Model siyanobakteri Türlerinde İşaretli ve belirtisiz Mutants Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, siyanobakteriyel Synechocystis türlerinde işaretlenmemiş mutantlar ve PCC6803 Synechococcus türlerinde işaretlenmemiş mutantlar üretmek için bir sistem göstermektir PCC7002. Bu yöntem, siyanobakteri genetiği alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Kromozomal değişikliklerin bir suşa nasıl dahil edileceği gibi.

Bir antibiyotik direnç geninin eklenmesi ve ardından negatif seçilebilir bir işaretleyici kullanılarak bu kasetin daha sonra çıkarılmasıyla. Bu tekniğin temel avantajı, suşların tekrar tekrar genetik olarak manipüle edilebilmesidir. Bir suşa istenildiği kadar çok alternatifin sokulmasına izin vermek.

Ortamı hazırladıktan sonra, siyanobakteri suşları ve plazmitler, metin protokolüne göre. Siyanobakteri hücreleriyle dolu bir halkayı 30 ila 50 mililitre BG11 ortamına aşılayarak taze bir kültür oluşturun. Kültürü ışıkta iki ila üç gün boyunca 30 santigrat derecede, 0,2 ila 0,6'ya eşit bir OD7500'e büyütün.

İnkübasyonun ardından, kültürün bir ila iki mililitresini beş dakika boyunca 2.300 g'da santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı attıktan sonra, peletleri bir kez yıkamak için BG11 ortamını kullanın, hücreleri yeniden süspanse etmek için hafifçe pipetleyin. Girdap, DNA alımı için gerekli olan pililerin kaybına neden olabilir.

Hücreleri tekrar peletledikten ve süpernatanı çıkardıktan sonra, 100 mikrolitrelik son hacme BG11 ortamı ekleyin ve hücreleri 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Daha sonra, hücrelere önceden hazırlanmış 1 mikrogram plazmit A ekleyin. Ve karıştırmak için hafifçe vurun.

Daha sonra tüpleri inkübatörde 30 santigrat derecede yatay olarak yerleştirin ve dört ila altı saat inkübe edin. İnkübasyonu takiben, hücre kültürü plazmid DNA karışımının alikotlarını antibiyotik kullanmadan BG11 agar plakalarına yayın. Ve 30 santigrat derecede inkübe edin.

Yaklaşık 24 saat sonra, kanamisin içeren suda% 0.6'lık bir agar çözeltisi hazırlayın. Ve 42 derece Santigrat'a kadar soğumaya bırakın. Daha sonra kültür plakalarının kenarlarına 2,5 ila üç mililitre ekleyin ve plakayı eğin, böylece çözelti yüzeyde eşit bir üst agar tabakası oluşturur.

Kolonilerin görünür olması için plakaları yaklaşık yedi gün inkübe edin. Daha sonra taze bir BG11 agar artı kanamisin plakasını altı sektöre bölün. Ve tek tek kolonileri çizmek için keskin uçlu bir kürdan kullanın.

PCR'yi gerçekleştirmek için, işaretli nakavtı doğrulamak için, az miktarda hücreyi 50 mikrolitre su ve yaklaşık 20 425 ila 600 mikrometre cam boncuk içeren bir tüpe aktarın. Hücreleri ve boncukları beş dakika boyunca yaklaşık 2.000 rpm'de çalkalayın, ardından beş dakika boyunca 15.700 g'da döndürün. Daha sonra, yapışkan DNA ön hazırlıkları ile 50 mikrolitre PCR reaksiyonları hazırlamak için beş mikrolitre süpernatan kullanın.

Mutantları doğrulamak için, metin protokolüne göre primerler tasarladıktan sonra, aşağıdaki programı kullanarak ürünü büyütün ve vahşi tip bir kontrol ekleyin. Jelelektroforezler aracılığıyla, nakavt dönüştürücülerin genotipini doğrulayın. Yaklaşık dört kilobaz çiftinden oluşan bir bant gösteriyor ve vahşi tip banttan yoksun.

Daha fazla ayrıntı için metin protokolüne bakın. Vahşi tip bir bant hala mevcutsa, suşu taze plaka üzerinde yeniden çizin ve PCR'yi tekrarlayın. Mutant ayrılana ve PCR reaksiyonunda vahşi tip bant gözlenene kadar doğrulama işlemini tekrarlayın.

İşaretli mutant profili gösteren bir suş için, işaretsiz bir nakavt oluşturmada kullanmak üzere yeni bir plaka üzerinde yeniden çizgi çizin. İşaretlenmemiş Synechocystis mutantları oluşturmak için, hücrelerle dolu döngüyü 30 ila 50 mililitre BG11 ortamına aşılayarak işaretli nakavtın taze bir kültürünü oluşturun. Kültürü iki ila üç gün boyunca OD750'ye kadar büyütün, 0,2 ila 0,6'ya eşit.

Kültürün 10 mililitresini 2.300 g'da beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Sonra hücreleri nazikçe yıkamak için BG11 ortamı. BG11'i 200 mikrolitrelik bir son hacme ekledikten ve hücreleri 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktardıktan sonra, hücrelere 1 mikrogram plazmit B DNA'sı ekleyin ve karıştırmak için hafifçe vurun.

Daha sonra tüpleri inkübatöre yatay olarak yerleştirin ve dört ila altı saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 1.8 mililitre BG11 ortamı ekleyin ve numuneleri çalkalayarak toplam dört gün inkübe edin. Bu, çoklu kromozomal kopyalarda rekombinasyonun meydana gelmesine izin vermek için yeterli bir zamandır.

Dönüştürülmüş kültürün 50, 10 ve 1 mikrolitrelik alikotlarını BG11 ve% 5 sükroz agar plakalarına yerleştirin ve tek koloniler oluşturmak için yaklaşık yedi gün inkübe edin. Daha sonra, künt uçlu bir kürdan kullanarak, BG11 artı kanamisin plakaları üzerinde 30 ila 50 ayrı koloniyi yumurtadan çıkarın. Ardından BG11 artı %5 sükroz üzerine yama yapın.

BG11 artı sükroz üzerinde büyüyen, ancak kanamisin içeren plakalarda büyümeyen koloniler, potansiyel işaretsiz nakavtlardır. Her iki plakada büyüyen kolonilerin, sakB genindeki bir mutasyon nedeniyle sakaroza dirençli olması muhtemeldir. Bu videoda daha önce gösterilen PCR yöntemini takiben, vahşi tip boyutundan silinen bölgeye karşılık gelen bir jel bandı üretecek olan işaretlenmemiş nakavtları doğrulayın.

Suş işaretlenmemiş bir mutant profili gösteriyorsa, antibiyotik olmadan taze BG11 agar üzerinde tekrar sürün. Suşları uzun süre saklamak için, hücrelerle dolu bir halkayı 30 ila 50 mililitre BG11 ortamına aşılayarak suşun taze bir kültürünü oluşturun. Kültürü üç ila dört gün boyunca büyütün ve OD750'yi 0,4 ila 0,7'ye eşit hale getirin.

Hücreleri bir kez yıkamak için BG11'i kullandıktan sonra, peleti yaklaşık iki mililitre BG11 içinde yeniden süspanse edin. Bir tüpe 0.8 mililitre konsantre hücre ekleyin. Ardından 0,2 mililitre% 80 filtre ile sterilize edilmiş gliserol ekleyin.

Başka bir tüpe 0.93 mililitre konsantre hücre ve 0.07 mililitre DMSO ekleyin. Her iki tüpü de eksi 80 santigrat derecede saklayın. Suşları canlandırmak için tüpü çıkarın ve bazı hücreleri antibiyotik kullanmadan bir agar plakasına kazımak için künt uçlu bir kürdan kullanın.

Ardından normal şekilde çizmek için steril bir halka kullanın. Bu şekil, delesyon mutantları oluşturmak için kullanılan plazmit A ve B örneklerini göstermektedir. Her durumda, beş asal ve üç asal planking bölgesi yaklaşık 900 ila 1.000 baz çiftidir.

Plazmid B, ayrıca beş asal ve üç asal arasında yaklaşık bir kilobaz çifti yan bölgeleri içeren bir gen kaseti içerebilir. Veya doğal gen dizisinin değiştirilmiş bir versiyonu. Plazmid A ile transformasyon üzerine, yedi ila 10 gün sonra bir plaka üzerinde birkaç yüz koloni görünecektir.

Genler gerekli değilse ve mutantlar, vahşi tip suşa benzer şekilde büyüme gösteriyorsa, tüm kromozomlar, PCR ile belirlendiği gibi bir kopya npt1/sacB eklenmiş dizi içermelidir. Genler gerekli değilse ve mutantlar yavaş büyürse, ayrılmış işaretli bir mutant elde etmek için artan kanamisin konsantrasyonları ile birkaç tur yeniden çizgi gereklidir. Yeniden çizgilenme üzerine, belirgin bir mutant elde edilmezse, gen muhtemelen hayatta kalmak için gereklidir.

Plazmid B ile transformasyondan elde edilen bireysel kolonilerin çoğu, kanamisine duyarlı ve sükroza dirençli olacaktır. Burada gösterildiği gibi, bu kolonilerde hedef bölgenin PCR amplifikasyonu, işaretlenmemiş mutant profilinin yaklaşık% 100'ünü göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa altı haftalık bir süre boyunca saatler içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, steril tekniği kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, fotosentetik oranların veya metabolit üretiminin ölçülmesi gibi ek soruları yanıtlamak için oksijen üretiminin ölçülmesi veya gaz kromatografisi kütle spektrometresi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, siyanobakteri genetiği alanındaki araştırmacıların önünü açtı.

Bu filumdaki temel biyokimyasal ve fizyolojik süreçleri ve endüstriyel amaçlar için gelişimsel suşları keşfetmek. Bu videoyu izledikten sonra, Synechococcus türlerinde PCC6803 işaretsiz nakavtların nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.