Kardiyomiyosit DNA Sentezi ve ploidinin Eşzamanlı Değerlendirme: Bir Yöntem kardiyomiyosit Yenilenme ve ciro miktarının belirlenmesi Yrd

Bu protokolün genel amacı, çekirdeklerin poliploidizasyonunu hesaba katarken neo kardiyomiyosit çekirdeklerini ölçmek için uzun vadeli nükleosit etiketleme ve akış sitometrisi kullanarak kardiyomiyosit döngüsünü ölçmektir. Bu yöntem, kardiyomiyosit rejenerasyonu alanındaki temel soruları ele almak için kullanılabilir ve kardiyomiyosit oluşumunun dinamiklerindeki değişiklikleri ölçmek için bir tarama aracı olarak kullanılabilir. Bu protokolün ana avantajı, hücresel kaynaktan bağımsız olarak ve poliploidasyonu kontrol ederek neo kardiyomiyosit oluşumunun hassas ve doğru bir şekilde ölçülmesine izin vermesidir.

Altıncı EdU enjeksiyonundan 24 saat sonra, tedavi edilen hayvanı sırtüstü pozisyona getirin ve orta karın bölgesinden diyaframa kadar bir cilt kesisi yapmak için cerrahi makas kullanın. Daha sonra, sternumu vücut boşluğundan uzak tutarak, kalbi açığa çıkarmak için diyaframı iki taraflı olarak kesin. Daha sonra kalbi hafifçe kaldırın ve kalbi göğüs boşluğundan ayırmak için çıkış yolunun ana kan damarlarını kesin.

Hasattan hemen sonra, kalpleri dört santigrat dereceye kadar soğutulmuş 10 mL PBS içeren 15 mL'lik ayrı santrifüj tüplerine yerleştirin. Daha sonra numuneleri ayrı ayrı 10 cm'lik petri kaplarına aktarın ve her bir kalbi sagital yönde iki parçaya kesmek için bir neşter kullanın. Sonra, kalp parçalarını bir çift forseps ile hafifçe sıkın.

Her iki kalp parçasını da çıkarın ve 20 mL taze PBS içeren bir petri kabına koyun. Yeni bir petri kabı ve 20 mL taze PBS ile bir kez daha tekrarlayın. Kalbin her iki parçasını da aynı 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve kalp işlendiğinde kapağın açılmasını önlemek için her tüpün kapağında küçük bir delik açmak için 25 gauge bir iğne kullanın.

Daha sonra her bir tüpü etiketleyin ve kalp dokularını sıvı nitrojen dolu bir kapta dondurun. Analiz edilecek her kalp için, bir ultra santrifüj tüpünde yüzde bir BSA ve PBS'nin 36 mL'sini inkübe edin. Çözeltiyi 30 dakika sonra atın.

Tüpler havayla kuruduğunda, her tüpe 10 mL sükroz gradyan çözeltisi ekleyin. Sıvı nitrojen donmuş kalp örneklerini neşter ile ayrı ayrı kıydıktan sonra, her kalpten alınan doku parçalarını 15 mL hücre lizis tamponu içeren ayrı ayrı 50 mL konik tüplere aktarın. Numuneleri oda sıcaklığında bir prob homojenizatörü ile 25.000 rpm'de 15 saniye boyunca homojenize edin.

Daha sonra her tüpe 15 mL daha lizis tamponu ekleyin ve numuneleri büyük bir boşluk havaneli ile her seferinde bir 40 mL dounce'a aktarın. Havaneli ile 10 vuruş yapın ve hücre bulamaçlarını 100 mikronluk bir süzgeçten süzün, ardından 40 mikronluk bir hücre süzgecinden ayrı 50 mL'lik santrifüj tüplerine süzün. Daha sonra nükleer kardiyak peletleri santrifüjleme ile toplayın ve hücreleri her biri 25 mL sükroz gradyan çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.

Hücreleri, hazırlanan ultra santrifüj tüplerinde çekirdek içermeyen sükroz gradyanının üzerine yerleştirin ve katmanları açılır bir tüp rotoru kullanarak santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, çekirdek peletlerini 1.300 mikrolitre çekirdek depolama tamponunda yeniden süspanse edin ve çekirdekleri PCM1 etiketli 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. PCM1 tüplerinden her süspansiyonun 300 mikrolitresini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 700 mikrolitre taze çekirdek depolama tamponu ekleyin ve ISO kontrolünü etiketleyin.

Daha sonra, PCM1 çekirdeklerini anti-PCM1 antikoru ile ve ISO kontrol çekirdeklerini hızlı IGG izotip kontrol antikoru ile gece boyunca dört santigrat derecede etiketleyin. Ertesi gün, numuneleri döndürün ve aynı koşullar altında ikinci bir santrifüjleme için peletleri bir mL taze çekirdek depolama tamponunda yeniden süspanse edin. İkinci döndürmeden sonra, peletleri bir mL taze çekirdek depolama tamponunda yeniden süspanse edin ve çekirdekleri, karanlıkta dört santigrat derecede bir saat boyunca bir keçi anti kuduz IGG antikorundan bir mikrolitre uygun konjuge F (ab'2 fragmanı ile inkübe edin.

EdU dahil etme derecesini değerlendirmek için, PCM1 ve ISO kontrol etiketli çekirdek süspansiyonlarını santrifüjleyin ve peletleri art arda iki yıkama için iki kez bir mL %1 BSA PBS'de yeniden süspanse edin. İkinci yıkamadan sonra, süpernatanı 100 mikrolitre EdU fiksatif ile değiştirin ve numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Fiksasyonun sonunda, çekirdekleri bir mL PBS BSA'da iki kez daha yıkayın, ardından numuneleri oda sıcaklığında 100 mikrolitre saponin bazlı permeablizasyon solüsyonu ile inkübe edin.

15 dakika sonra, oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için her tüpe 500 mikrolitre taze hazırlanmış EdU etiketleme kokteyli ekleyin. İnkübasyonun sonunda, ikinci iki santrifüjleme sırasında çekirdekleri bir mL PBS BSA'da yıkayarak numuneleri üç kez döndürün. Son olarak, numuneleri 400 mikrolitre DNA boyama solüsyonu ile etiketleyin.

Darbeli kalplerin immünohistolojik analizi, EdU içeren kardiyomiyositleri eksprese eden PCM1'in varlığını göstermektedir. Bununla birlikte, immünohistolojik yöntemler kullanılarak elde edilen veriler, EdU içeren diğer hücre tiplerinin kardiyomiyositler olarak yanlış tanımlanabilmesi nedeniyle yanlış yorumlanabilir. MDX ve kontrol fareleri üzerinde yapılan bir çalışmada, bu protokolde detaylandırılan akış sitometrisi analizi, neo kardiyomiyosit nükleer üretiminin hızlı bir şekilde ölçülmesini sağlarken, aynı zamanda EdU'yu depoliploidizasyona dahil eden hücreleri de hariç tutar.

Daha önce yayınlanmış verilere benzer şekilde, bu temsili deneyde, mdx fare kalplerinde neo kardiyomiyosit çekirdeği oluşum oranlarında, yaşa uygun kontrollere kıyasla bir artış gözlendi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki gün içinde dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, analiz sırasında kapıların doğru bir şekilde ayarlanabilmesi için hem EdU hem de PCM1 negatif kontrollerini hatırlamak önemlidir.

Bu teknik aynı zamanda, nükleosit katılımının bir dizi farklı kardiyak hücre tipinde ölçülmesine izin veren bir dizi ek aşağı akış immünohistolojik teknikle de uyumludur. Bu teknik, kardiyovasküler araştırma alanında, iskemik olmayan kardiyomiyopatinin mdx modelinde kardiyomiyosit rejenerasyonundaki değişiklikleri incelemek için kullanılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, neo kardiyomiyosit çekirdeklerinin nasıl hızlı bir şekilde ölçüleceğini iyi anlamalı, kardiyomiyosit rejenerasyonu ve döngüsündeki değişiklikleri taramak için poliploidasyon sayımını izlemelisiniz.