Çoklu Renkler Yüksek hızında Yapısal Aydınlatma TIRF Mikroskopi A Guide
30 Mayıs 2016
Bu makale, dinamik biyolojik süreçleri birden çok renkte optik süper çözünürlükle görüntülemek için toplam iç yansıma floresan aydınlatması (TIRF-SIM) ile çalışan yapılandırılmış bir aydınlatma mikroskobunun montajı ve çalıştırılması için derinlemesine bir kılavuz sağlar.
Bu protokolün genel amacı, TIRF ve çoklu renklerle optik kesit alma modlarında çalışabilen yüksek hızlı canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme için uygun yapılandırılmış bir aydınlatma mikroskobu oluşturmak ve hizalamaktır. Bu yöntem, hücre biyolojisi alanında şu anda standart kırınım sınırlı TIRF mikroskobu kullanılarak cevaplanamayan temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, diğer süper çözünürlüklü mikroskopi tekniklerine kıyasla hızlı zaman çözünürlüğüdür, bu da onu canlı hücrelerdeki dinamik süreçleri görüntülemeye çok uygun hale getirir.
Bu protokol bir TIRF-SIM mikroskobunun yapım adımlarını açıklasa da, kurulum esnektir ve 3D-SIM, multifokal SIM ve doğrusal olmayan SIM gibi görüntüleme modalitelerini uygulamak için kolayca değiştirilebilir. Yapılandırılmış bir aydınlatma mikroskobu için uyarma yolunu düzenlemek ve hizalamak için, burada gösterildiği gibi optik tablo üzerindeki bileşenlerin konumlarını işaretleyerek başlayın. İlk dikroik aynayı, DM4'ü mikroskop çerçevesinin filtre küpü taretine yerleştirdikten sonra, ikinci dikroik aynayı, DM3'ü bir inç kare kinematik ayna yuvasına yerleştirin ve kondenser merceğinden bir odak uzaklığı uzağa yerleştirin, L5. Ardından, sistem için optik erişimi doğru bir şekilde tanımlamak için, objektif merceği (OB) taretten çıkarın ve bunun yerine bir hizalama aleti vidalayın.
Ardından, lazerden gelen kolimasyonlu bir referans ışınını iki hizalama diskindeki deliklerin merkezinden yönlendirmek için dikroik ayna DM3'ü ve SLM'nin yaklaşık nihai konumuna yerleştirilmiş geçici bir hizalama aynasını kullanın. Burada gösterildiği gibi üç ayna ve dikroik ayna DM2 kullanarak, ışını lazerden gelen geçici aynaya yönlendirin. Kaba optik eksen belirlendikten sonra, hizalama aracını çıkarın.
Ardından, mikroskop gövdesine girmeden önce ışın yoluna bir iris yerleştirin ve ışın üzerinde ortalayın. İrisin ortasında küçük bir delik olan bir parça beyaz kart takın, ardından objektif lensi yeniden takın. Ardından, DM3 aynalarında yinelemeli açısal ayarlamalar yapın ve gelen ışınla kart üzerindeki arka yansımayı ortalamak için SLM konumunda.
Ardından objektif merceği geçici olarak çıkarın ve bir referans konumu oluşturmak için tavandaki lazer noktasını işaretleyin. Tüp lensi, L5'i, objektiften kabaca bir odak uzaklığı uzağa yerleştirin ve referans ışınının yönü boyunca çevirmek için ayarlanmış doğrusal bir öteleme aşamasına monte edin. Tüp merceğin konumunu ve açısını, objektiften çıkan ışın toplanacak ve tavandaki referans noktasına çarpacak şekilde ayarlayın.
İris ve beyaz kart ile arka yansımayı tekrar kontrol ederek merceğin ışına dik olup olmadığını kontrol edin. Ardından objektif merceği çıkarın ve görüntü röleli teleskopun ikinci merceği olan L4'ü takın. Kolimasyonu sürdürmek ve referans ışınının tavandaki işaretli noktaya çarpmaya devam etmesini sağlamak için bu merceğin konumunu ve açısını ayarlamak için doğrusal öteleme aşamasını kullanın. Objektif merceği değiştirin ve teleskobun ilk merceği olan L3'ü takın. Daha önce açıklandığı gibi kolimasyon ve sapma olmamasını sağlamak için bu merceğin konumunu ve açısını ayarlayın.
SLM çipini metin protokolüne göre, lensler hizalı olarak monte ettikten sonra, SLM'yi aynanın yerine yerleştirin. SLM'nin konumunu, referans ışını SLM çipinin merkezinde yer alacak şekilde ayarlayın ve açıyı, ışın iki röle merceğinden geçecek şekilde ayarlayın. Ardından referans ışınının hala işaretli noktada ortalanıp ortalanmadığını kontrol edin.
Sıvı kristal değişken geciktiriciyi veya LCVR'yi, hızlı ekseni 45 derece açıyla gelen polarizasyona monte edin. Ardından, polarizasyon döndürücünün metin protokolüne göre hizalanmasını tamamladıktan sonra, oküler aracılığıyla iletilen ışığı kullanarak, bir retiküle odaklanın ve objektif merceği bu konuma sabitleyin. Ardından, 1.5 numaralı bir kapak camına 100 nanometre çok renkli boncuklardan oluşan bir damla yayarak tek katmanlı bir floresan boncuk hazırlayın.
Suya tekrar daldırmadan önce boncukları cama adsorbe etmek için boncukları kurumaya bırakın. Daldırma yağı kullanarak boncuk örneğini objektifin üzerine yerleştirin. Kameranın konumunu, floresan boncuk tabakası odakta olacak şekilde hassas bir şekilde ayarlayın.
SIM ikili ızgara desenlerini bitmap dosyaları olarak oluşturduktan ve bunları metin protokolüne göre SLM'ye yükledikten sonra, SLM kontrol yazılımını yükleyin ve Bağlan'a tıklayın. Repertuar" sekmesinde, repertuar dosyasını açmak için Yükle'ye tıklayın ve dosyada bulunan çalışan siparişlerin sayısını kontrol edin. Repertuar dosyasını SLM'ye yüklemek için "Panoya Gönder"e tıklayın.
Ardından, Durum" sekmesini seçin ve çalışan siparişin numarasını girin. Çalışma sırasını hizalama ızgarasına değiştirmek için Seç'e tıklayın. L3'ün odak konumundaki ışın yoluna bir XY aşamasına monte edilmiş bir uzamsal maske veya SM yerleştirin ve konumunu, yalnızca istenen ilk siparişler geçilecek şekilde optik eksene göre çevirin.
Uzamsal filtreden hemen sonra, yalnızca iki dairesel ışın görünecektir. Kameradaki floresan boncuk tabakasının görüntüsünü kontrol edin. İki dairesel ışın burada gösterildiği gibi örtüşmüyorsa, objektif merceği ve kamera konumunu yinelemeli olarak ayarlayarak örnek düzlemi yeniden konumlandırın.
Odağı ince ayarladıktan ve numune düzlemini metin protokolüne göre ayarladıktan sonra, örneğin boyayı odağa getirerek 10 mikromolar rodamin 6G boya çözeltisi görüntüleyerek TIRF aydınlatmasını onaylayın. İki ışın doğru TIRF açısında gelirse, tek moleküller yüksek arka plan olmadan görünür olacak ve dairesel açıklığın kenarları odakta olacaktır. Kirişlerin pozisyonunda ince ayarlamalar, dikroik ayna DM3 ayarlanarak yapılabilir.
Sistemi senkronize etmek ve kalibre etmek için boncuk tek katmanlı numuneyi objektifin üzerine yerleştirin ve odak noktasına getirin. SLM'yi, ilk model oryantasyonu için sırayla üç faz kaydırma görüntüsünün her birini gösterecek şekilde programlamak için SLM kontrol yazılımını kullanın. Ardından örnek repertuarın dördüncü çalışma sırasına geçin.
Edinme yazılımında, Gelişmiş Kamera Özellikleri'ni seçerek ve Çıkış Tetikleyici Türü 1"i pozitif ve Çıkış Tetikleyici Türü 2"yi negatif olarak ayarlayarak kamerayı küresel pozlama süresi için yapılandırın. Sıra bölmesinde, Tarama Türü'nün altında, Sabit Disk Kaydı'nı seçin ve kare sayısını üç olarak ayarlayın. Ardından Başlat'a tıklayınüç kare elde etmek için.
SLM modeli her pozlamada değişecektir. Sistemi metin protokolüne göre kalibre ettikten sonra, SLM kontrol yazılımında, SLM çalışma sırasını TIRF-SIM için gerekli olan dokuz ikili ızgara görüntüsünün tam serisine geçirin. Bu, örnek repertuarda sıfır olarak çalışıyor.
Boncuk örneğinin dokuz görüntüsünü aldıktan sonra, kamera yazılımının sıra bölmesinde, tarama türü olarak Sabit Disk Kaydı'nı seçin ve kare sayısını dokuz olarak değiştirin. Ardından görüntüleri almak için "Başlat" ı tıklayın. Son olarak, Arabelleğe Alınmış Görüntüleri Kaydet altında, görüntü türü olarak TIFF'i seçin ve Tamam'ı tıklatın. Metin protokolüne göre süper çözünürlüklü bir görüntüyü yeniden oluşturun.
Burada gösterilen, standart TIRF'yi TIRF-SIM ile karşılaştırmak için çok renkli 100 nanometre çapında floresan boncuklar görüntülendi. TIRF-SIM, TIRF'ye kıyasla açıkça önemli ölçüde daha yüksek yanal çözünürlüğe sahipti. Mikroskobun tahmini çözünürlüğü 488 ve 640 nanometre TIRF-SIM için sırasıyla 90 nanometre ve 120 nanometredir.
Bu, teorik kırınım sınırlı duruma kıyasla her iki dalga boyu için yanal çözünürlükte iki kat iyileşmeye karşılık gelir. Burada görüldüğü gibi, floresan olarak işaretlenmiş amiloid fibriller in vitro olarak oluşturuldu ve ayrıca çift çözünürlüğü göstermek için bir test numunesi olarak kullanıldı. emGFP etiketli mikrotübüller veya LifeAct-GFP gibi yüksek kontrastlı hücre altı yapılar, TIRF-SIM görüntüleme için idealdir ve yüksek kontrastlı, süper çözünürlüklü görüntüler verir.
Gösterilen kurulumu kullanan TIRF-SIM görüntüleme, bazal hücre korteksinin yakınında bulunan bir mikrotübül alt popülasyonunun gözlemlenmesini sağlar ve zaman içinde mikrotübül polimerizasyonu ve depolimerizasyonu görülebilir. Ayrık yapılara sahip olmayan düşük kontrastlı numuneler, plazma zarının kenarları dışında yüksek çözünürlüklü bilgilerden yoksundur ve bu nedenle TIRF-SIM görüntüleme için yetersiz kalırlar. Son olarak, başarılı SIM görüntüleme için yüksek modülasyon kontrastı gereklidir.
Burada gösterildiği gibi, yeniden yapılandırılmış görüntünün Fourier dönüşümü, SIM optik transfer fonksiyonunun görselleştirilmesine izin verir. Bir kez ustalaştıktan sonra, gerekli tüm parçalar edinilmişse, bu teknik yaklaşık bir hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, TIRF-SIM'i başarılı bir şekilde uygulamak için en kritik konuların farkında olunmalıdır.
İlk olarak, kirişlerin hassas bir şekilde hizalanması çok önemlidir. Objektif lens açıklığının kenarlarına yerleştirilmeleri gerektiğinden bu zor olabilir. İkinci olarak, ışığın polarizasyon durumunun desenle birlikte döndürülmesi çok önemlidir.
Bu olmadan, numunenin desen kontrastı düşük olacak ve sonraki görüntü oluşturma imkansız olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, SLM tabanlı bir TIRF-SIM mikroskobunun yapımı ve hizalanmasındaki en önemli adımları iyi anlamış olmalısınız. 3B Sınıfı lazerlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.
TIRF hedefi yerindeyken hizalama işlemi gerçekleştirilirken lazer gücü göz için güvenli seviyelerde tutulmalıdır.
Genel Bakış
Bu makale, TIRF-SIM kullanarak yüksek hızlı canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme için yapılandırılmış aydınlatma mikroskobunun kurulumu ve hizalanmasına yönelik kapsamlı bir kılavuz sunmaktadır. Bu yöntem, dinamik biyolojik süreçlerin çok renkli olarak görüntülenmesi için avantajlıdır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Mikroskopi Teknikleri
- Süper-Çözünürlüklü Görüntüleme
Arka Plan
- Standart TIRF mikroskobisi, dinamik süreçlerin çözümlenmesinde kısıtlamalara sahiptir.
- Süper-çözünürlük teknikleri görüntüleme yeteneklerini artırır.
- Yapılandırılmış aydınlatma mikroskobisi (SIM), daha hızlı zaman çözünürlüğü sunar.
- Bu protokol, mikroskop düzeneğinde esnek modifikasyonlara olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Gelişmiş görüntüleme için bir TIRF-SIM mikroskobu oluşturmak.
- Yüksek zamansal çözünürlük gerektiren biyolojik süreçların incelenmesine olanak sağlamak.
- Araştırmacıların düzeneği tekrarlayabilmeleri için ayrıntılı bir protokol sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Dikroik aynalar ve lensler dahil olmak üzere optik bileşenlerin hizalanması.
- Polarizasyon kontrolü için sıvı kristal değişken geciktiricinin kullanılması.
- Kalibrasyon için floresan boncuk örneklerinin hazırlanması.
- Desen oluşturma için SLM kontrol yazılımının uygulanması.
Ana Sonuçlar
- TIRF-SIM mikroskobunun başarılı şekilde hizalanması.
- Floresan boncuklar ile görüntüleme yeteneklerinin gösterilmesi.
- TIRF aydınlatma koşullarının doğrulanması.
- Gelecekteki görüntüleme çalışmaları için bir protokol oluşturulması.
Sonuçlar
- TIRF-SIM kurulumu, dinamik süreçlerin yüksek hızlı görüntülemesine olanak tanır.
- Bu yöntem, hücre biyolojisinde daha önce yanıtlanması mümkün olmayan sorulara çözüm sunabilir.
- Kurulumdaki esneklik, çeşitli görüntüleme modalitelerine imkan sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Yüksek hızlı, çok renkli süper çözünürlüklü görüntüleme, canlı hücre analizlerinde dinamik süreçlerin görselleştirilmesi ihtiyacını karşılayarak, hücre altı dinamiklerin doğrudan gözlemlenmesi yoluyla terapötik hedeflerin mekanistik olarak riskten arındırılmasını sağlar. TIRF-SIM, nanoklimal protein etkileşimlerini ve taşınma olaylarını zamansal doğrulukla çözümleyerek hedef doğrulamada öngörücü güven sağlar ve erken keşif aşamasındaki devam/tamam kararlarını destekler. Bu yetenek, hedef güvenini artıran ve öncü madde tanımlamasındaki yalancı pozitifleri azaltan kantitatif, mekansal olarak çözümlenmiş okumalar sunarak fenotipik tarama için analiz geliştirmeyi optimize eder.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Canlı hücrelerde protein lokalizasyonu ve dinamiklerini 90-120 nm çözünürlükte görselleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Bazal korteks yakınındaki mikrotübül polimerizasyonu ve depolimerizasyonunun doğrudan gözlemi yoluyla fonksiyonel hedef validasyonunu destekler.
- Tahmin Değeri: Difraksiyon limitlerine kıyasla iki kat artırılmış lateral çözünürlükle mikrotübül alt popülasyonlarını ve amiloid fibrillerini ayrıştırarak hedef etkileşim çalışmalarıyla ilgili güveni artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Çözünürlük kriterlerini belirlemek için floresan boncuk tek tabakalarıyla kalibrasyon yaparak, onaylanmış biyolojik sistemleri sonraki işlem akışlarına hazırlar.
- Operasyonel Değer: Tutarlı kare alımı için senkronize SLM desen üretimi, dalga boyu kontrolü ve kamera tetikleme yoluyla analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: TIRF ve optik kesitleme modları da dahil olmak üzere görüntüleme modaliteleri ve uyarım dalga boyları (488 nm, 640 nm) arasında platformun yeniden kullanımını kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Subsellüler yapıların (örneğin, emGFP mikrotübüller, LifeAct-GFP) keşif gözlemlerini, yüksek kontrastlı ve süper-çözünürlüklü görüntüleme aracılığıyla preklinik doğrulamaya bağlar.
- Risk Ayarlı İlerleme: Standart TIRF ile görülmeyen canlı hücrelerdeki dinamik süreçleri görselleştirerek mekanistik risklerin azaltılmasını sağlar ve hedef seçimine veri sunar.
- Hastalıkla İlgili Sistem: Canlı hücre modellerine uygulanabilirliği kanıtlayarak, nörodejenerasyon veya kanserdeki mikrotübül dinamikleri gibi süreçler için biyobelirteç uyumunu destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntemi, dinamik süreçlerin nanoklase çözünürlüğünün hedef doğrulamasına ve bileşik tarama için assay hazırlığına bilgi sağladığı, erken keşiften öncü madde tanımlamaya kadar olan aşamaya konumlandırır.
- Keşif Biyolojisi: Canlı hücre modellerindeki nanometre ölçekli protein dağılımlarını ve dinamiklerini çözümleyerek hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlarını destekler.
- Tarama: Güvenilir bileşik değerlendirmesi için çok renkli kapasiteye sahip, kantitatif ve yüksek kare hızında (10 Hz'e kadar) görüntüleme ile analiz hazırlığı sağlar.
- Analitikler: Koşul karşılaştırmaları için yeniden oluşturulmuş süper-çözünürlüklü görüntüler ve Fourier dönüşümü tabanlı optik transfer fonksiyonu doğrulaması aracılığıyla istatistiksel çıktılar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Yüksek kontrast ve çözünürlükle hücre altı yapıların hastalıkla ilgili görüntülemesi üzerinden preklinik sürekliliğe bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Sistemi, projeler genelinde birden fazla görüntüleme modalitesi (TIRF-SIM, 3D-SIM, multifokal SIM) için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak çerçevelendirir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tahmin güveni, hedef doğrulaması, canlı hücre görüntülemede mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Polarizasyon, uzaysal yapı ve dalga boyu senkronizasyonunun otomatik kontrolü yoluyla standartlaştırma, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: Hedef dinamiklerinin erken aşamada görselleştirilmesi sayesinde daha iyi devam/durdur kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Terapötik hedef davranışının fizyolojik olarak ilgili bağlamlarda doğrudan gözlemlenmesine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Optik hizalama, lazer güvenliği (Sınıf 3B) ve yapılandırılmış aydınlatma için SLM tabanlı desen oluşturma konularında uzmanlık gerektirir.
- Polarizasyon kontrolü (sıvı kristal değişken geciktirici), yüksek hızlı kamera tetikleme ve çok dalga boylu lazer entegrasyonu için enstrümantasyona ihtiyaç duyar.
- Optik masa kurulumu, bileşen konumlandırması ve floresan boncuk tek katmanları kullanılarak yapılan kalibrasyon protokolleri için ekipler arası standartlaştırma gerektirir.
- Düşük kontrastlı örneklerin, membran kenarları dışında yüksek çözünürlüklü bilgi sunmaması nedeniyle, değişen örnek türlerine yönelik adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Başarılı SIM görüntülemesi için yüksek modülasyon kontrastı gerekliliği ve objektif lens açıklıklarında hassas ışın hizalaması gibi pratik sınırlamaları kapsar.
