Name: Fare Koroner Endotel Hücreleri İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Keşfedin fare koroner endotel hücreleri izolasyonunu görüntüleme ve moleküler biyoloji deneyleri için. Bu yöntem, yüksek verimli ve saf hücre elde edilmesini sağlayarak kardiyovasküler araştırmalara katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık (A. Makino için HL115578) National Institutes of gelen hibe ile desteklenmiştir.

fareler üzerinde araştırma Arizona Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) kurallarına göre gerçekleştirildi. Not: Bölümler 1, 2 ve 3 kurulum olarak Deneyden bir gün önce yapılmalıdır. 1. hazırlanması Çözümler <ol><li> CD31 tamponu (50 mi) <ol><li> 50 ml&#39;lik bir tüpe 50 mi 1 x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. 0.05 g Sığır Serum Albümini (BSA) ve 0.037 g etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) tartılır ve bir 50 ml tüp ekleme toz eriyene kadar 1 saat boyunca döndürmek için tüp koydu. 7.4 pH ayarlama yeni bir 50 ml tüp içine 0.2 um&#39;lik bir filtreden filtre ve kullanılana kadar 4 ° C&#39;de muhafaza edin. </li></ol></li><li> HEPES Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (500 mi) <ol><li> HBSS çözeltisi içinde 10 mM HEPES yapmak ve iyice karıştırın HEPES 1,1915 g ekleyin. pH ölçümü ve 7.4 ayarlamak. 4 filtre ve mağaza˚C. </li></ol></li><li> 1x Krebs çözeltisi (1 L), <ol><li> 1 L&#39;lik bir şişeye damıtılmış su çift 10 x Krebs çözeltisi [Tablo 1], 100 ml ilave edilir. 2.1 gr sodyum bikarbonat ve 2 g D-glikoz tartılır ve şişeye ilave edin. Karıştırın ve 1 L. toplam ses seviyesini ayarlamak </li><li> Kaput içinde 30 dakika ve filtre solüsyonu% 95 O 2/5% CO2 gazı ile kabarcık çözeltisi. 4 C&#39;de muhafaza ve deney sırasında buz üzerinde tutmak. </li></ol></li></ol> 2. Manyetik Boncuk hazırlanması <ol><li> Her 1.5 ml tüp (örnek başına bir boru) 1 ml CD31 tampon ekleyin. Koyun anti-fare IgG boncuk karışımı ve her numune [Tablo 1], uygun miktar ekleyin. kuvvetlice 30 kez tüpleri çalkalayın ve çalkalama 1 dakika süreyle manyetik plaka koyun. plaka üzerinde iken tüpler açın ve bir kovaya çözümler dökümü. </li><li> Her tüpe 1 mi CD31 tampon ekleyin. 2 ul sıçan anti-fare CD31 anti-eklemeHer tüpe gövde ve 4 ºC de tüpler O / N çevirin. </li></ol> 3. Otoklavlama <ol><li> Tüm cerrahi aletler ve pipet uçları otoklavlayın. 4 farklı çaplarda ipuçları vardır, böylece dar olan en geniş dan, pipet uçları uçlarını kesin. İpuçları için yaklaşık çapları 3 mm, 2.5 mm, 2 mm, sırasıyla 1.5 mm&#39;dir. ipuçları kesin ve 121 ºC sıcaklıkta sterilizasyon 30 dakika ile bir gün önce otoklav. Not: Bölüm 4-11, deney günü yapılmalıdır. </li></ol> 4. hazırlanması Çözümler <ol><li> M199 2% Demir-Müstahkem Buzağı Serumu (IFCS) içeren yıkama tamponu hazırlayın. görüntüleme için, 30 ml / fare hazırlamak. </li><li> enzim çözeltisi (10 mi / numune) hazırlayın. 50 ml&#39;lik bir tüp içine 0.6 birim / dispaz ml ve 1 mg / kollajenaz tip II ml tartılır. M199 ekleyin ve 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de tüp döndürün. insid yeni 50 ml&#39;lik bir tüp içine 0.2 um&#39;lik bir filtreden filtree kaput ve kullanılıncaya kadar 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> Heparin ile HBSS / HEPES hazırlayın. 15 ml&#39;lik bir tüp içinde 10 mM HEPES içeren HBSS, 10 ml ekleyin. tüpe Heparin 100 ul ekle ve kullanılana kadar 4 ° C&#39;de tutun. </li></ol> 5. Yıkama Boncuk <ol><li> 4 ° C&#39;de rotator gelen boncuklar tüpleri dışarı atın ve kaput getirmek. Manyetik plaka tüpler koyun ve 1 dakika boyunca çalkalanır. çözelti dökümü ve her tüpe 1 mL CD31 tampon eklemek. </li><li> Manyetik plaka dışında tüplerini alın ve kuvvetlice 30 kez çalkalayın. Manyetik plaka tüpler geri koymak ve 3 yıkar toplam tekrarlayın. tamamlanmasından sonra, 4C geri tüpleri koymak ve kullanılana kadar dönen tutmak. </li></ol> 6. Diseksiyon <ol><li> Kan pıhtılaşmasını önlemek için, heparin 0.1 ml intraperitonal fareler enjekte edilir. Daha sonra pentobarbital 0.01 ml intraperitoneal kullanarak fareler uyutmak, 10 dakika bekleyin. Fare duygu olup olmadığını kontrol edinayak kısma ağrı. </li><li> kafa ile bir polistiren gemide fare yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve iğneler ile silah tutun. boğazına kadar üst torakal alanda deriyi kesme forseps ve sert kesme makas kullanın. </li><li> diyaframın hemen üstünde göğüs kafesinin ortasında bir kesim olun. kalp ve akciğerler açığa bir üçgen yapmak için boğaz doğru yanlara ve yukarıya kemik kesti. diyaframın hemen üstünde aorta kesin. </li><li> çekerek olmadan forseps ile timus tutun ve birlikte akciğer ve kalp kaldırmak için dikkatlice herhangi bir bağ dokusu kesmek için makas kullanın. 1 × Krebs bir beher yer dokular, forseps ile sallamak ve 1 × Krebs ile 6 cm çanak aktarın. </li><li> makas ve forseps kullanarak akciğer lobları çıkarın. aort içine 20 G steril kateter yerleştirin. HBSS / Heparin ile koroner dolaşım sisteminde kan yıkayın. , Ventrikül küçük bir kesim yapmak kalbi sallamak ve M199 bir örnek tüpüne transfer. buz üzerinde tüpler tutun. </li></ol><p<html> class = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. Doku sindirimi <ol><li> Enzim çözeltisi, 10 ml dolu 6 cm çanak kalp transfer ve makas kullanılarak küçük parçalar halinde kıyma. 15 dakika boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde yemekler yerleştirin. Doku kolay geçmesine izin vermek için bir kesik ucuna bir ucu aşağı 30 kez yukarı pipetleme tarafından sindirilmiş malzemeleri çalkalayın. </li><li> Başka bir 15 dakika süreyle 37 ºC inkübatör geri koyun. Ajitasyon üç kez tekrarlayın, büyük açıklıklar gelen pipet uçları kullanarak her zaman dar ve her arasında 15 dakika inkübasyon için. </li><li> Son 15 dakika inkübasyondan sonra, dışarı ve kaputun içine numune almak. Pipetleyin çözüm yukarı ve pipet ucu dar açılması ile yeni bir 50 ml tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden geçmesi kullanarak aşağı 30 kere. </li><li> 10 ml&#39;lik pipet kullanarak 10 ml yıkama tamponu ile çanak yıkayın ve hücre süzgecinden üzerine aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 g&#39;de santrifüj ve spin 50 ml tüpler koyun. </li></ol>Boncuk ile itle &quot;&gt; 8. Yıkama ve Konjugasyon <ol><li> pelet bozmadan süpernatantı. iki kez 5 ml yıkama tampon maddesi ile hücreleri yıkayın. </li><li> Daha önce biri bir anda bir tüp boncuk ve çalışma ile 1.5 ml tüpler hazırlandı alın. Manyetik plaka bir 1.5 ml tüp koymak 3 kez sallayın ve açın. </li><li> Son santrifüj sonra, pelet bozmadan mümkün olduğunca süpernatant kaldırmak. kuvvetlice iterek hücre kümeleri ilişkisini. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüpe 1 mL yıkama tamponu ilave edin ve 1 ml pipetle hücreler karıştırın. 1.5 ml tüp solüsyonun dökümü ve boncuk 50 ml&#39;lik bir tüp hücre süspansiyonu 1 ml. boruları 30 kez Flick, daha sonra 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de döner. </li></ol> 9. Hücre Kültürü / Görüntüleme için hazırlanıyor <ol><li> hücreleri kaplama için bir oda hazırlayın. kaplamak için de yüzey bölmeye jelatin çözeltisi (w / v% 5, 300 ul) ilave edin ve 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. İnkübasyon, rem sonrasıove jelatin ve kuru yüzey. </li><li> Dönme 30 dakika sonra boncuk / hücreleri ile tüpler dışarı atın ve kaput içinde manyetik plaka koymak. 2 dk, dökümü için çalkalayın ve 1 ml yıkama tampon ekleyin. </li><li> plaka üzerinden tüpleri almak, şiddetle 30 kez sonra fiske 30 kez çalkalayın. Manyetik plaka onları geri koymak ve 1 dakika boyunca çalkalanır. 5 yıkama toplam 4 kez tekrarlayın, fakat 1 dakika plaka üzerinde çalkalayarak. </li><li> Son yıkamadan sonra, bir tüp çıkar ve bir anda her tüp biri üzerinde çalışmak. Daha sonra 30 kez fiske 30 kez çalkalayın. Manyetik plaka üzerine koyun ve 1 dakika boyunca çalkalanır. Damper ve (37 ºC&#39;de önceden ısıtılmış) 1 ml% 20 IFCS AK medya ekleyebilirsiniz. </li><li> kuvvetlice 30 kez daha sonra 30 kez fiske sallamak. 500 ul pipetlemeyin ayarlayın ve pipetlemeyin yukarı ve 10 kez aşağı. Her bölmeye 500 ul aktarın. </li><li> 37 ºC inkübatör koymak ve / N O bırakın. Bir sonraki gün,% 10 FBS AT ortam hücreleri yıkayın. </li></ol> Western Blot (WB) Örnekleri 10. hazırlanması <ol><li> Takdönme 1 saat sonra boncuklar / hücreleri ile tüpler dışarı e. Manyetik plaka koyun ve 2 dakika süreyle çalkalayın. Süpernatantı dökümü ve 1 ml soğuk HBSS ekleyin. kuvvetlice 30 kez daha sonra 30 kez fiske sallamak. 3 yıkama için iki kez tekrarlayın, ancak 1 dakika plaka üzerinde çalkalayarak. </li><li> Son yıkamadan sonra, manyetik plaka üzerine tüpleri koymak ve 1 dakika boyunca çalkalanır. Pipet kullanarak tamponu çıkarın ve bir yöntemi daha önce 11,12 açıklanan kullanarak WB için hücrelerin lize. Toplanan lizat genellikle yaklaşık 30 ug protein içerir. </li></ol> 11. Görüntüleme <ol><li> Bir bölme için 250 ul nihai hacimde, medya hücreleri 3 kez yıkayın. hücrelere Dil-acLDL 1.5 ul ekle. Bu noktadan sonra, karanlıkta hücreleri tutun. </li><li> 37 ° C&#39;de 3.5 saat süreyle inkübe edin. Hoechst 1.5 ul ekleyin karıştırın ve PBS ile 37 ˚C.Wash hücre, 30 dakika boyunca inkübe ve oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4&#39;lük paraformaldehit (PFA) ile tespit edin. </li><li> 30 Mİ-PBS BSA PBS ile iki kez yıkanır ve% 5 ile blokeOda sıcaklığında n. % 1 BSA-PBS ile iki kez yıkanır. ml 2 ug / bir konsantrasyona kadar% 1 BSA-PBS ile BS-lektin FITC seyreltilir ve her bir bölmeye 300 ul ekle. </li><li> 30 dakika boyunca oda sıcaklığında orbital bir karıştırıcı üzerinde odasına koyun. PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> FITC (Lektin boyanma, EC işaretleyici, uyarma / emisyon 488 nm / 519 nm), DAPI (Hoechst, 358 nm&#39;de bir nükleer boyanma, uyarma / emisyon / 30 ms 200 msn pozlama süresi ile floresan mikroskop altında hücrelerin görselleştirmek 461 nm) ve 557 nm / 576 nm) TRITC (acLDL boyaması, EC işaretleyici, uyarma / emisyon 300 milisaniye. 20X objektif lens kullanarak görüntüleri elde edin. </li></ol>

<ol><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell functions.</a> J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).</li>
<li>Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+focus%3A+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cells in focus: endothelial cell.</a> Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).</li>
<li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91, 3527-3561 (1998).</li>
<li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+dysfunction%3A+testing+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance.</a> Circulation. 115, 1285-1295 (2007).</li>
<li>Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+vascular+endothelial+cells+from+murine+heart+and+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung.</a> Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).</li>
<li>Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+connexin40+is+associated+with+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li>
<li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev Cell. 26, 204-219 (2013).</li>
<li>Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+pulmonary+endothelial+cells+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-GlcNAcase+overexpression+reverses+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+type+1+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).</li>
<li>Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC%3A+old+protein+with+new+roles+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">VDAC: old protein with new roles in diabetes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Araştırmada en yaygın olarak kullanılan endotel hücreleri nedeniyle rahatlık ve kültür kolaylığı, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVECler) vardır. Bununla birlikte, bir çok araştırma diğer özel organlar 10 arasında endotel hücrelerinin izolasyonu ile elde edilen fizyolojik modelin varlığını gerektirir. Endotel hücreleri, kalp dokusu hücrelerinin çok küçük bir popülasyonu oluşturan; onların izolasyon ve kültür çok zor olabilir kanıtlayabilirim. Bu protokol kapsamında üç krit...

Çeşitli kardiyovasküler hastalıklar ve metabolik bozukluklar fare modellerinde hastalarda bulunan benzer fizyolojik ve moleküler değişiklik taşımaktadır. Ayrıca, farelerin genetik değişim bizi hastalıkların gelişimi ve ilerlemesinde belirli genlerin patojenik rolünü araştırmak için olanak sağlayan güçlü bir araçtır. Günümüzde, hücre tipi-özgü gen in-tak ya -kasa farenin kolayca farenin gerçek genetik olarak tadil edilmiş olup olmadığını belirlemek için ilk adımdır spesifik hücre tipleri çok laboratuar ve mRNA ölçümü ve protein seviyeleri üretilir. Endotel endotel hücreleri (EC) hatları, iç damar duvarı ince bir tek tabakadır. Endotel hücreleri, vasküler tansiyon, damar geçirgenliğini ve yeni damar oluşumu 1,2 düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Endotel disfonksiyonu, birçok patolojik durumlarda ve endotel fonksiyonu değişiklikleri bir işaretidir çeşitli araç yol açabilir olduğunukardiyovasküler hastalıklar 3,4. Fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında endotel hücrelerinin işlevini incelemek böylece önemlidir. Orada ECS 5-8 izole etmek çeşitli yolları vardır ve izolasyon yöntemi doku ve türlerin kullanılacak olan bağlı optimize edilmiş olması gerekir. Farklı dokulardan EC yüzey belirteçleri ile ilgili ve protein ekspresyonu 9 heterojenlik ileri düzey bir olmasıdır. endotel hücrelerinin Başarılı izolasyonu genellikle zor olabilir ve eğitim ve uygulama bir dereceye gerektirir. elde kez, bu protokolde öngörülen izolasyon yöntemi istikrarlı ve verimli olduğunu kanıtlamaktadır. Bu yöntemin genel amacı yüksek kalite ve miktar fare koroner EC (MCECs) elde etmektir. Bir kalp toplanan hücrelerin miktarı diğer teknikleri kullanarak, diğer dokulardan elde hücrelerden daha az olsa da, bu teknik yine de bahsi sağlarter kalitesi. Elde edilen popülasyonda endotel hücrelerinin saflığı% 90 daha büyüktür. Bu nedenle, bu teknik, hücre görüntüleme gibi tamamen izole edilmiş endotel hücreleri kullanan uygulamalar için ideal olacaktır.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>SH3026801</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat &</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads pan fare IgG boncuk ve nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD31 Antikor</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>IFCS&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>SH30072.04</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Fisher</td><td>MT10060-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (Nötr Proteaz)</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS02109</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip II&nbsp;</td><td>Worthington Biyokimya A.Ş. / Fisher</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021-50 ml</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataz inhibitör kokteyli</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ml</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitör kokteyli</td><td>Sigma</td><td>P8340-1 ml</td><td></td></tr><tr><td>Heparin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Fisher/Mediatech</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>D-Valine</td><td>Sigma</td><td>V1255-5G</td><td></td></tr><tr><td>EGS</td><td>Corning</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Fisher/Mediatech</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

fare koroner endotel hücreleri İzolasyon

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endotel hücreleri, kan damarlarının iç çeperini kaplamak ve damar tonu, vasküler geçirgenlik ve yeni damar oluşumu düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Endotel hücre fonksiyon bozukluğu, iskemik kalp hastalığı da dahil olmak üzere birçok kardiyovasküler hastalıkların gelişimi ve ilerlemesinde rol oynar. fonksiyonu ve koroner endotel hücrelerinin karakterizasyonu incelemek için, hücre izolasyonu ilk adımdır ve daha sonraki deneyler yüksek saflıkta ve miktarını gerektirir. Bu protokol, yetişkin fare koroner endotel hücrelerini izole etmek için etkili bir yöntem tarif eder. Fare kalp disseke ve küçük parçalar halinde kıyılmış. dispaz ve kolajenaz II kullanılarak kalbin sindirimden sonra hücreler yıkanır ve anti-CD31 antikoru ile konjuge edilmiş, manyetik boncuklar ile inkübe edildi. endotel hücreleri ile boncuk yıkanmış birkaç kez ve görüntüleme ve moleküler biyoloji experime dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda kullanıma hazırNTS. Verimli izolasyon% 90&#39;ın üzerinde saflıkta tek yürek başına yaklaşık 10 4 hücre verir.

Bir fare kalp koroner endotel hücrelerinin başarılı izolasyonu tipik bir Arnavut kaldırımı şekli ile% 90&#39;ın üzerinde saflıkta yaklaşık 10 4 hücre verir. endotel hücreleri saf nüfus için, dikkatli her türlü kirlilikten arındırılmış steril bir ortam sağlamak için protokol boyunca alınmalıdır. uzatılmış hücreler ya da nüfus içinde büyütülmüş hücrelerden görünümü, diğer hücre tipleri, yumuşak kas hücreleri ve fibroblastlar ile kirlenmesini ifade eder. Endotel hücre saflık test...

Bu protokol, fare koroner endotel hücrelerini görüntüleme veya moleküler biyolojik deneyler yapmak amacıyla izole etme yöntemimizi paylaşmak için hazırlanmıştır.

Fare Koroner Endotel Hücreleri İzolasyon

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Bu deneyin genel amacı, yüksek derecede saflaştırılmış, yüksek kaliteli ve çok sayıda fare koroner endotel hücresi elde etmektir. Bu yöntem, kardiyovasküler araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yüksek verimlilikte ve iyi kalitede endotel hücreleri elde edilmesini kolaylaştırmasıdır.Bu prosedür, araştırma uzmanı Shizhen Luo ve baş araştırmacımız Dr. Ayako Makino tarafından gösterilecektir. Prosedürden bir hafta öncesine kadar, örnek başına bir adet 1,5 ml'lik mikrosantrifüj tüpüne bir mililitre CD31 tamponu ekleyin. Ardından, koyun anti-rad IGG boncuklarını nazikçe pipetleyerek karıştırın ve her tüpe uygun hacimde boncuk ekleyin.Tüm boncuklar eklendikten sonra, tüpleri 30 kez kuvvetlice çalkalayın ve bir dakika boyunca çalkalamak için manyetik bir plakaya yerleştirin. Ardından, tüpler hâlâ plakaya bağlıyken tamponu boşaltın ve her tüpe bir mililitre taze CD31 tamponu ekleyin. İki mikrolitre rad anti-mouse CD31 antikoru ekleyin ve tüpleri dört santigrat derecede bir gece boyunca rotatora yerleştirin.Ertesi gün, tüpleri laminar akışlı kabine aktarın ve bir dakika boyunca çalkalayarak yeniden manyetik plakaya yerleştirin. Ardından süpernatantı bir mililitre taze CD31 tamponu ile değiştirin ve tüpleri elle 30 kez kuvvetlice çalkalayın. Üçüncü yıkamadan sonra tüpleri dört derece santigrat sıcaklıktaki rotatora geri yerleştirin.Prosedür gününde, kan pıhtılaşmasını önlemek için deney hayvanına intraperitonal olarak 0,1 mililitre heparin enjekte ederek başlayın. On dakika sonra, fareyi 0,01 mililitre pentobarbital enjekte ederek anesteziye alın. Ardından, ayak parmağı sıkıştırma testi ile tepki vermediğini doğrulayın.Kalp ve akciğer dokuları birlikte çıkarıldıktan sonra, dokular bir Krebs tamponu beherine yerleştirilmeli ve nazikçe çalkalanarak durulanmalıdır. Ardından dokular, taze Krebs içeren altı santimetrelik bir kaba aktarılmalı ve akciğer lobları makas ve pens yardımıyla çıkarılmalıdır. Şimdi aortaya 20 gauge'lik bir kateter yerleştirilmeli ve koroner dolaşım sistemi, heparin ile desteklenmiş HBSS ile yıkanmalıdır.Kanın tamamı alındıktan sonra, ventrikülde küçük bir kesik açın, kalbi nazikçe sallayarak durulayın ve kalp dokusunu buz üzerindeki bir örnek tüpüne yerleştirin. Koroner endotel hücrelerini serbest bırakmak için doku sindirildikten sonra, hücreleri peletleyin ve beş mililitre yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Ardından, önceden hazırlanmış boncukların bulunduğu bir tüpü manyetik plakaya yerleştirin ve boncukların eşit şekilde dağılması için tüpü üç kez sallayın.İkinci yıkamanın ardından, peleti bozmadan mümkün olduğunca fazla süpernatan kaldırın ve hücreleri tüpü kuvvetlice sallayarak serbest bırakın. Ardından, hücreleri bir mililitre yıkama tamponu içinde nazikçe karıştırarak yeniden süspanse edin ve boncuklardaki CD31 tamponunu uzaklaştırın. Hücreleri boncuklarla birleştirin ve tüpü 30 kez sallayın.Ardından, hücre ve boncuk çözeltisini 4 °C'de 30 dakika boyunca rotatora yerleştirin. Hücreler inkübe edilirken, örnek başına bir ekim odası kuyucuğunun yüzeyini jelatin çözeltisi ile kaplayın ve odaları 37 °C'de 30 dakika boyunca bekletin. Jelatin katılaştığında, fazla jel çözeltisini uzaklaştırın ve kuyucuk yüzeyini kurutun.Ardından, boncuklarla konjuge edilmiş hücreleri çeker ocak altında manyetik plakaya aktarın ve iki dakika boyunca çalkalayın, ardından yıkama tamponunu dökün. Hücrelerin üzerine 1 mL taze yıkama tamponu ekleyin ve tüpü plakadan çıkararak 30 kez kuvvetlice çalkalayın, ardından 30 kez hafifçe vurun. Tüpü bir dakika daha çalkalamak için plakaya geri yerleştirin.Son karıştırma işleminden sonra, tüpü son bir dakika daha sallamak için manyetik plakaya geri yerleştirin ve yıkama tamponunu, yüzde 20 demirle zenginleştirilmiş dana serumu ile desteklenmiş 37 °C endotel hücre ortamının bir mililitresi ile değiştirin. Tüpleri son olarak 30 kez sallayın ve hafifçe vurun. Ardından, konjugat hücreleri on kez karıştırmak için 500 µL'ye ayarlanmış bir mililitrelik bir pipet kullanın ve koroner endotel hücrelerinden 500 µL'lik alikotları, 37 °C'de gece boyu inkübasyon için her bir ekim bölmesi kuyucuğuna aktarın.Ertesi gün, hücreleri yüzde on FBS ile takviye edilmiş endotelyal hücre besiyeri ile yıkayın. Bu yöntemle izole edilen koroner endotelyal hücrelerin saflığı, endotelyal hücre yüzey belirteçleri olan BS lectin ve AC LDL'ye karşı immünohistokimyasal boyama ile doğrulanabilir; tipik bir fare koroner endotelyal hücre kültüründe hücrelerin yüzde 90'ından fazlası her iki belirteç için çift pozitif ekspresyon gösterir. Bu prosedürün ardından, bir yöntem olarak, farklı hastalık durumlarında hangi proteinlerin modifiye olabileceği gibi ek soruları yanıtlamak için çeşitli kan, immünoreseptör ve floresan görüntüleme çalışmaları gerçekleştirilebilir.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, araştırmacıların çalışmalarını koroner endotel hücreleri alanına genişletmeleri için gerekli araçları sağlamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek miktarda ve kalitede fare koroner endotel hücrelerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedür sırasında dikkat edilmesi gereken birkaç kritik nokta bulunmaktadır.En önemli husus, izolasyon boyunca steril bir ortamın korunmasıdır. İkinci olarak, kılcal damar ağında kan pıhtılaşmasını önlemek için kanın tamamen ve mümkün olan en kısa sürede boşaltılması gerekir. Üçüncü olarak, tüm tamponların ve özellikle CD31 tamponunun pH değeri ölçülmelidir.

isolation-of-mouse-coronary-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, fare pulmoner endotel hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol açıklar. Bu yöntem, mekanik ve enzimatik akciğer dokusunda ayrılma yanı sıra anti-PECAM-1 ve çoğunlukla mikrovasküler kökenli saf bir endotel hücre popülasyonu üreten manyetik boncuk, konjuge anti-ICAM-2 antikorları kullanarak 2-aşamalı bir arınma süreci kapsar.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Kalp kapakçığı endotel hücrelerini (VEC'ler) izole etme yeteneği, kapak gelişimi, bakımı ve hastalık mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir.  Burada, VEC'lerin gelişimsel ve hastalık süreçlerine katkısını belirleyen çalışmalara izin verecek FACS kullanarak embriyonik ve yetişkin Tie2-GFP farelerinden VEC'lerin izolasyonunu açıklıyoruz.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Vasküler endotel hücreleri birçok önemli kardiyovasküler hastalıkta önemli rol oynamaktadır. Bu makale, herhangi bir özel ekipman kullanmadan fare aortundan endotel hücrelerini izole etmek ve genişletmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır. Protokolümüz, endotel hücre fizyopatolojisindeki mekanizmaları tanımlamak için etkili bir yol sağlar.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

Bu protokolün amacı, koroner dolaşımdan fare primer vasküler düz kas hücrelerinin izolasyonu ve kültür teknikleri (VSMC) göstermektir. VSMC'Ier izole edildikten sonra, pek çok standart kültür teknikleri için kullanılabilir.

Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

Mikrovasküler endotel hücreleri iskelet kas (MMEC) kas kılcal iç duvar şekil ve her ikisi de, düzenleyen sıvıları/molekülleri ve geçiş (bağışıklık) hücre arasında kas doku ve kan değişimi. Birincil fare MMEC, yalıtım burada açıklandığı gibi kapsamlı tüp bebek araştırmalar "myovascular birimi" sağlar.

Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon

Biz bir sindirim tampon ardışık doku sindirim yoluyla sıçan kalplerinden endokardiyal ve koroner endotel hücrelerinin izolasyon için bir protokol sunmak, tekrarlayan santrifüj döngüleri hücre toplama, ve anti-sıçan CD31 mikroboncuklar kullanarak hücre arıtma.

Endokardiyal ve Koroner Endotel Hücrelerinin Sıçan Kalbinin Ventriküler Serbest Duvarından İzolasyon

Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC'leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Tek hücreli omik deneyler yapmak için stabil veya rahatsız edici akış koşullarına maruz kalan fare karotis arterlerinin lümeninden endotel hücrelerini ve çekirdeklerini izole etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Tek Hücreli Multi-Omik Deneyler için Fare Karotis Arterlerinin Lümeninden Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu makalede, primer akciğer endotel hücreleri yenidoğan farelerden izole edilmiş ve kültürlenmiştir.

Primer Fare Akciğer Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu protokol, fare endotel hücrelerinin tüm pankreastan izolasyonunu tanımlar.

Fare Pankreas Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Keşfedin fare koroner endotel hücreleri izolasyonunu görüntüleme ve moleküler biyoloji deneyleri için. Bu yöntem, yüksek verimli ve saf hücre elde edilmesini sağlayarak kardiyovasküler araştırmalara katkı sağlar.

Fare Koroner Endotel Hücreleri İzolasyon

Daha fazla video keşfet