Name: Model siyanobakteri Türlerinde İşaretli ve belirtisiz Mutants Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Keşfedin, Synechocystis sp. PCC6803 ve Synechococcus sp. PCC7002 türlerinde işaretli ve belirtisiz mutant üretme yöntemini. Bu teknik, antibiyotik direnç geni ekleme ve negatif seçilebilir belirteç kullanarak tekrarlanabilir genetik manipülasyon sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Çevre Hizmetleri Birliği Eğitim Vakfı&#39;nın mali destek için Cambridge SynBio fonda Sentetik Biyoloji ve Sosyal Adalet ve Güçlendirilmesi, Hindistan Hükümeti Bakanlığı&#39;na müteşekkiriz.

<ol><li>Zwirglmaier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+phylogeography+of+marine+Synechococcus+and+Prochlorococcus+reveals+a+distinct+partitioning+of+lineages+among+oceanic+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes.</a> Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).</li>
<li>Galloway, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+cycles%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitrogen cycles: past, present, and future.</a> Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+cyanobacterial+alkane+production+to+the+ocean+hydrocarbon+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).</li>
<li>Howe, C. J., Barbrook, A. C., Nisbet, R. E. R., Lockhart, P. J., Larkum, A. W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The origin of plastids.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 2675-2685 (2008).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic%2C+respiratory+and+extracellular+electron+transport+pathways+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li>
<li>McCormick, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+production+through+oxygenic+photosynthesis+using+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+in+a+bio-photoelectrolysis+cell+%28BPE%29+system%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system.</a> Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).</li>
<li>Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+oxidase+mutants+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+show+increased+electrogenic+activity+in+biological+photo-voltaic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems.</a> Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).</li>
<li>Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cyanobacteria+to+generate+high-value+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering cyanobacteria to generate high-value products.</a> Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).</li>
<li>Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+phototrophs%3A+efficient+alternatives+to+land-based+crops+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).</li>
<li>Tan, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+natural+products+from+marine+cyanobacteria+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery.</a> Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).</li>
<li>Volk, R. B., Furkert, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antialgal%2C+antibacterial+and+antifungal+activity+of+two+metabolites+produced+and+excreted+by+cyanobacteria+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth.</a> Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).</li>
<li>Scott, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+algae%3A+challenges+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from algae: challenges and prospects.</a> Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycobilisome-deficient+strains+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803+have+reduced+size+and+require+carbon-limiting+conditions+to+exhibit+enhanced+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity.</a> Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thylakoid+terminal+oxidases+are+essential+for+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+to+survive+rapidly+changing+light+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities.</a> Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).</li>
<li>Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+production+in+genetically+modified+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).</li>
<li>Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+deletions+of+small+cab-like+proteins+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+-+Consequences+for+pigment+biosynthesis+and+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 - Consequences for pigment biosynthesis and accumulation.</a> J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).</li>
<li>Castenholz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+methods+for+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Culturing methods for Cyanobacteria.</a> Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).</li>
<li>Mitschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimentally+anchored+map+of+transcriptional+start+sites+in+the+model+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).</li>
<li>Ried, J. L., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+nptI-sacB-sacR+cartridge+for+constructing+directed%2C+unmarked+mutations+in+gram-negative+bacteria+by+marker+exchange-eviction+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis.</a> Gene. 57, 239-246 (1987).</li>
<li>Vieira, J., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pUC+plasmids%2C+an+M13mp7-derived+system+for+insertion+mutagenesis+and+sequencing+with+synthetic+universal+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.</a> Gene. 19, 259-268 (1982).</li>
<li>Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Engineered+Mutant+of+the+Cyanobacterium+Synechocystis+6803+Lacks+the+Photosystem-Ii+Chlorophyll-Binding+Protein+Cp-47%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).</li>
<li>Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+deletion+mutant+of+Synechocystis%3A+A+connection+between+bacterial+phage+shock+and+thylakoid+biogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).</li>
<li>Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+Is+Essential+for+the+Biogenesis+of+Photosystem+I+but+Not+Thylakoid+Membranes+in+Synechococcus+sp+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002.</a> J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).</li>
<li>Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+the+polyhydroxyalkanoate-specific+beta-ketothiolase+and+acetoacetyl+coenzyme+A+reductase+genes+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+strain+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803.</a> Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).</li>
<li>Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synechocystis+sp.+PCC6803+possesses+a+two-component+polyhydroxyalkanoic+acid+synthase+similar+to+that+of+anoxygenic+purple+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria.</a> Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).</li>
<li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803%2C+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

işaretsiz mutantların nesil en kritik adımlar şunlardır: 1) dikkatli plazmid tasarımı sadece hedeflenen bölge değişmiş sağlamak; 2) numuneler sukroz üzerine, özellikle kültür aksenik kalmasını sağlamak; 3) ile kaplanmış, ilk 24 saat sonra ağarı artı antibiyotik ilave edilir antibiyotikler, eksik BG11 agar plakaları üzerine işaretlenir mutant üretimi için hücrelerin transforme; 4) kültür BG11 artı sakaroz agar plakaları üzerinde kaplama öncesinde 4 tam gün mutantlar işaretlenmiş: 5) işaretli mutantlar tamamen ayrılmış ol...

Siyanobakteriler yeryüzünde hemen her doğal ortamda bulunan bakteri evrimsel eski ve çeşitli filum vardır. Deniz ekosistemlerinin onlar özellikle bol ve karbon fiksasyonu 1 yaklaşık yarısında, okyanuslardaki azot fiksasyonu 2 ve hidrokarbon üretimi 3 ton yüzmilyonlarca çoğunluğu yıllık muhasebe, birçok besin döngüleri önemli bir rol oynamaktadır. Kloroplastlar, ökaryot alglerin ve bitkilerde fotosentez için sorumlu organel bir konak organizmada 4 tarafından yuttu bir siyanobakteriye evrimleşmiş olması muhtemeldir. Siyanobakteri tesislerinde muhafaza birçoğu fotosentez, elektron taşıma 5 ve biyokimyasal yollar çalışma için faydalı model organizmalar kanıtlamıştır. Ilave siyanobakteriler giderek dolayı hi, elektrik 7 ve endüstriyel bileşikleri, 6 biyoyakıt, gıda üretimi için 8 kullanılmaktadırsu ve CO 2 ghly verimli dönüşüm güneş enerjisi 9 kullanarak biyokütle. Birçok tür potansiyel tarımsal üretim etkilemeden büyük ölçekli yetiştirilen olabileceğini siyanobacteria düşündüren, en az besin ve deniz suyu olmayan ekilebilir arazi üzerinde yetiştirilebilir. Bazı türler de mantar önleyici, anti-bakteriyel ve anti-kanser bileşikleri 10,11 gibi doğal ürünler, kaynaklarıdır. mutantlar oluşturmak için yeteneği endüstriyel amaçlı suşları geliştirilmesi için siyanobakteri fotosentez, biyokimya ve fizyoloji, anlamanın anahtarı ve esastır. yayınlanan çalışmaların çoğunluğu genetik ilgi siteye bir antibiyotik direnç kasetinin sokulmasıyla suşları modifiye oluşturun. Bu sadece birkaç antibiyotik direnç kaseti siyanobakteriler kullanım için uygun olarak bir hücreye dahil edilebilir mutasyon sayısını sınırlar. Antibiyotik yeniden kazandıran genler ihtiva eden suşlardirencin biyoyakıt ve diğer düşük değerli ürünler 12 üretmek için sadece maliyet-etkili bir araç olması muhtemeldir açık havuzlarda sanayi üretimi için kullanılamaz. işaretsiz mutantların nesil bu kısıtlamaların üstesinden. Işaretsiz mutantlar kasten dahil olmadıkça, hiçbir yabancı DNA&#39;yı içerir ve birden çok kez manipüle edilebilir. Nedenle arzu edilen bir suş olarak birçok değişiklik elde etmek mümkündür. Buna ek olarak, modifikasyon bölgesinden akım-aşağı genin kutup etkisi organizma 13 daha hassas modifikasyonu sağlayan en aza indirilebilir. Silinecek gene komşu siyanobakteri kromozomda bölgelere İki DNA parçası aynı içeren mutant suşları, intihar plasmidleri oluşturmak için ilk inşa edilir (5 &#39;ve 3&#39; yan bölge olarak da adlandırılır). Iki gen daha sonra bu yan bölgeler arasına yerleştirilir. Bunlardan biri, bir antibiyotik direnç proteini kodlar İkinci SacB, hangi eşya kodlarlevansükraz uces, bir bileşik sukroz duyarlılık kazandıran. Işlemin birinci aşamasında, işaretlenmiş mutantlar, bazı yabancı DNA&#39;yı ihtiva eden, yani suşlar oluşturulur. plazmid yapılarında siyanobakteriyel hücreleri ile karıştırılır, ve DNA organizmanın doğal olarak alınır. Transformantlar uygun antibiyotiği ve PCR ile teyit mutant genotip ihtiva eden agar plakaları üzerinde büyüme ile seçilir. İntihar plazmidler ilgi suşu içinde çoğaltma yapamaz. Bu nedenle, herhangi bir antibiyotik dirençli koloniler ilgi konusu genin kromozom içine yerleştirilir, böylece bir rekombinasyon olayı ile sonuçlanacaktır. İşaretlenmemiş mutantlan oluşturmak için, belirgin bir mutantı sadece 5 &#39;ve 3&#39; yan bölgelerini içeren ikinci bir intihar plasmidi ile karıştırılır. Yabancı DNA&#39;nın sokulması gereklidir, ancak, söz konusu DNA fragmanları arasındaki yerleştirilen ilgili genleri içeren bir kaset ile yandan kuşatma bölgeleri, 5 &#39;ve 3&#39; içeren bir plazmid, kullanılabilir. Selection sukroz içeren agar plakaları üzerinde büyüme yoluyladır. SacB gen ürünü ifade edildiğinde sükroz hücreleri için öldürücü olduğu için, hayatta sadece hücreleri sükroz duyarlılığı geni, antibiyotik direnç genine ek olarak, takım rekombine edilmiş ve böylece ikinci bir rekombinasyon olayı hangi olanlar vardır kromozom ve plazmid üzerine. rekombinasyonel değişiminin bir sonucu olarak, kuşatıcı bölge ve bunların arasında herhangi bir DNA kromozom içine yerleştirilir. Biz başarıyla Synechocystis sp aynı suşu birden kromozomal mutasyon üretmek için bu yöntemleri kullandık. (Bundan sonra Synechocystis olarak anılacaktır) PCC6803 13,14 çıkar 13 bir gen içine ve gen kasetleri ekspresyonu için tek nokta mutasyonların katılması için. İşaretlenmemiş tırnakları üretilmesi Synechocystis 15,16, detaylı yöntemde çalışmalarımızda önce gösterilmiştir birlikte, destekliKritik adımlar görsel sunum, kamuya açık değildir. Biz de başka bir model siyanobakterisine Synechococcus sp belirgin Knockouts üretimi için aynı yöntemi uyguladık. PCC7002 (bundan sonra Synechococcus olarak anılacaktır). Bu protokol mutantlar ve doğrulama ve bu suşları saklamak için hızlı bir protokol oluşturmak için bir açık, basit bir yöntem sağlar.

<table><tbody><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>sitrik asit</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO3)2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>Ferrik amonyum sitrat</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO<>sub3</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>siyanokobalamin</td><td>Sigma</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher</td><td>SUC001</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı 90 mm üç bacalı</td><td>Greiner</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0.2 & mikro; m filtreler</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>100 ml erlenler</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 mm x 38&nbsp; m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion yüksek kaliteli DNA polimeraz&nbsp;</td><td>Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>DNA saflaştırma kiti ve nbsp;</td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>Kısıtlama endonükleazları</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 ligaz</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani suyu</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin sülfat</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET plazmid mini hazırlık kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>14 ml yuvarlak tabanlı tüp</td><td>BD şahin</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polimeraz</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 & mikro; m cam boncuklar</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Floresan ampuller</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT multitron fotobiyoreaktör</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

model siyanobakteri türlerinde İşaretli ve belirtisiz mutants Üretimi

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Siyanobakteriler, ekolojik olarak önemli organizmalar ve biyoyakıt ve faydalı endüstriyel ürünlerin üretimi için potansiyel platformlardır. Siyanobakterilerin, özellikle Synechocystis sp. PCC6803 ve Synechococcus sp. PCC7002 gibi model organizmaların genetik manipülasyonu, hem temel hem de uygulamalı araştırmalar için önemli bir araçtır. Bir antibiyotik direnç kasetinin (bir veya daha fazla gen içeren manipüle edilebilir bir DNA fragmanı) yerleştirilmesi yoluyla kromozomal değişikliklerin bir suşa sokulduğu ve ardından bu kasetin negatif seçilebilir bir işaretleyici kullanılarak çıkarılması yoluyla işaretlenmemiş mutantların üretilmesi özellikle güçlü bir tekniktir. İşaretlenmemiş mutantlar tekrar tekrar genetik olarak manipüle edilebilir ve bu da bir suşa istenildiği kadar çok değişiklik yapılmasına izin verir. Ek olarak, mutasyona uğramış suşta antibiyotik direnç proteinlerini kodlayan genlerin yokluğu, antibiyotiğe dirençli organizmaların çevreye 'kaçış' olasılığını ortadan kaldırdığı için arzu edilir. Bununla birlikte, siyanobakterilerin tekrarlanan genetik manipülasyon turları için ayrıntılı yöntemler bilimsel literatürde iyi tanımlanmamıştır. Burada, ilgilenilen bir gen içinde çoklu delesyonlar, tek nokta mutasyonları ve yeni gen kasetlerinin yerleştirilmesi ile mutantlar oluşturmak için başarıyla kullandığımız bu tekniğin kapsamlı bir tanımını sunuyoruz.

Plazmid tasarımı hem de işaretlenmiş ve işaretlenmemiş mutantların başarılı üretimi için büyük önem taşımaktadır. Şekil 1 plazmid bir örnek verir ve oda Synechocystis genlerinin cpcC1 ve cpcC2 13 bir iptal mutantının üretimi için kullanılır. Her iki durumda da, 5 &#39;ve 3&#39; komşu bölgeleri yaklaşık 900-1,000 bp. başarılı trialed en küçük yaklaşık 500 bp&#39;lik bir olmasına rağmen azaltılmış kuşatıcı bölgeleri kullanılabilir. Pla...

Siyanobakterilere çoklu genomik değişikliklerin sokulması, endüstriyel ve temel araştırma amaçları için suşların geliştirilmesinde önemli bir araçtır. Model siyanobakteri türü Synechocystis sp. PCC6803'da işaretlenmemiş mutantlar ve Synechococcus sp. PCC7002'da işaretli mutantlar üretmek için bir sistem tarif ediyoruz.

Model siyanobakteri Türlerinde İşaretli ve belirtisiz Mutants Üretimi

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Bu prosedürün genel amacı, siyanobakteriyel Synechocystis türlerinde işaretlenmemiş mutantlar ve PCC6803 Synechococcus türlerinde işaretlenmemiş mutantlar üretmek için bir sistem göstermektir PCC7002. Bu yöntem, siyanobakteri genetiği alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Kromozomal değişikliklerin bir suşa nasıl dahil edileceği gibi.Bir antibiyotik direnç geninin eklenmesi ve ardından negatif seçilebilir bir işaretleyici kullanılarak bu kasetin daha sonra çıkarılmasıyla. Bu tekniğin temel avantajı, suşların tekrar tekrar genetik olarak manipüle edilebilmesidir. Bir suşa istenildiği kadar çok alternatifin sokulmasına izin vermek.Ortamı hazırladıktan sonra, siyanobakteri suşları ve plazmitler, metin protokolüne göre. Siyanobakteri hücreleriyle dolu bir halkayı 30 ila 50 mililitre BG11 ortamına aşılayarak taze bir kültür oluşturun. Kültürü ışıkta iki ila üç gün boyunca 30 santigrat derecede, 0,2 ila 0,6'ya eşit bir OD7500'e büyütün.İnkübasyonun ardından, kültürün bir ila iki mililitresini beş dakika boyunca 2.300 g'da santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı attıktan sonra, peletleri bir kez yıkamak için BG11 ortamını kullanın, hücreleri yeniden süspanse etmek için hafifçe pipetleyin. Girdap, DNA alımı için gerekli olan pililerin kaybına neden olabilir.Hücreleri tekrar peletledikten ve süpernatanı çıkardıktan sonra, 100 mikrolitrelik son hacme BG11 ortamı ekleyin ve hücreleri 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Daha sonra, hücrelere önceden hazırlanmış 1 mikrogram plazmit A ekleyin. Ve karıştırmak için hafifçe vurun.Daha sonra tüpleri inkübatörde 30 santigrat derecede yatay olarak yerleştirin ve dört ila altı saat inkübe edin. İnkübasyonu takiben, hücre kültürü plazmid DNA karışımının alikotlarını antibiyotik kullanmadan BG11 agar plakalarına yayın. Ve 30 santigrat derecede inkübe edin.Yaklaşık 24 saat sonra, kanamisin içeren suda% 0.6'lık bir agar çözeltisi hazırlayın. Ve 42 derece Santigrat'a kadar soğumaya bırakın. Daha sonra kültür plakalarının kenarlarına 2,5 ila üç mililitre ekleyin ve plakayı eğin, böylece çözelti yüzeyde eşit bir üst agar tabakası oluşturur.Kolonilerin görünür olması için plakaları yaklaşık yedi gün inkübe edin. Daha sonra taze bir BG11 agar artı kanamisin plakasını altı sektöre bölün. Ve tek tek kolonileri çizmek için keskin uçlu bir kürdan kullanın.PCR'yi gerçekleştirmek için, işaretli nakavtı doğrulamak için, az miktarda hücreyi 50 mikrolitre su ve yaklaşık 20 425 ila 600 mikrometre cam boncuk içeren bir tüpe aktarın. Hücreleri ve boncukları beş dakika boyunca yaklaşık 2.000 rpm'de çalkalayın, ardından beş dakika boyunca 15.700 g'da döndürün. Daha sonra, yapışkan DNA ön hazırlıkları ile 50 mikrolitre PCR reaksiyonları hazırlamak için beş mikrolitre süpernatan kullanın.Mutantları doğrulamak için, metin protokolüne göre primerler tasarladıktan sonra, aşağıdaki programı kullanarak ürünü büyütün ve vahşi tip bir kontrol ekleyin. Jelelektroforezler aracılığıyla, nakavt dönüştürücülerin genotipini doğrulayın. Yaklaşık dört kilobaz çiftinden oluşan bir bant gösteriyor ve vahşi tip banttan yoksun.Daha fazla ayrıntı için metin protokolüne bakın. Vahşi tip bir bant hala mevcutsa, suşu taze plaka üzerinde yeniden çizin ve PCR'yi tekrarlayın. Mutant ayrılana ve PCR reaksiyonunda vahşi tip bant gözlenene kadar doğrulama işlemini tekrarlayın.İşaretli mutant profili gösteren bir suş için, işaretsiz bir nakavt oluşturmada kullanmak üzere yeni bir plaka üzerinde yeniden çizgi çizin. İşaretlenmemiş Synechocystis mutantları oluşturmak için, hücrelerle dolu döngüyü 30 ila 50 mililitre BG11 ortamına aşılayarak işaretli nakavtın taze bir kültürünü oluşturun. Kültürü iki ila üç gün boyunca OD750'ye kadar büyütün, 0,2 ila 0,6'ya eşit.Kültürün 10 mililitresini 2.300 g'da beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Sonra hücreleri nazikçe yıkamak için BG11 ortamı. BG11'i 200 mikrolitrelik bir son hacme ekledikten ve hücreleri 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktardıktan sonra, hücrelere 1 mikrogram plazmit B DNA'sı ekleyin ve karıştırmak için hafifçe vurun.Daha sonra tüpleri inkübatöre yatay olarak yerleştirin ve dört ila altı saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 1.8 mililitre BG11 ortamı ekleyin ve numuneleri çalkalayarak toplam dört gün inkübe edin. Bu, çoklu kromozomal kopyalarda rekombinasyonun meydana gelmesine izin vermek için yeterli bir zamandır.Dönüştürülmüş kültürün 50, 10 ve 1 mikrolitrelik alikotlarını BG11 ve% 5 sükroz agar plakalarına yerleştirin ve tek koloniler oluşturmak için yaklaşık yedi gün inkübe edin. Daha sonra, künt uçlu bir kürdan kullanarak, BG11 artı kanamisin plakaları üzerinde 30 ila 50 ayrı koloniyi yumurtadan çıkarın. Ardından BG11 artı %5 sükroz üzerine yama yapın.BG11 artı sükroz üzerinde büyüyen, ancak kanamisin içeren plakalarda büyümeyen koloniler, potansiyel işaretsiz nakavtlardır. Her iki plakada büyüyen kolonilerin, sakB genindeki bir mutasyon nedeniyle sakaroza dirençli olması muhtemeldir. Bu videoda daha önce gösterilen PCR yöntemini takiben, vahşi tip boyutundan silinen bölgeye karşılık gelen bir jel bandı üretecek olan işaretlenmemiş nakavtları doğrulayın.Suş işaretlenmemiş bir mutant profili gösteriyorsa, antibiyotik olmadan taze BG11 agar üzerinde tekrar sürün. Suşları uzun süre saklamak için, hücrelerle dolu bir halkayı 30 ila 50 mililitre BG11 ortamına aşılayarak suşun taze bir kültürünü oluşturun. Kültürü üç ila dört gün boyunca büyütün ve OD750'yi 0,4 ila 0,7'ye eşit hale getirin.Hücreleri bir kez yıkamak için BG11'i kullandıktan sonra, peleti yaklaşık iki mililitre BG11 içinde yeniden süspanse edin. Bir tüpe 0.8 mililitre konsantre hücre ekleyin. Ardından 0,2 mililitre% 80 filtre ile sterilize edilmiş gliserol ekleyin.Başka bir tüpe 0.93 mililitre konsantre hücre ve 0.07 mililitre DMSO ekleyin. Her iki tüpü de eksi 80 santigrat derecede saklayın. Suşları canlandırmak için tüpü çıkarın ve bazı hücreleri antibiyotik kullanmadan bir agar plakasına kazımak için künt uçlu bir kürdan kullanın.Ardından normal şekilde çizmek için steril bir halka kullanın. Bu şekil, delesyon mutantları oluşturmak için kullanılan plazmit A ve B örneklerini göstermektedir. Her durumda, beş asal ve üç asal planking bölgesi yaklaşık 900 ila 1.000 baz çiftidir.Plazmid B, ayrıca beş asal ve üç asal arasında yaklaşık bir kilobaz çifti yan bölgeleri içeren bir gen kaseti içerebilir. Veya doğal gen dizisinin değiştirilmiş bir versiyonu. Plazmid A ile transformasyon üzerine, yedi ila 10 gün sonra bir plaka üzerinde birkaç yüz koloni görünecektir.Genler gerekli değilse ve mutantlar, vahşi tip suşa benzer şekilde büyüme gösteriyorsa, tüm kromozomlar, PCR ile belirlendiği gibi bir kopya npt1/sacB eklenmiş dizi içermelidir. Genler gerekli değilse ve mutantlar yavaş büyürse, ayrılmış işaretli bir mutant elde etmek için artan kanamisin konsantrasyonları ile birkaç tur yeniden çizgi gereklidir. Yeniden çizgilenme üzerine, belirgin bir mutant elde edilmezse, gen muhtemelen hayatta kalmak için gereklidir.Plazmid B ile transformasyondan elde edilen bireysel kolonilerin çoğu, kanamisine duyarlı ve sükroza dirençli olacaktır. Burada gösterildiği gibi, bu kolonilerde hedef bölgenin PCR amplifikasyonu, işaretlenmemiş mutant profilinin yaklaşık% 100'ünü göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa altı haftalık bir süre boyunca saatler içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, steril tekniği kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, fotosentetik oranların veya metabolit üretiminin ölçülmesi gibi ek soruları yanıtlamak için oksijen üretiminin ölçülmesi veya gaz kromatografisi kütle spektrometresi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, siyanobakteri genetiği alanındaki araştırmacıların önünü açtı.Bu filumdaki temel biyokimyasal ve fizyolojik süreçleri ve endüstriyel amaçlar için gelişimsel suşları keşfetmek. Bu videoyu izledikten sonra, Synechococcus türlerinde PCC6803 işaretsiz nakavtların nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.

generation-marked-markerless-mutants-model-cyanobacterial

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Weber, N., ve diğerleri, İpliksi Siyanobakteri Phormidium lacuna'nın Doğal Dönüşümü, Protein Ekspresyonu ve Kriyopkonservasyonu. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, homolog rekombinasyon yoluyla stabil GFP ekspresyonu ve antibiyotik direnci elde etmek için plazmit DNA kullanarak filamentli siyanobakterilerde doğal dönüşüm gerçekleştirmeye yönelik bir prosedürü açıklamaktadır.

İpliksi Siyanobakteri Phormidium lacuna'da Doğal Dönüşüm ve GFP İfadesi

Kaynak: Lea-Smith, D.J., ve diğerleri. Model Siyanobakteriyel Türlerde İşaretli ve İşaretsiz Mutantların Üretimi. J. Vis. Uzm. (2016)Video, siyanobakterilerde antibiyotik işaretli mutantlar üretmek için bir yöntem göstermektedir. Protokol, siyanobakterilerin kültürlenmesiyle başlar, ardından yüzey pililerini koruyan santrifüjleme ve yıkama adımları gelir. Daha sonra homolog dizilerle çevrili bir antibiyotik direnç geni taşıyan bir plazmit eklenir. İnkübasyon sırasında, plazmit pili yoluyla...

Homolog Rekombinasyon Yoluyla Siyanobakterilerde Antibiyotik İşaretli Mutantların Üretilmesi

Sıcaklığa duyarlı (ts) ölümcül mutantlar, temel işlevleri tanımlamak ve analiz etmek için değerli araçlardır. Burada, yüksek verimde ölümcül mutantları üretme ve sınıflandırma yöntemlerini açıklıyoruz.

Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Burada acemi protokollerde araştırmacılar için farmakolojik önemli bakteriyel cinsi Streptomycesfenotipleme başlatmak için mevcut.

Streptomyces gelişimsel mutantlar görsel ve mikroskobik değerlendirilmesi

Burada, i) CyanoGate modüler klonlama araç kiti kullanarak kendi kendini çoğaltan bir vektör monte etmek açıklayan bir protokol sokulması, ii) konjugasyon ile bir siyanobakteriyel konak içine vektör tanıtmak ve iii) transgenik siyanobakteri suşları karakterize bir plaka okuyucu veya akış sitometri.

CyanoGate Modüler Klonlama Araç Kiti Kullanılarak Konjugasyon ile Siyanobakterilerin Genetik Modifikasyonu

Bu protokol, Klamidya trachomatisgelişimsel mutantları tanımlamak ve izole etmek için yönlendirilmiş ileri genetik yaklaşımda floresan organizatör-muhabirler, canlı hücre mikroskobu ve bireysel dahil çıkarma kullanır.

Klamidya Trachomatis'te Gelişimsel Mutantları Tanımlamak ve Izole Etmek Için Canlı Hücre İleri Genetik Yaklaşım

Burada, Aeromonas'ın boş mutantlarının spesifik glikoziltransferazlarda veya glikoziltransferazlar içeren bölgelerde yapımını, motilitesi testlerini ve flagella saflaştırmasını, kodlanmış enzimlerinin bir glikanın biyosentezindeki katılımını ve işlevini ve bu glikanın bakteriyel patogenezdeki rolünü tanımlamaktayız.

Bakteriyel Glikoziltransferazların Bakteriyel Motilitedeki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretilmesi

Phormidium lacuna , deniz kaya havuzlarından izole edilmiş filamentli bir siyanobakteridir. Bu makalede filamentlerin doğal kaynaklardan izolasyonu, DNA ekstraksiyonu, genom dizilimi, doğal transformasyon, sfGFP ekspresyonu, kriyokonservasyon ve motiliteye yöntemleri anlatılmaktadır.

Filamentöz Cyanobacterium Phormidium lacuna'nın Doğal Transformasyonu, Protein İfadesi ve Kriyokorunumu

Bu protokol, fotoototrofik şeker salgılayan siyanobakteriler ve heterotrofik mayalar dahil olmak üzere ko-kültürlerin kurulumu ve kantitatif izlenmesi için kapsamlı bir kılavuz sağlar.

Heterotrofik Mayayı Fototrofik Şeker Salgılayan Siyanobakterilerle Birleştiren Ko-Kültürlerin Birleştirilmesi ve Miktar Tayini

Yüksek frekanslı elektrik stimülasyonu, nöbet benzeri aktivite kullanma...

, Epilepsi Mutants Nöbetler Neurocircuit Tahliller Drosophila</em

Keşfedin, Synechocystis sp. PCC6803 ve Synechococcus sp. PCC7002 türlerinde işaretli ve belirtisiz mutant üretme yöntemini. Bu teknik, antibiyotik direnç geni ekleme ve negatif seçilebilir belirteç kullanarak tekrarlanabilir genetik manipülasyon sağlar.

Model siyanobakteri Türlerinde İşaretli ve belirtisiz Mutants Üretimi

Daha fazla video keşfet