Name: 3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması İn Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Keşfedin 3D kollajen jeller ve mikrokanallar kullanarak hücre göçünü incelemek için hizalanmış ve rastgele matrisler oluşturma yöntemini. Bu teknik, doku mühendisliği uygulamaları için hücre-ECM etkileşimlerini kontrollü şekilde çalışmanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar bu çalışmayı finanse edilmesi için hibe numaraları UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 ve T32-GM008692-18 kabul etmek istiyorum. Biz de BT-YANGIN analizi ile geliştirilmesi ve yardım için loci Jeremy Bredfelt ve Yuming Liu kabul.

1. Nötralizasyon, seyreltme ve 3D Soruşturma ve Hücresel Daralma Tahliller için Kollajen Çözümleri Polimerizasyonu <ol><li> steril doku kültürü kaputu buz üzerinde, kolajen (1: 1) ile nötralize 2x PBS içinde steril, buz gibi soğuk 100 mM HEPES, 15 ml konik bir tüp içinde pH 7.4 ile. çözüm homojen ve karıştırma girdaplar artık görünür olana kadar plastik pipet ile iyice karıştırın. karıştırma işlemi sırasında hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun. Buz üzerinde kısaca saklayın. </li><li> Hücre ortamı ile uygun bir konsantrasyona (vb RPMI, DMEM, gibi), nötrleştirilmiş kollajen seyreltilir. <ol><li> N = (D V *), V / (S / 2), N gerekli nötralize kollajen miktarı burada, İstenen kollajen konsantrasyonu olduğu denklem kullanarak, arzu edilen kollajen konsantrasyonunu yapmak için gerekli olan nötralize kolajen miktarını hesaplamak için istenilen kollajen konsantrasyonu son hacim ve S to hisse senedi kollajen konsantrasyonu başlangıç. </li><li> Hücre ve Hücre ortamı çözeltisi eklenerek hacim nötralize kolajen miktarını getirin. İyice karıştırın ve döküm için hazır olana kadar buz üzerinde saklayın. <ol><li> Örnek: (6 plaka veya 50 mm cam alt çanak jel döküm için tipik hacim), 2 mg / ml 1 ml jel hacminde jel, ilk istenilen son hacme göre, istenen konsantrasyonda (2 mg / ml) çarpma (1 mi). Bu numarayı (2 mg) alın ve şişe üzerinde listelenen stok konsantrasyonu (9.49 mg / ml) yarı yarıya bölün. Bu durumda, nötralize kollajen 0.42 ml ortam / hücre karışımı 0.58 ml ile sulandırılır. </li></ol></li></ol></li><li> Pipetleyin olmayan bir doku kültürü içine ya buz gibi soğuk kollajen / hücre / medya karışım 6-plaka veya 50 mm cam alt çanak tedavi. eşit çözüm yaymak için pipet ucu kullanın. NOT: collag dışındaki hücre eki veya büyümesini en aza indirmek için tedavi plaka olmayan bir doku kültürü kullanmak önemlidirjel En. </li><li> 15 dakika - yaklaşık 10, oda sıcaklığında polimerize olmaya bırakın. jeller polimerizasyon üzerine opak dönmelidir. </li><li> polimerizasyonu bitirmek için 60 dakika - opak döndü sonra, ek 45 37 ˚C için plaka veya çanağı hareket. </li><li> 45 Sonra - kuyu veya yemeğin çevresinde P200 pipet ucu çalıştırarak iyi yanlarından jeller medya 3 ml ve bırakın - 60 dakika, 2 ekleyin. Girdap çanak yavaşça jel serbest bırakmak için. kolajen jel ortam yüzen olmalıdır. </li></ol> 2. Western Blot, Celi Morfogenez ve Jel Gontractility Deneyi <ol><li> 10 gün deneyi - 7 için hücreleri ile seribaşı, 1.6 - sertliği ECM ile ilgili olarak protein düzeylerinin, morfolojisi veya hücresel kontraktilite değerlendirmek için, 1.1 göre kollajen jeller dökerek başlar. büyüme hızı ve confluency bağlı ampirik her hücre hattı ekim oranını belirlemek. 100.000 hücre / jel - 10 günlük bir deney için, tohum yoğunluğu 20,000 arasında olabilir. </li><li> ÖlçmekHücre kasılması, bir cetvel ya da bir kamera her 24 saat kullanarak veya uygun bir zaman aralığında jel çapını ölçün. Not: Buna ek olarak, mikroskop toplanan karşılık gelen görüntüler gibi acininin benzeri yapılar, epitelyal tübüller, cep çıkıntılar ve lameliapodia olarak, jel tohumlandı hücre çizgisinin morfolojik özellikleri karakteristikleri için incelenebilir. </li><li> Protein düzeylerini değerlendirmek Wozniak ve ark., 17 ve Gallagher et al. 18 de tarif edildiği gibi ilgi duyulan proteinlerin Western blot analizi için RIPA jeller tampon lize edildi ve prosesi ile ilgilidir. <ol><li> ÖNEMLİ: hücre hatları arasında kontraktilite karşılaştırmalarda, Lui tarafından belirtildiği gibi jeller elde edilebilir toplam DNA, için kasılma normalleştirmek, vd 19 veya Batı tarafından değişmeyen, temizlik proteini (histon, GAPDH, vb). blot analizi, Wozniak ve ark., 17 ve Gallagher et al de tarif edildiği gibi. 18. jel içinde sayma hücreler hemasitometre kullanarak ise, hücreleri konsantre olacak müteahhitlik jel gibi toplam jel alanına hücre sayısını normalleştirmek için emin olun. </li></ol></li><li> ortam 1 ml çıkarılması ve taze ortam 1 ml ile değiştirilmesi yoluyla 4 gün - Besleme jeller her 3. Ölçüm kontraktilitesinde ani bir artış neden olur taze medya / serum ilave olarak alındıktan sonra jeller beslemek için emin olun. </li></ol> Kollajen Fiber Uyum PDMS Mikrokanallarda 3. Nesil Not: hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için, PDMS mikro kanallarda (Şekil 2A) için bir kalıp yumuşak litografi 15 aracılığıyla yapılan bir SU-8 silikon ustası gerektirir. <ol><li> PDMS kanalları yapmak için, bir zanaat sopayla tek kullanımlık fincan iyice PDMS karıştırın. 6 inç silikon ana için, sertleştirme maddesi 2 g elastomer tabanı 20 g karıştırılır. </li><li> Gazlardan bir vakum basıncı altında bir vakum odasındaki tek fincan yerleştirerek PDMS karışımı550 mm Hg. Gazlardan 1 - 1.5 saat. </li><li> PDMS de-gazla birlikte, dökme için silikon ustası hazırlamak. Silikon usta tarafından izlenen bir ocak üzerine asetat film temiz bir levha koyarak hazırlayın. Mikrokanal kalıp yukarı baktığından emin olun. NOT: PDMS döküm ve kür sırasında, silikon ana asetat film iki levha arasına sıkışmış olacak. </li><li> 1 Sonra - 1.5 saat, vakum odasından de-gaz verilerek PDMS kaldırmak ve yavaş yavaş silikon usta üzerine dökün. ÖNEMLİ: hava kabarcıkları kaçının. master merkezinde dökün ve yerçekimi eşit bir şekilde yaymak için izin devam edin. NOT: PDMS açılan ana kenarına kadar tüm yol genişletmek gerek yoktur. </li><li> PDMS ustanın üzerine döküldükten sonra, silikon master ve PDMS üstüne asetat film bir ikinci tabaka uygulayın. Dikkatle, hava kabarcıklarını önlemek için aşağı PDMS / silikon ustanın üstüne ikinci şeffaflık sayfasını döndürün. Acele etme. PDMS artık eşit o yayılmalıdırver usta. </li><li> Yavaşça 1/8 &quot;akrilik levha takip şeffaflık üstüne bir lastik levha, yerleştirin. </li><li> akrilik levha üstünde üç 10 lb ağırlıkları ekleyin. Başlangıçta, ağırlıklar &quot;yüzer&quot; olacaktır. Onları daha fazla devam etmeden yerleşmek ve stabilize etmek için izin verin. </li><li> 4 saat 70 ˚C ve tedavi PDMS ocak gözü sıcaklığı ayarlayın. rahatsız önce 1 ek hr az soğumasını bekleyin. </li><li> Dikkatle gofret asetat film üst tabakayı soyun ve bir forseps ile kanalları kaldırmak. </li><li> hazır olana kadar tozsuz çanak saklayın kullanın. </li></ol> Kullanım 4. Hazırlayıcı PDMS mikro kanallar <ol><li> baş aşağı yeni, temiz asetat film üzerine yerleştirin kanalları. Keskin bir forseps ile dairesel hareketler kullanarak temizleyin tüm bağlantı noktaları (Şekil 2b). PDMS herhangi parçaları kaldırın. </li><li> Bir çakmak bez olarak bant ambalaj bir parça kullanarak temiz kanalları. tezgah yüzeyinin (yukarı yapışkan tarafı) bant yapıştırıp, sonra kanal o setn üst. iyi temas sağlamak için forseps yuvarlak ucuyla kanallarda bastırın. Çıkarın ve görünür artıklar kadar her iki tarafta da tekrarlayın. </li><li> Aktarım temizlenmiş,% 70 EtOH ile 50 ml&#39;lik bir konik içine PDMS kanalları prepped. 30 saniye boyunca en yüksek hızda vorteksleyin. EtOH atın ve taze% 70 EtOH ile değiştirin. kadar hazır% 70 EtOH mağaza kullanmak için. </li><li> doku kültürü kaputu ve aseptik teknikler kullanılarak yılında temiz ve steril cam kapak veya cam alt yemekler PDMS kanalları aktarın. EtOH çekinceye kadar kanal tarafı yukarı ve UV tedavi koyun. </li><li> kanallar coverglass aşağı doğru bakacak böylece bir kez kuru, PDMS çevirin. iyi bir sızdırmazlık yapmak için camın üzerine PDMS kanalı aşağı doğru bastırın. Kapsayacak şekilde steril PDMS bir yama ekleme / merkez noktasını kapatın (port B Şekil 2b). Devam etmeden önce iyice kurumasını bekleyin. </li><li> Ön kaplama, steril su içinde 10 ug / ml kolajen kanalın içinde. kaplamak için, bir chann üstüne bir 100 ul damlacık yerEl ve vakum ile doğru çizin. 37 ° C&#39;de 1 saat sonra, bir buzdolabı kollajen kaplama solüsyonu ile doldurulmuş aktarım kanalları. 30 dakika - yaklaşık 15 soğutun. </li><li> Aspiratör veya pipet ile kollajen kaplama çözümü çıkartın ve kollajen hazırlık başlar. </li></ol> Mikrokanallarda Kullanım 5. Kollajen Hazırlık <ol><li> 2x PBS, pH 7.4 içinde, buzla soğutulmuş 100 mM HEPES: Buz üzerinde, kolajen (1: 1) etkisiz hale getirir. homojen hale gelinceye kadar iyice karıştırın (Daha fazla bilgi için, bölüm 1.1). </li><li> hücre medya ile uygun konsantrasyonlarda için nötralize kollajen seyreltin (Daha fazla bilgi için, bölüm 1.2). Buz üzerinde 15 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Aynı zamanda, soğutma, buz üzerinde kanal monte edilebilir. NOT: amaç altında 4 ˚C veya kanal işlemi için tüm bileşenleri sahip olmaktır. Kollajen çekirdeklenme sıcaklığı ve süresi polimerizasyon işlemi için anahtar parametreler ve gerekirse daha fazla optimizasyon için başlangıç ​​noktası olabilir. </li><li> CounBu zamanda uygun tohumlama yoğunluğunda bir hemasitometre ve tekrar süspansiyon T hücreleri. 3.000.000 hücre / ml - hesaplamalar kolaylığı için, 1 ila yeniden süspanse edin. (Daha fazla bilgi için, aynı zamanda bölüm 2.1). </li><li> Hücreler sayılmış ve 15 dk geçtikten sonra, dökme kolajen geçin. </li></ol> 6. Bağlantısızlar ve Random Kollajen mikro kanallar dökme <ol><li> kanallardan kollajen çizmeden önce, ayarlamak ve bir satır içi vakum regülatörü ile vakum basıncını ayarlayın. Vakum basıncı neden ve hizalama derecesini belirler kolajen akış hızını kontrol etmek için bir kuvvet sağlar. <ol><li> rastgele veya hizalanmamış matrisler için, 10 mm Hg veya daha düşük bir vakum basıncı ile geniş bir kanal (3 mm genişlik x 200 mm boyunda) kullanın. </li><li> hizalanmış matrisler için, 60 mm Hg ya da daha yüksek bir vakum basıncı ile dar bir kanal (1 mm genişlik x 200 mm boyunda) kullanın. </li></ol></li><li> buz monte kanalı çıkarın ve laminer akış h temiz, sterilize bir yüzeye yerleştirinood. </li><li> (Şekil 2b) port A içine nötralize kollajen 150 ul - hızlı çalışır ve 120 yükleyin. </li><li> C çıkışı (Şekil 2b) üzerindeki vakum hattına bağlı bir 25 ml&#39;lik pipet yerleştirerek kanal boyunca kollajen çizin. Tek, tek biçimli bir hareketle aracılığıyla kollajen çizin. ÖNEMLİ: rastgele veya hizalanmamış matrisler için, kanal genelinde yavaşça kolajen çizin (yaklaşık 0,5-1 saniyede mm) ve sonuna ulaştığında durur. hizalanmış matrisler için, daha hızlı karşısında kollajen çizmek, ama hava kabarcıklarını önlemek için özen gösterin. </li><li> Dikkatle P200 Pipetman veya aspiratör ile liman bölgesinden aşırı kollajen çıkarın. </li><li> A ve C. Tüm bağlantı noktaları şimdi ele alınmalıdır hem bağlantı noktaları üzerinden steril PDMS yamaları yerleştirin. </li><li> 2 Sonra - 3 dakika, merkez PDMS yama (port B) çıkarın ve 2 eklemek - merkez portuna - (10 bin hücre 5) hücrelerin 3 ul. 15 dakika - kısmen bir 10 Oda sıcaklığında (opak dönüş) polimerize olmaya bırakın. </li><li> 10 sonrası- 15 dakika, ek 15 37 ˚C transfer - polimerizasyon bitirmek için 30 dakika. PDMS kapaklarını çıkarın ve gerektiği gibi tamamen kanal ve kültür hücreleri kapsayacak şekilde medyayı ekleyin. Hücreler, eski medya ml çıkarılması ve yeni medya ml değiştirerek beslenebilir. </li></ol>

<ol><li>Conklin, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+collagen+is+a+prognostic+signature+for+survival+in+human+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma.</a> Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4, 38(2006).</li>
<li>Riching, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+collagen+alignment+limits+protrusions+to+enhance+breast+cancer+cell+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence.</a> Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).</li>
<li>Even-Ram, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+3D+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration in 3D matrix.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 524-532 (2005).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cell+migration%3A+a+multiscale+tuning+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+with+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell interactions with three-dimensional matrices.</a> Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).</li>
<li>Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK-generated+contractility+regulates+breast+epithelial+cell+differentiation+in+response+to+the+physical+properties+of+a+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix.</a> J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+density-induced+mechanoregulation+of+breast+cell+phenotype%2C+signaling+and+gene+expression+through+a+FAK-ERK+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage.</a> Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).</li>
<li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11(2008).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho%2FROCK-dependent+matrix+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).</li>
<li>Guo, C., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+and+magnetic+field+induced+collagen+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Flow and magnetic field induced collagen alignment.</a> Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).</li>
<li>Sung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+3-dimensional+collagen+matrix+polymerization+for+reproducible+human+mammary+fibroblast+cell+culture+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices.</a> Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).</li>
<li>Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+alignment+of+collagen+fibers+for+in+vitro+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture.</a> Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).</li>
<li>Wozniak, M. A., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+three-dimensional+collagen+gels+to+study+mechanotransduction+in+T47D+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells.</a> Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).</li>
<li>Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGallagher%2C+S+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18(2008).</li>
<li>Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+X+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14(2013).</li>
<li>Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+mechanical+properties+of+three-dimensional+type+I+collagen+extracellular+matrices+with+varied+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure.</a> J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).</li>
<li>Bredfeldt, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+segmentation+of+collagen+fibers+from+second-harmonic+generation+images+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer.</a> J Biomed Opt. 19, 16007(2014).</li>
<li>Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+model+of+ductal+carcinoma+in+situ+with+3D%2C+organotypic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure.</a> BMC Cancer. 15, 12(2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok

3D kollajen jeller hücreleri yorumlamak anlamak ve kendi yerel mikroçevresinin yanıt vermek alet değerli bir katkı vardır. Bu el yazması bir 3D kollajen matriks içinde hücreleri gömmek için çok temel bir protokol sağlamıştır ve tekrarlanabilir rastgele veya hizalanmış kollajen lifleri ile matrisler oluşturmak için. Her iki protokol, farklı kollagen izoformlar, çapraz bağlayıcılar, ve diğer matris proteinleri, potansiyel olarak polimerizasyon sırasında ilave edilebilir şekilde adapte platformlar çalışır. Ayrıca, gen ifad...

Birçok hücresel süreç, 2 boyutta kapsamlı bir şekilde incelenmiştir, böylece temel hücre sinyal mekanizmaları hakkında kolektif bir bilgi oluşturulmuştur. Bununla birlikte, bu çalışmalar, yerel hücresel mikro çevrenin ve hücre dışı matrisin (ECM) yapısal ve mekanik özelliklerinden alınan önemli hücresel ipuçlarını ihmal etmektedir. Hücrelerin fizyolojik bir bağlamda nasıl etkileşime girdiğini daha iyi anlamak için, onları 3 boyutlu (3D) tahlillerde incelemek önemlidir. Bu 3D tahliller için ECM, hücre kaynaklı olabilir veya saflaştırılmış proteinlerden yeniden yapılandırılabilir. ECM'nin kaynağı ne olursa olsun, 3D matris tahlillerinin, hücrelerin fizyolojik dünyada nasıl gezindiğini ve etkileşime girdiğini anlamak için paha biçilmez olduğu kanıtlanmıştır. Örneğin, 3D matrislerde büyütülen hücreler, 2D deneyleri4-6'da gözlemlenmeyen, çevrelerindeki ECM'nin mekanik doğasına bağlı olarak farklı hareket modları gösterir. Ayrıca, 3D olarak kültürlenen hücreler, cam veya plastik gibi sert yüzeylerde yetiştirilen muadillerine göre daha az ve daha az belirgin stres liflerine ve fokal yapışmalara sahiptir7. 
Bununla birlikte, bağlamsal 3D tahlillerin önemi hücre göçü ile sınırlı değildir. Diğer bazı hücre sinyalleme olayları yalnızca 3D tahliller kullanılarak araştırılabilir. Doku ve hücre farklılaşması sırasında, hücre dışı ortamın sertliği ve ECM, morfojenik olayları etkileyebilecek sinyaller sağlar. Örneğin, meme epitelyal tubulogenezi yalnızca düşük sertlikteki 3D matrislerde meydana gelir, ancak sert matrislerde veya 2D substrata8,9'da meydana gelmez. Sert 3D matrisler içinde kültürlendiğinde, bu aynı epitel hücreleri, değiştirilmiş FAK ve ERK sinyali10 boyunca sürülen artan proliferasyon ve hücre zarı çıkıntıları ile anormal bir fenotip alır. Diğer birçok sinyalleşme yolunun ve hücresel sürecin, yerel hücresel ortamın sertliğinden benzer şekilde etkilendiği bilinmektedir ve bu sinyal kaskadları, bir 3D ECM'nin uygun yerel mekanik özellikleri bağlamında sinyalleme olaylarının ve hücresel fenotipin araştırılmasının önemini vurgulamaktadır. 
Kollajen I, ECM'nin en bol bulunan bileşeni olduğu ve hücresel mikro çevrenin mekanik özelliklerinin çoğundan sorumlu olduğu için in vitro çalışmalar için özellikle ilgili bir proteindir. Başlangıçta sadece yapısal bir protein olarak düşünülürken, rolünün şimdi çok daha karmaşık olduğu bilinmektedir. Kollajen lifi bileşimi, mimarisi, oryantasyonu, yoğunluğu ve sertliğinin tümü konsantre bir sinyal bilgisi ortamı sağlar5. Kronik inflamasyon ve tümör oluşumu gibi bazı hastalıkların ilerlemesi sırasında, kollajen ağı önemli ölçüde yeniden şekillenir2,11. Daha spesifik olarak meme kanserlerinde, artmış kollajen birikimi ve doku sertliği eşlik eder ve muhtemelen tümör ilerlemesine katkıda bulunur. Bu erken tümörlerde, sertleşmiş kollajen ağı gergin ve daha hizalı görünür, öyle ki liflerin çoğu büyüyen tümörü kapsar2. Tümör ilerledikçe, kollajen yeniden organize olmaya devam eder ve fibriller ağın bölgeleri tümör sınırına dik olarak yönlendirilir2,12. Dikey hizalama, bu hastaların hastalıksız progresyonunun ve genel sağkalımının daha kötü olduğu durumlarda prognostik bir biyobelirteç görevi görür1. Bu korelasyonun bir açıklaması, kötü sonuçların, hizalanmış kollajen ağlarında kalıcı hücre göçü yoluyla tümör hücrelerinin artan yayılmasının bir sonucu olmasıdır3. 
Hücrelerin, tümör ilerlemesinde gözlenen hizalama ve organizasyona spesifik olarak nasıl tepki verdiğini anlamak için, deney için hem rastgele hem de hizalanmış 3D kollajen matrisleri oluşturmak gerekir. Fibriller ağlar içinde hizalamayı indüklemek için üç temel metodoloji vardır. İlk teknik, hizalama oluşturmak için iki nokta arasındaki kolajenin büzüldüğü veya gerildiği bir gerilme indükleyici cihaz kullanır. Kuvvet eksenine paralel lifler gergin olarak çekilirken, eksene dik olan lifler sıkıştırılır ve burkulur. Zorlanma kaynaklı teknikler tipik olarak mükemmel hizalama sunarken, bu yaklaşım birçok platforma kolayca uyarlanamayan hantal ekipman gerektirir3,13. Alternatif olarak, hücre kaynaklı suş, daha sonra kollajeni kasılan ve hizalayan lokalize hücre tıkaçları yerleştirilerek oluşturulabilir13. Bu yöntem, birçok parametrenin değişebileceği için değişken olma sorununa sahiptir. İkinci yöntem, kollajen hizalamasını indüklemek için polimerizasyon sırasında manyetik boncuklar ve bir manyetik alan kullanır13,14. Karmaşık olmayan ekipmanlarla bu yöntemden iyi sonuçlar elde edilebilir, ancak polimeri manyetize etmek için antikorların veya başka bir yöntemin kullanılmasını gerektirir. Bu nedenle, kullanımı biraz pahalı olabilir ve kollajen jelinin sertliği, ağdaki artan bağlantılar tarafından potansiyel olarak değiştirilir. Ayrıca, bu işlemde kullanılan manyetik boncuklar genellikle otofloresandır ve bu da görüntüleme deneyleri için sorunludur. Son olarak, hizalama PDMS mikroakışkan kanalları3,15,16 tarafından oluşturulabilir. Bu yöntemde kollajen hizalaması, polimerize kollajenin küçük mikroakışkan kanallardan akıtılmasıyla sağlanır. Bu mikroakışkan kanallar çok sayıda tasarımda yapılabilir ve birçok platforma kolayca uyarlanabilir. Ayrıca, küçük boyutları nedeniyle çok küçük miktarlarda kollajen ve diğer reaktifler kullanıldığından çok ekonomiktirler.
Burada, hücreleri 3 boyutlu, fibriller kollajen hidrojel içine gömmek için basit bir protokol verilmiştir. Ek olarak, kollajen matrisinin organizasyonunu ve hizalamasını kontrol etmek için PDMS mikroakışkan kanallarının kullanıldığı daha gelişmiş bir teknik de sağlanır. Bu protokol birçok platforma kolayca uyarlanabilir ve 3 boyutlu, fizyolojik bir mikro ortamda hücre göçü, hücre bölünmesi ve diğer hücresel süreçlerin araştırılması için hem hizalanmış hem de rastgele kollajen matrislerini tekrarlanabilir şekilde üretebilir.

<table><tbody><tr><td>Yüksek Konsantrasyonlu Sıçan Kuyruğu Kollajen</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>SylGard184 elastomer kiti</td><td>PDMS kanalları için</td><td>Corning</td><td>NC9285739</td> Elastomer</tr><tr><td>HEPES nötralizasyon tamponu</td>için<td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310</td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>HEPES nötralizasyon tamponu için</td> <td>Fisher</td><td>BP366</td></tr><tr><td>KH2PO4 HEPES</td> <td>nötralizasyon tamponu için</td> <td>Fisher</td><td>BP362</td></tr><tr><td>Na2HPO<>sub4 HEPES</td> <td>nötralizasyon tamponu için</td> <td>Fisher</td><td>S374</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>HEPES nötralizasyon tamponu</td></tr><tr><td>için Levy Geliştirilmiş Neubauer Hemasitometre</td><td>Fisher</td><td>15170-208</td><td>hücre sayımı</td></tr><tr><td>6 oyuklu doku dışı kültür plakası&nbsp;</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>50 mm cam alt çanak</td><td>MatTek</td><td>P50g-1.5-30-f</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Plastik Vakum Kurutucu</td><td>Bel-Art</td><td>F4200-2021</td><td>PDMS şeffaflık filmi için gaz giderme odası</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>3M</td><td>pp2950</td><td>Pdms kanallarını dökmek için plastik film</td></tr><tr><td>ThermoScientific CimaRec</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>HP141925</td><td>PDMS mikro kanallarını sertleştirmek için sıcak plaka</td></tr><tr><td>Vakum regülatörü</td><td>Hassas Medikal</td><td>PM3100</td><td>Kollajen mikrokanallar için vakum regülatörü</td></tr><tr><td>8" x 8" kauçuk levha</td><td>Amazon - Kauçuk-Cal</td> Silikon - <td>PDMS mikro kanalını dökmek için</td><td>60A</td> kauçuk levha</tr><tr><td>8" x 8" x 0.125" akrilik levha</td> PDMS mikro kanallarını dökmek için <td>Amazon</td><td>Pleksiglas levhalar</td><td></td></tr><tr><td>10 lb ağırlıklar</td><td>Amazon</td> CAP <td>PDMS mikro kanallarını dökmek için</td><td>halter</td></tr><tr><td>15 ml Konik tüpler</td><td>Fisher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Konik tüpler</td><td>Fisher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Plastik pipetler</td><td>Dot Scientific</td><td>229202B, 229206B ve 667225B</td><td>2&nbsp; ml, 5&nbsp; ml ve 25 nbsp; ml</td></tr><tr><td>%70 EtOH</td><td>Fisher</td><td>NC9663244</td><td></td></tr></tbody></table>

3d etkileşimleri Çalışmaları 3d kollajen jeller ve mikrokanallarda hazırlanması<em&gt; İn vivo</em

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Tarihsel olarak, çoğu hücresel süreç sadece 2 boyutta incelenmiştir. Bu çalışmalar genel hücre sinyalleme mekanizmaları hakkında bilgilendirici olsa da, yerel mikro çevrenin ve hücre dışı matrisin (ECM) yapısal ve mekanik özelliklerinden alınan önemli hücresel ipuçlarını ihmal etmektedir. Hücrelerin fizyolojik bir ECM içinde nasıl etkileşime girdiğini anlamak için, onları 3 boyutlu tahliller bağlamında incelemek önemlidir. Hücre göçü, hücre farklılaşması ve hücre proliferasyonu, 3 boyutlu bir ECM'nin mekanik özelliklerindeki yerel değişikliklerden etkilendiği gösterilen süreçlerden sadece birkaçıdır. ECM'nin temel bir fibriler bileşeni olan kollajen I, bir dokunun basit bir yapısal elemanından daha fazlasıdır. Normal koşullar altında, kollajen ağından gelen mekanik ipuçları morfogenezi yönlendirir ve hücresel yapıları korur. Tümör mikroçevresi gibi hastalıklı mikro ortamlarda, kollajen ağı genellikle dramatik bir şekilde yeniden şekillenir, bu da değişmiş bileşim, gelişmiş birikim ve değişmiş lif organizasyonu gösterir. Meme kanserinde, tümör sınırına dik hizalanmış liflerdeki bir artış, daha kötü hasta prognozu ile ilişkili olduğundan, lif hizalama derecesi önemlidir1. Hizalanmış kollajen matrisleri, kalıcı göç yoluyla tümör hücrelerinin yayılmasının artmasına neden olur2,3. Aşağıdakiler, hücreleri 3 boyutlu, fibriller kollajen hidrojel içine gömmek için basit bir protokoldür. Bu protokol birçok platforma kolayca uyarlanabilir ve ayarlanabilir, 3 boyutlu, fizyolojik bir mikro ortamda hücre göçü, hücre bölünmesi ve diğer hücresel süreçlerin araştırılması için hem hizalanmış hem de rastgele kollajen matrislerini tekrarlanabilir şekilde üretebilir.

3D deneyler kollajen jel ile aynı sertlik içinde yapılabilir ise, jel sertliği farklı hücreler, hücresel mikro-mekanik değişikliklere cevap verecek belirlemek için kullanılabilir. Bir sert kollajen hidrojel gömülü hücreler lokal çevredeki kolajeni sözleşme edemiyoruz bir jel olarak tanımlanır. Farklı hücre tipleri iç kontraktilite benzersizdir ve bu nedenle uyumlu bir şekilde ve sert algılanan olan kollajen konsantrasyonunu belirlemek için basit bir kontraktilite eğrisi ile başlamak en i...

Kolajen ECM temel bir bileşenidir ve göç farklılaşma ve çoğalması kadar çeşitli hücresel süreçler için gerekli ipuçları sağlar. 3D kolajen hidrojellerin içinde hücreleri gömmek için bir protokol ve PDMS mikrokanallar kullanılarak randomize veya hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için daha gelişmiş bir teknik burada sağlanmıştır.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Bu prosedürün genel amacı, 3D ortam bağlamında hücre göçünü veya diğer hücresel süreçleri gözlemlemek amacıyla hizalanmış ve rastgele 3D kolajen matrisler oluşturmaktır. Bu yöntem, gerçek dokularda bulunan kolajen özelliklerini yakalamak üzere tasarlanmıştır ve bu durum, hücrelerin hizalanmış veya rastgele bir hücre dışı matrisi tanımak için kullandıkları mekanizmalar gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, 3D ortamın organizasyonunu manipüle edebilmeniz, içindeki hücreleri görüntüleyebilmeniz ve bunu yaygın olarak bulunan ekipmanlarla maliyet etkin bir şekilde yapabilmenizdir.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, kollajen çözeltisini ve nötralizasyon tamponunu yeterince iyi karıştırmadıkları ve kollajeni kanallar boyunca tutarsız bir şekilde çektikleri için zorluk yaşarlar. Bu prosedürü, laboratuvarımda kıdemli bilim insanı olan Brian Burkel uygulamalı olarak gösterecektir. Başlamak için, kollajenin uygun şekilde nötralize edilmesini sağlamak amacıyla, hücreleri ve medyumu eklemeden önce kollajen ve HEPES tamponunu iyice karıştırın.Ardından, hücreleri ve medyumları nötralize edilmiş kolajen karışımına ekleyin ve beraberindeki metin p

preparation-3d-collagen-gels-microchannels-for-study-3d-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Gömülü hücreler ve yüzey içeren modüller olarak adlandırılan silindirik kollajen jeller, mikro-dokuların oluşturulması endotel hücreleri ile kaplanmıştır.

Kollajen, Modüller kullanarak Micro-dokuların Fabrikasyon İçeren Hücreleri Jel

Bu makalede, floresan daha düzeltme ve 3D-hücre kültürleri canlı görüntüleme için kullanılabilir kollajen etiketlemek için bir yöntem sunar. Ayrıca 3D ortamlarda kültür hücrelerinin endojen iskelet proteinleri görselleştirmek için optimize edilmiş bir protokol sağlar.

3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya

Mekanik özellikler ve hücre dışı matris mikro güçlü hücre 3D göç etkiler. In vitro bir yöntem, nüfus ve tek tek hücre düzeylerde biyofiziksel değişken ortamlarda uzaysal hücre göçü davranışı incelemek için, tarif edilmektedir.

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

Bu çalışmada, kollajen, düz kas hücreleri ve endotel hücrelerinin doğrudan kültürlenmesi yoluyla canlı vasküler dokuların hızlı bir şekilde üretilmesi için bir teknik sunuyoruz. Ek olarak, tasarlanmış vasküler dokuların mekanik karakterizasyonu için yeni bir protokol tanımlanmıştır.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Hücre göçü, insan gelişiminin ve yaşamının önemli bir parçasıdır. Hücre göçünü değiştirebilecek mekanizmaları anlamak için, mevcut tahlillerin modern difüzyon odası sınırlamalarının üstesinden gelmeye izin veren bir 3D kollajen matrisinde kemotaksisi araştırmak için düzlemsel bir gradyan difüzyon sistemi sunuyoruz.

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

Bu yazıda, üç boyutlu (3D) tek tip diziler ekstraselüler matriks çevrili tanımlanan geometri epitel doku mühendisi yumuşak litografi tabanlı teknik anlatılmaktadır. Bu yöntem, hücre tipleri ve deneysel bağlamlarda çeşitli için uygun olan ve aynı çoğaltır yüksek verimli tarama sağlar.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

Bu el yazması endotele fizyolojik özelliklerini recapitulate mikrodamarlar mühendisi bir enjeksiyon kalıplama yöntemi sunar. Mikroakışkan tabanlı süreç böyle akışı, hücresel kompozisyon, geometri ve biyokimyasal geçişlerini olarak Uyarlanabilen koşullar, patent 3D damar ağları oluşturur. üretim süreci ve potansiyel uygulama örnekleri açıklanmıştır.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

Burada, bağışıklık hücreleri ışık sayfalık mikroskobu kullanarak üç boyutlu (3D) kolajen dizey içinde gömülü görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı da hücre göç 3D iz sürmeyi ayrıntılandırdığı. Bu iletişim kuralı 3D Matris hücrelerinde süspansiyon diğer türleri için istihdam edilebilir.

İnsan bağışıklık hücreleri üç boyutlu görselleştirme için ışık sayfalık mikroskobu

Burada, 3D matrislerde büyüyen akons davranışlarını analiz etmek, doğal gelişimini taklit etmek için bir yöntem sağlıyoruz.

Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

Bu protokol, lifleri bir 3D kollajen hidrojel (kalınlığı &lt;250 μm) hizalamak için uzatma gerinim (germe) oluşturmak için sıvı akış yönü boyunca değişen geometriye sahip bir mikroakışkan kanalın kullanımını göstermektedir. Ortaya çıkan hizalama birkaç milimetre boyunca uzanır ve uzatma gerinim hızından etkilenir.

Uzun Menzilli Fiber Hizalamalı Mikromühendislik 3D Kollajen Hidrojelleri

Burada, IDG-SW3 hücrelerini üç boyutlu (3D) hücre dışı bir matriste kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

IDG-SW3 Üç Boyutlu Hücre Dışı Matriste Hücre Kültürü

Keşfedin 3D kollajen jeller ve mikrokanallar kullanarak hücre göçünü incelemek için hizalanmış ve rastgele matrisler oluşturma yöntemini. Bu teknik, doku mühendisliği uygulamaları için hücre-ECM etkileşimlerini kontrollü şekilde çalışmanıza olanak tanır.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması

Daha fazla video keşfet