için yiyecek arama yolu uzunluğu Protokolü Drosophila melanogaster Larva

Bu testin genel amacı, Drosophila larva davranışının lokomotor bileşenini ölçmektir. Bu yöntem, larva davranışındaki bireysel farklılıklara genetik ve çevresel katkılar hakkında davranış genetiği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, hızlı olması, tekrarlanabilir olması ve büyük numune boyutlarının toplanmasına izin vermesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan insanlar mücadele edebilir, çünkü testin başarısı gelişimsel zamanlamaya ve test hayvanlarının tutarlı, dikkatli bir şekilde ele alınmasına bağlıdır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdaki yüksek lisans öğrencileri Ina Anreiter ve Oscar Vasquez olacak. Altı onsluk plastik sinek kültürü şişesinin bir tarafına delikler açarak tutma şişesini hazırlayın.

Daha sonra, Petri kabı kapaklarını önceden hazırlanmış üzüm suyu ortamıyla doldurmak için bir şırınga kullanın, üzüm suyu ortamının yüzeyi kapağın dudağının üzerinde bir kubbe oluşturana kadar. Üzüm tabaklarını nemli ve hava geçirmez bir kapta dört santigrat derecede iki haftaya kadar saklayın. Önceden hazırlanmış 40 mililitre sinek yemini 100 x 15 milimetre Petri kabına dökün.

Larvaları test etmek için on santimetre çapında on dairesel oyuklu ve ikiye beş tasarımda düzenlenmiş üç siyah Pleksiglas plaka ve maya macununu Pleksiglas plakalara yaymak için kullanılan siyah bir Pleksiglas yayıcı elde edin. Ardından, kapakları Petri kaplarının altlarından ayırın. 100 ila 150 kadın ve 50 ila 75 erkek toplayın.

Dişilerin ve erkeklerin, standart sinek yemi ile altı onsluk bir sinek kültürü şişesinde gece boyunca çiftleşmesine izin verin. Sinekleri bir tutma şişesine aktarın ve şişenin üstüne az miktarda taze maya ezmesi ile bir üzüm tabağı sabitlemek için maskeleme bandı kullanın. Yetişkinlerin üzüm tabağına yumurta bırakmasına izin vermek için üzüm tabağı altta olacak şekilde şişeyi baş aşağı bırakın.

İlk üzüm tabağını 24 saat sonra atın ve tutma şişesine yeni bir üzüm tabağı yerleştirin. 22 saat sonra, üzüm tabaklarını şişelerden çıkarın ve 60 x 15 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, tutma şişesine taze maya ezmesi ile yeni bir üzüm tabağı yerleştirin.

Bir diseksiyon probu kullanarak tüm larvaları çekirdekli üzüm plakasından temizleyin ve atın. Temizlenmiş üzüm plakalarını standart koşullarda dört saat inkübe edin. Dört saat sonra, üzüm tabaklarından suş başına 100 L1 veya ilk instar larvaları toplayın ve bunları yemek tabaklarına yerleştirin.

Larvaları, yiyeceği delmeden ve larvaları gömmeden nazikçe yiyeceğin üzerine yerleştirin. Bir seferde on larvadan oluşan gruplar toplanabilir ve yerleştirilebilir. Larvaları yemek tabağına dağıtarak kalabalıktan kaçının.

Yiyecek tabaklarını, larvaların bir pupa yeri aramak için yiyeceği terk ettiği zaman, test hayvanları dolaşmaya başlamadan on saat öncesine kadar kuluçkaya yatırın. Eğer larvalar dolaşmaya başladıysa ve burada gördüğünüz gibi Petri kabının kapağında hareket ediyorlarsa, hayvanlar test edilemeyecek kadar yaşlıdır ve gelişim sürelerinin yeniden değerlendirilmesi gerekir. Mayayı suda bire iki oranında çözün.

Bitmiş macunun damladığından ve macunun yüzeyinde hızla eriyen şeritler bıraktığından emin olun. Maya hamurunun doğru kıvamını değerlendirmek, markalar, maya partileri ve çevre arasındaki değişkenlik nedeniyle kesin oranı kullanmaktan daha önemlidir. Bir boya fırçası ile larvaları ilk suştan itibaren yemek tabağından nazikçe çıkarın.

Larvaları bir Petri kabında toplayın ve tüm yiyecekleri çıkarmak için larvaları suyla nazikçe yıkayın. Larvaları hızlı bir şekilde iki mililitre suyla yıkayın ve larvaları bir laboratuvar mendiliyle nazikçe kurulayın. Larvaları nemli bir ortamda tutun, ancak stresi önlemek için suya batırmayın.

Üç test plakasını yan yana yerleştirin ve her test plakası için beş dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın. Test plakalarının üstüne maya macunu uygulayın ve tüm kuyucukların eşit bir maya tabakasına sahip olması için her bir test plakasına ince bir maya macunu tabakası dağıtmak için yayıcıyı kullanın. Her kuyucuğun ortasına yavaşça bir larva yerleştirin.

İlk larvaları her tabağa yerleştirdikten hemen sonra beş dakikalık zamanlayıcıyı başlatın. Sonra larvaların geri kalanını kalan kuyucuklara yerleştirin. Her kuyucuğun üzerine bir Petri kabı kapağı yerleştirin.

Zamanlayıcı bittiğinde, larvaları plakadan çıkarmadan kalıcı bir işaretleyici kullanarak mayada geride kalan yol uzunluklarını izlemeye başlayın. Larvalarla aynı sıra ve hızda iz yolu uzunlukları plakalara yerleştirildi. Son olarak, her suş için larva yolu uzunluğu test adımlarını tekrarlayın.

Art arda üç günlük test boyunca toplanan veriler, gezicilerin bakıcılardan daha uzağa seyahat etmesiyle önemli bir gerinim etkisi ortaya koydu. Suş etkisine ek olarak, testten dört saat önce gıdadan mahrum bırakılan larvalar, beslenen larvalardan önemli ölçüde daha düşük yol uzunluklarına sahipti. Genel olarak, her iki suş da düşük besinli gıdalara kıyasla yüksek besinli gıdalarda yetiştirildiğinde yol uzunlukları daha uzundu.

Düzgün bir şekilde yapılırsa, bu tahlil, tek bir kişinin dört saat içinde 500'e kadar larvayı kolaylıkla test etmesine olanak tanır ve bu da onu büyük ölçekli fenotipleme için değerli kılar. Az önce gösterdiğimiz prosedürü takiben, cinsiyet, gıda yoksunluğu veya gıda kalitesi gibi diğer değişkenler, bu değişkenlerin gıda ile ilgili hareket kalıpları üzerindeki etkisini göstermek için test edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, davranıştaki bireysel farklılıklara genetik ve çevresel katkıların değerlendirilmesi için Drosophila larva gıda ile ilgili hareketin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.