ortologunu, memeli Koronin 7 ortologu) ifade eder. Bu durum, Dictyostelium discoideum coronins fonksiyonu çalışma güçlü bir model haline getirir. Dictyostelium discoideum&#39;da Koronin A&#39;nın rolünü incelemek için, 10 Koronin barındırmayan vahşi tipli hücreler veya hücre kullanılarak dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS) tampon içeren doku kültürü plakaları içinde açlık gelişim döngüsü neden olmuştur. Biz Koronin A eksik hücreler açlık üzerine çok hücreli agrega oluşturmak mümkün olduğunu bulmuşlardır. Bu fenotip doğru kantitatif bir değerlendirme içinBu protokol açıklanan otomatik canlı hücre görüntüleme önemli bir araçtır. Bir Koronin eksik hücrelerin erken açlık tepkisinin başlamasında kusur cAMP çağlayan yukarı bir eylemleri Koronin düşündüren, cAMP bakliyat tedarik tarafından kurtarıldı edilebilir. Gelişiminin başlaması simüle etmek için, cAMP darbelerinin egzojen uygulaması son 8,9 çeşitli laboratuarlar tarafından kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu prosedür, aynı zamanda, hücre yoğunlukları ve zamanlaması büyük ölçüde bağlı olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, burada açıklanan protokol tekrarlanabilirliği yüksek derecede garanti altına almak için, bu bir değişkenliğe azaltmayı amaçlamaktadır. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalarda kullanılan teknikler Dictyostelium discoideum gelişimsel döngüsünün erken evrelerinde proteinlerin işlevleri araştırmak için güçlü araçlar sağlar ve yukarı tespit hem de bir işlevi Koronin aşağı doğru efektör potansiyeline sahiptir.

<table><tbody><tr><td>HL-5 ortamı (1 L için: 5 g proteoz pepton, 5 g tiyoton E pepton, 10 g glikoz, 5 g maya özütü, 0,35 g Na2HPO4*2H2O, 0,35 g KH2PO4, 0.05 g dihidrostreptomisin-sülfat, pH 6.6)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Proteoz pepton</td><td>BD Bioscience</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Tiyoton E pepton</td><td>BD Bioscience</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>BD Bioscience</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>AppliChem</td><td>A3666</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 * 2H 2O</td><td>Fluka</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td></td></tr><tr><td>dihidrostreptomisin-sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1954000</td><td></td></tr><tr><td>PBM (0.02 M potasyum fosfat, 10 &; M CaCl2 ve l mM MgCl2, pH 6.1)</td><td></td><td></td> <td>kendi kendine yapılan</td></tr><tr><td>BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5)</td><td></td><td></td> <td>kendi kendine yapılan</td></tr><tr><td>0.45-&mu; m Filtropure S filtre</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 oyuklu Doku kültürü plakası</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1H</td><td></td></tr><tr><td>Cellobserver mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td>özel yapım</td></tr><tr><td>AxioVision yazılımı</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPC Mikroişlemci&ndash; kontrollü dağıtım pompası</td><td>ISMATEC</td><td>ISM 931</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 135M mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>491237-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>İnkübasyon Çalkalayıcı</td><td>Inforst HT Minitron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erken açlık tepki koronin a fonksiyonu incelenmesi<em&gt; dictyostelium discoideum</em&gt; toplama tahliller

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Dictyostelium discoideum amiplerin beslenen toprak bulunur. Besin kaynakları kıt hale geldiğinde, tek hücre toplama merkezlerine 1-4 doğru chemotax sırasında bir çok hücreli geliştirme programını başlatmak için faktörleri salgılar. Bu işlem, siklik adenozin monofosfat (cAMP) 5 serbest bağlıdır. cAMP adenilat siklaz ve fosfodiesterazlarm birlikte hareket dalgasından üretilen ve G protein-eşli reseptör cAMP 6,7 ile bağlanır. Yaygın olarak kullanılan deney, daldırılmış koşullar 8,9 hücre toplanmasının gözlemine dayanır Alt düzey ökaryot Dictyostelium discoideum gelişimsel döngüsünde yer alan mekanizmaların analiz etmek. Bu protokol, dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS) 10 içine daldırılmış doku kültürü plakaları içinde açlık gelişim döngüsünde Koronin A rolünün analizine açıklanmaktadır. Koronin bir yaygın korunmuş pr üyesidirfaaliyetleri 11,12 çeşitli suçlanmıştır coronins bir otein ailesi. A Koronin eksik Dictyostelium hücreleri çok hücreli agrega oluşturamamaktadırlar ve bu kusur düşündüren, cAMP bakliyat tedarik tarafından kurtarıldı olabilir üst baş eylemleri Koronin cAMP 10 basamakla. Bu çalışmalarda tarif edilen teknikler cAMP kaskadının yukan Dictyostelium discoideum gelişimsel döngüsünün ilk aşamalarında proteinlerin işlevleri araştırmak için güçlü araçlar sağlar. Bu nedenle, bu toplama tahlil kullanan bir fonksiyon Koronin ve daha fazla çalışma izin ve Koronin biyoloji anlayışımızı ilerleyebilir.

Erken gelişme bir gösterisi bir kusur Koronin eksik hücreleri (Şekil 2). Bir hücre Koronin yokluğunda Dictyostelium discoideum gelişim devri sırasında ilk adımdır çok-agregatlar oluşturmak için mümkün değildir. Bu nedenle, Koronin erken açlık yanıtı ve / veya cAMP sinyali sırasında önemli bir rol oynadığı görülmektedir. Gerçekten de, Koronin A&#39;nın olmaması çok hücreli agrega oluşumunun olmaması, indirgenmiş cAMP 10 sinyal eşlik eder. Bununla birli...

Sosyal amip Dictyostelium discoideum açlıktan öldüğünde gelişimsel olarak çok hücreli bir organizmaya geçiş yapar. Evrimsel olarak korunmuş protein koronin A, gelişimin başlangıcında çok önemli bir rol oynar. Agregasyon testlerini ana yöntemimiz olarak kullanarak, koronin A'nın erken gelişimdeki rolünü aydınlatmayı amaçlıyoruz.

Erken Açlık Tepki Koronin A Fonksiyonu incelenmesi<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Toplama Tahliller

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Bu deneysel prosedürün genel amacı, Dictyostelium discoideum'un Coronin-A bağımlı erken açlık tepkisini incelemektir. Bu yöntem, Dictyostelium discoideum'un erken gelişiminde yer alan sinyal yolaklarının ve faktörlerin tanımlanması gibi Gelişimsel Biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gelişimi tetikleyen faktörlerin ve erken gelişimsel sinyalleşmede görev alan proteinlerin otomatik ve yüksek kapasiteli taraması için bir araç sağlama potansiyeline sahip olmasıdır.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler; hücre yoğunlukları, yapışma süresi ve gelişim süresi gibi deneye özgü çok sayıda değişken nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Bu prosedüre başlamak için DH1.10 hücrelerini veya corA-eksik hücrelerini, HL-5 besiyeri içeren bir Erlenmeyer balonunda, 22 °C'de, 160 rpm hızında çalışan bir çalkalamalı inkübatörde büyütün. Hücreleri mililitre başına 1×10⁴ ile 2×10⁶ hücre arasındaki bir yoğunlukta tutun.Hücre agregasyonunu incelemek için, logaritmik büyüme fazındaki 10 ila 50 mililitre DH1.10 hücresini veya DH1.10 arka planında oluşturulmuş corA-eksik hücrelerini hasat edin. Bunları 400 ×g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından hücreleri iki kez BSS ile yıkayın.Ardından hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın. Sonrasında, hücreleri 24 kuyucuklu bir plakaya ekin. BSS içerisinde 22 degrees Celsuis sıcaklıkta bir saat boyunca yapışmalarını bekleyin.Ardından, hücre agregasyonunu time-lapse mikroskopi ile görselleştirin ve her 135 saniyede bir görüntü alın. Dışarıdan uygulanan siklik AMP pulslarının DH1.10 hücrelerinin veya corA-eksik DH1.10 hücrelerinin gelişimi üzerindeki etkisini incelemek için, 10 ila 50 mililitre hücre toplayın ve bunları 400 ×g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Bundan sonra, hücreleri BSS ile iki kez yıkayın.Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın. Ardından, hücreleri BSS içerisinde 1x10⁷ hücre/mL yoğunluğa gelecek şekilde yeniden süspanse edin. Daha sonra, darbeler uygulamadan önce kültürleri 22 °C'de, 160 rpm hızla iki saat boyunca çalkalayın.Ardından, zamanlayıcı kontrollü bir peristaltik pompa kullanarak siklik AMP pulsları uygulayın. Pompayı, beş saatlik bir süre boyunca her altı buçuk dakikada bir beş saniyelik siklik AMP pulsu verecek şekilde programlayın. Kritik bir adım, siklik AMP enjeksiyon ucunun çözeltiye sürekli olarak daldırılmadığından, yalnızca çalkalayıcı tarafından oluşturulan dalgalarla periyodik olarak daldırıldığından emin olmaktır.Siklik AMP uygulamasından sonra, hücreleri bir hemositometre kullanarak tekrar sayın. Ardından, hücreleri 24 kuyucuklu bir plakaya ekimleyin ve BSS içerisinde bir saat boyunca yapışmalarına izin verin. 16 saat sonra, hücre agregasyonunu 22 °C'de, beş x objektifli parlak alan mikroskobu ile görüntüleyin.Bu prosedürde, 22 °C'de HL5 besiyerli çalkalamalı kültürlerden log fazındaki DH1.10 hücrelerini veya DH1.10 corA-eksik hücrelerini toplayarak taze kondisyonlu besiyeri hazırlayın. Hücreleri 400 ×g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, hücreleri PBM ile üç kez yıkayın.Ardından, hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın. Daha sonra, hücreleri mililitrede 1 × 10⁷ hücre yoğunluğunda PBM içinde yeniden süspande edin ve 22 °C'de 110 rpm'de 20 saat boyunca çalkalayın. Sonra, hücreleri 400 ×g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından kondisyonlu medyumu toplayın. Sonrasında, medyumu 4 °C'de 8.000 ×g'de 15 dakika santrifüjleyerek berraklaştırın.Ardından, kondisyonlu medyumu 0.45 mikrometrelik bir filtreden süzün ve PBM ile üç kat seyreltin. Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın, 24 kuyucuklu bir plakaya ekleyin ve 22 °C'de bir saat boyunca yapışmalarını bekleyin. Sonrasında, hücrelerin süpernatantını önceden hazırlanmış kondisyonlu medyum ile değiştirin.16 saat sonra, beş x objektif kullanarak parlak alan mikroskopisi ile hücre agregasyonunu görselleştirin. Burada, Coronin-A eksikliği olan hücreler, erken gelişimde bir kusur sergilemekte ve Dictyostelium discoideum gelişim döngüsünün ilk adımı olan çok hücreli agregatlar oluşturamamaktadır. Bu şekilde, vejetatif Vahşi tip ve corA eksikliği olan hücreler yıkanmış ve süspansiyon içinde beş saat boyunca, her altı buçuk dakikada bir, 15 animal veya cyclic AMP ile veya bunlar olmadan pulse edilmeden önce iki saat boyunca aç bırakılmıştır.Ekzojen siklik AMP palslarının uygulanması, Yaban tip fenotipini tamamen geri kazandırmıştır. Bu şekilde, eksponansiyel olarak büyüyen Yaban tip ve corA-eksik hücreler PBM ile yıkanmış, çok kuyucuklu plakalara ekilmiş ve Yaban tip veya corA-eksik açlık çeken hücrelerden elde edilen kondisyonlu medyumlarda inkübe edilmiştir. Görüntüler, hücrelerin ekilmesinden 16 saat sonra alınmıştır.corA-eksik Dictyostelium discoideum, gelişimsel indüksiyon için gerekli tüm faktörleri üretebilmiş ancak bunlara yanıt verememiştir. Bu teknik bir kez kavrandığında, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde inkübasyon süresi dahil olmak üzere 20 saatte tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, farklı suşlar için hücre yoğunlukları, yapışma süresi ve gelişim süresi gibi analizin birden fazla değişkeninde ayarlama yapılmasının gerekeceğini unutmamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, Dictyostelium discoideum'un erken açlık yanıtında yer alan faktörleri tanımlamak amacıyla biyokimyasal fraksiyonlama ve ardından proteomik analiz gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, kondisyonlu ortamlar veya döngüsel AMP darbeleri kullanılarak, daldırma koşulları altında Dictyostelium discoideum'da erken gelişimin nasıl indükleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olunmalıdır.

investigating-function-coronin-early-starvation-response

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi incelemek için, genetik olarak izlenebilir metazoan Caenorhabditis elegans'ı model sistem olarak kullanarak, protein disfonksiyonunu, hücredeki protein lokalizasyonunu ve organizma, hücresel ve protein seviyelerinde protein stabilitesini takip ederek protein katlanmasındaki değişiklikleri izledik.

Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Bu çalışma, asidik pH koşulları altında E. coli HdeB bir şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için, biyofiziksel, biyokimyasal ve moleküler teknikler tarif eder. Bu yöntemler, örneğin başarılı bir şekilde HdeA gibi diğer asit koruma şaperonlar için uygulanmış ve diğer şaperonlar ve stres koşullarında çalışmak için modifiye edilebilir.

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Sosyal amip Dictyostelium discoideum, yakın zamanda protein yanlış katlanması ve proteostazı incelemek için bir sistem olarak kurulmuştur. Burada, D. discoideum'da sıcaklığa bağlı protein agregasyonunu ve hücresel stres tepkisini incelemek için yeni bir görüntüleme tabanlı metodoloji açıklıyoruz.

Protein Kalite Kontrol Sistemi incelenmesi<em&gt; D. diskodeyum</em&gt; Sıcaklık kontrollü Canlı Hücre Görüntüleme kullanarak

Burada akut mekanik stimülasyon hücresel yanıt değerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Mikroskopi tabanlı tahlil fluorescently etiketli biyosensörler kesme akışı ile kısa stimülasyon takip yerelleştirilmesini inceleyin. Ayrıca akut mekanik stimülasyon karşılık olarak ilgi çeşitli proteinlerin aktivasyonu biyokimyasal olarak test ediyoruz.

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Burada sunulan yöntem model organizma C. elegansnormal yaşlanma sırasında protein toplama keşfetmek için hedeftir. Protokolü temsil eden yaş ile oluşturmak son derece çözünmez büyük toplamları çalışmaya ve nasıl protein toplama proteostasis değişiklikleri etkisini belirlemek için güçlü bir araç.

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

Macropinocytosis, büyük ölçekli özel olmayan sıvı alımı, klinik biyoloji İmmünoloji, enfeksiyon, kanser ve nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere birçok alanda önemlidir. Burada, mevcut teknikleri macropinocytosis model organizma Dictyostelium discoideum kullanarak macropinocytosis ölçümü akış sitometresi yüksek üretilen iş, tek hücreli çözümleme'ye izin için adapte edilmiştir.

Dictyostelium discoideum Macropinocytosis akış sitometresi tarafından yüksek üretilen iş ölçümü

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Bu protokol, proteotoksik antimikrobiyal ile tedaviden sonra Escherichia coli'den agrega ve çözünür proteinlerin çıkarılmasını ve görselleştirilmesini açıklar. Bu prosedürün ardından, farklı bakteri suşlarında ve/veya tedaviler arasında in vivo protein agrega oluşumunun nitel bir karşılaştırmasına izin verir.

Proteotoksik Stresör ile Escherichia coli Tedavisinden Sonra Protein Agregalarının Ekstraksiyonu ve Görselleştirilmesi

Aşağıdaki protokol, proteostazdaki değişikliklerin bir değerlendirmesi olarak poliglutamin agregalarını ölçmek için solucan kültürleme, floresan görüntüleme ve otomatik görüntü işleme için yüksek verimli bir iş akışının geliştirilmesini ve optimizasyonunu açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ta protein agregasyon kinetiğinin analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yaş senkronize edilmiş bir popülasyondan gelen hayvanlar farklı zaman noktalarında görüntülenir, ardından CellProfiler'da yarı otomatik dahil etme sayımı ve AmyloFit'teki matematiksel bir modele uyar.

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Keşfedin, Dictyostelium discoideum'da Coronin A bağımlı erken açlık yanıtını toplanma testleriyle nasıl araştırılacağını. Bu yöntem, gelişimsel biyolojide sinyal yollarını ve çok hücreli geçişi incelemek için kullanılır.

Erken Açlık Tepki Koronin A Fonksiyonu incelenmesi

Daha fazla video keşfet