3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması İn Vivo

Bu prosedürün genel amacı, bir 3B ortam bağlamında hücre göçünü veya diğer hücresel süreçleri gözlemlemek amacıyla hizalanmış ve rastgele 3B kollajen matrisleri oluşturmaktır. Bu yöntem, gerçek dokularda bulduğumuz kolajen özelliklerini yakalamak için tasarlanmıştır ve bu, hücrelerin hizalanmış veya rastgele bir hücre dışı matrisi tanımak için kullandıkları mekanizmalar gibi temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, 3B ortamın organizasyonunu, içindeki görüntü hücrelerini manipüle edebilmeniz ve bunu yaygın olarak bulunan ekipmanlarla uygun maliyetli bir şekilde yapabilmenizdir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, kollajen solüsyonunu ve nötralizasyon tamponunu yeterince iyi karıştırmadıkları ve kollajeni kanallardan tutarsız bir şekilde çektikleri için mücadele edeceklerdir. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımda kıdemli bir bilim adamı olan Brian Burkel olacak. Başlamak için, kolajenin uygun şekilde nötralizasyonunu sağlamak için hücreleri ve ortamı eklemeden önce kolajen ve HEPES tamponunu iyice karıştırın.

Ardından, hücreleri ve ortamı nötralize edilmiş kollajen karışımına ekleyin ve beraberindeki metin protokolünde açıklandığı gibi buzun üzerine yerleştirin. Kollajen jeli dışındaki hücrelerin yapışmasını ve büyümesini en aza indirmek için buz gibi soğuk karışımı, doku kültürü ile muamele edilmiş steril bir yüzeye pipetleyin. Çözeltiyi eşit şekilde yaymak için bir pipet kullanın.

Jelenin oda sıcaklığında yaklaşık 10 ila 15 dakika polimerize olmasına izin verin. Daha sonra, jelleri örtün ve polimerizasyonu bitirmek için 45 ila 60 dakika daha 37 santigrat derece inkübatöre taşıyın. Polimerizasyon üzerine jel opak hale gelecektir.

Polimerize edildikten sonra, iki ila üç mililitre ortam ekleyin. Ardından, kuyu çevresinde 200'lük bir pipet geçirerek jelleri kuyunun kenarlarından serbest bırakın. Jeli alt yüzeyden çıkarmak için tabağı hafifçe döndürün.

Kollajen matrislerini hizalamak için PDMS Mikrokanalları oluşturmak için. İlk olarak, başka bir yerde açıklanan standart yumuşak litografi tekniklerini kullanarak bir SuA silikon ustası hazırlayın. Ardından, 20 gram elastomer tabanı tek kullanımlık bir kapta 2 gram kürleme maddesi ile iyice karıştırmak için bir zanaat çubuğu kullanın.

İyice karıştırıldıktan sonra, tek kullanımlık kabı 550 milimetre cıva vakum basıncı altında bir vakum odasına yerleştirerek PDMS karışımının gazını alın. Karışımı yaklaşık bir ila bir buçuk saat boyunca gazdan arındırın. PDMS'nin gazını giderirken, sıcak bir plakaya temiz bir şeffaf film tabakası yerleştirerek ve ardından silikon master'ı izleyerek silikon master'ı hazırlayın.

Mikro kanal kalıbının yukarı baktığından emin olun. Bir ila bir buçuk saat sonra, gazı alınmış PDMS'yi vakum odasından çıkarın. PDMS'yi yavaşça master'ın ortasına dökün ve yerçekiminin eşit şekilde yayılmasına izin verin.

Ardından, hava kabarcıklarını önlemek için silikon master'ın ve PDMS'nin üzerine ikinci bir şeffaf film tabakasını dikkatlice sarın. Şeffaflığın üzerine yavaşça bir lastik levha yerleştirin, ardından 1/8 inçlik bir akrilik levha yerleştirin, ardından akrilik levhanın üzerine üç on kiloluk ağırlıktan ilkini ekleyin. Başlangıçta, ilk ağırlık yüzecek, kalan iki ağırlık plakası ile devam etmeden önce yerleşmesine ve stabilize olmasına izin verecektir.

Devam etmeye hazır olduğunuzda, bir sıcak plakayı 70 santigrat dereceye ayarlayın ve PDMS'yi dört saat boyunca sertleştirin. Sertleştikten sonra, PDMS'nin en az bir saat daha soğumasına izin verin ve ardından gofret için üst şeffaflık filmini dikkatlice soyun. Son olarak, forseps ile kanalları çıkarın.

Kanalları yeni ve temiz bir şeffaf film üzerine baş aşağı yerleştirin ve keskin forsepslerle dairesel hareketlerle tüm bağlantı noktalarını temizleyin. Gevşeyen tüm PDMS parçalarını çıkarın. Ardından, yapışkan tarafı yukarı bakacak şekilde tezgaha bir parça koli bandı yerleştirin ve PDMS kanalını bandın üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin.

İyi bir temas sağlamak için bir çift forsepsin yuvarlak ucuyla kanallara bastırın. Kanalları çıkarın ve tüm görünür kalıntılar temizlenene kadar bu işlemi her iki tarafta da tekrarlayın. Ardından, temiz, hazırlanmış PDMS kanallarını %70 etanol ile doldurulmuş 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Kanalları 30 saniye boyunca maksimum hızda vorteksleyin ve ardından çözeltiyi taze,% 70 etanol ile değiştirin. Aseptik teknikler kullanarak, PDMS kanal tarafını yukarı bakacak şekilde temiz ve steril bir tabağa aktarın. Ardından, etanol buharlaşana kadar kanalları UV işlemine tabi tutun.

Kuruduktan sonra, kanalları bir kapak kızağı veya cam alt tabağa ters çevirin ve iyi bir sızdırmazlık sağlamak için camın üzerine bastırın. Kanalların orta kısmını kaplamak ve kapatmak için bir parça steril PDMS ekleyin ve devam etmeden önce kurulumun iyice kurumasını bekleyin. Daha sonra, bir kanalın üstüne mililitre başına 10 mikro gramlık bir kollajen çözeltisinin 100 mikrolitrelik bir damlacığı yerleştirin ve bir vakum kullanarak kanaldan çekin.

Kanalları 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin ve ardından hala kollajen kaplama solüsyonu ile dolu kanalları bir buzdolabına aktarın. Kurulumu yaklaşık 15 ila 30 dakika soğutun ve ardından kollajen kaplama solüsyonunu kanallardan çıkarmak için bir aspiratör veya pipet kullanın. Kollajen çözeltisini nötralize ederek, hücre ortamı ile seyrelterek ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ederek başlayın.

Ardından, 120 ila 150 mikrolitre kollajen solüsyonunu önceden soğutulmuş bir kanalın A portuna yerleştirin. Daha sonra, 25 mililitrelik bir pipeti bir vakum hattına takın ve C portunun üzerine yerleştirin. Rastgele matrisler üretmenin en önemli adımı, kollajeni kanaldan yavaşça çekmektir.

Çok hızlı bir şekilde çekilirse, kanalın bir kısmında veya kanalın tamamı boyunca hizalamanın artmasına neden olur. Bağlantı noktası bölgelerinden fazla çözeltiyi dikkatlice çıkarın ve ardından steril PDMS yamalarını her iki bağlantı noktasına, A ve C'ye yerleştirin.İki ila üç dakika sonra, B bağlantı noktasını kaplayan merkez PDMS yamasını çıkarın ve mililitre başına bir ila üç milyon hücre konsantrasyonunda iki ila üç mikro litre hücre ekleyin. Jel süresinin oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika daha kısmen polimerize olmasına izin verin ve ardından krepliği 15 ila 30 dakika daha 37 santigrat derece inkübatöre aktarın.

Polimerize edildikten sonra, PDMS bağlantı noktası kapaklarını çıkarın ve kanalı tamamen kaplayacak şekilde ortam ekleyin. Burada 50.000 dört T bir hücre, 5 gün boyunca 2 mg / ml veya 3.5 mg / ml kollajen jel içine yerleştirildi. Dört T hücreli bir çizgi, oldukça kasılmalı bir Med Estetik kanser hattıdır, ancak yüksek yoğunluklu jeli yalnızca yaklaşık% 10 oranında daraltabilir: Taşınabilir düşük yoğunluklu jeller aynı zaman diliminde% 57 oranında büzülür.

Kollajen hizalama derecesi, kollajen akış hızı ile modüle edilir, böylece daha yüksek kollajen akış hızı daha iyi hizalama sağlar. Daha yüksek vakum basınçları ile birlikte daha dar kanalların kullanılması, kollajen ağının hizalanmasını arttırırken, düşük vakum basınçları ile birlikte kullanılan daha geniş bir kanal rastgele matrisler oluşturur. Bir kez ustalaştıktan sonra, düzgün bir şekilde yapılırsa kollajen jellerinin veya kanallarının dökülmesi iki buçuk saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, başlamadan önce bileşenleri kurmayı unutmamak önemlidir. Kollajen ile çalışmaya başladığınızda, hızlı bir şekilde çalışmanız gerekir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, 3D hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, hücre yapışmasını, göçünü ve üç boyutlu hücre dışı ortamlara istilasını keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, farklı yoğunluklarda kollajen jellerinin nasıl döküleceğini ve hem rastgele hem de hizalanmış kollajen matrislerinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.