Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim

Bu protokolün genel amacı, Zebra Balıklarında Etanol ile İndüklenen Fibrotik Karaciğer Modeli oluşturmak ve bu modeli kullanarak kimyasal taramalar yapmaktır. Bu yöntem, karaciğer rejenerasyonu alanındaki önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Hepatositlerin fibrotik karaciğerde nasıl yenilendiğinin moleküler ve hücresel mekanizmaları gibi.

Bu tekniğin en büyük avantajı, vevo kimyasal taramada uygun maliyetli olması ve zaman kazandırmasıdır. Ayrıca, tek bir hücrenin görselleştirilmesi yoluyla ayrıntılı bir zaman seyri analizi yapılabilir. Prosedürü gösteren, bir doktora sonrası olan Mianbo Huang ve laboratuvardan bir yüksek lisans öğrencisi olan Jin Xu olacak.

Metin protokolüne göre reaktifleri hazırladıktan sonra, Tp1:mCherry ve Tg(hand2:EGFP)Zebra balığı ile yağ asidi bağlayıcı protein 10a:CFP-NTR içeren yetişkin transgenik Zebra Balığı kullanarak bölücülerle çiftleşme tankları kurun. Ertesi sabah, bölücüleri çıkardıktan iki saat sonra, sistem suyunu süzerek ve embriyoları embriyo ortamı içeren 100 milimetre petri kaplarına aktararak embriyoları hasat edin. Döllenmeden 56 saat sonra veya HPF, embriyolara yüzde 1.5 etanol ekleyin.

Etanolün buharlaşmasını önlemek için plakaları örtmek için plastik sargı kullanın. Daha sonra 24 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Taze 15 milimolar MTZ ve yüzde 0.1 DMSO ile embriyo ortamı hazırlayın ve yüzde 1.5'lik bir nihai konsantrasyona etanol ekleyin.

Daha sonra, 80 HPF'de, sıralanmış embriyoları petri kabı başına 20 mililitre etanol MTZ çözeltisi ile tedavi edin. Etanolün buharlaşmasını önlemek için plakaları örtmek için plastik sargı kullanın ve ışıktan korumak için folyo ile örtün. Daha sonra 24 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, hepatositlerin neredeyse tamamen ablasyonu ile larvaları ayırmak için bir CFP filtresi ve 80x büyütme kullanarak embriyoları bir epifloresan mikroskop altında gözlemleyin. Kimyasal ekranları gerçekleştirmek için, DMSO'da on milimolar kimyasal stok içeren 96 kuyulu plakayı negatif 80 derecelik dondurucudan çıkarın. Kimyasalların fotokatalitik bozunmasını önlemek için plakaları kaplamak için alüminyum folyo kullanın ve oda sıcaklığında hafif sallanma ile çözülür.

1.5 mililitrelik tüplerde, beş mikrolitre on milimolar stok çözeltisini bir mililitre embriyo ortamı ile 50 mikromolar nihai konsantrasyona seyrelterek kimyasal çözeltiler hazırlayın. Daha sonra, neredeyse tam hapatosit ablasyonu ile kuyucuk başına beş larvayı embriyo ortamı ile doldurulmuş 24 oyuklu plakaya aktarın. Daha sonra embriyo ortamını çıkarın ve her oyuğa 500 mikrolitre kimyasal çözelti ekleyin.

Alüminyum folyo ile plakaları örtün ve larvaları 28 santigrat derecede 50 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 80x büyütmede epifluoesent mikroskobu altında CFP eksprese eden hepatositlerin sayısını ve/veya yoğunluğunu gözlemleyin. CFP eksprese eden hapatositlerin artmış veya azalmış sayıları ve / veya yoğunluğu ile canlı larvaları görüntüleyin.

Yağ asidi bağlayıcı protein 10a: CFP-NTR içeren transgenik Zebra balığının TP1: mCherry ile çiftleşmesini sağlayın ve sıralanan larvaları altı ila 12 aylık hale getirin. Yetişkin transgenik Zebra Balığını çiftleşme tanklarına aktarmak için bir ağ kullanın. Sistem suyunda taze yüzde bir etanol hazırlayın, ardından eşleşen tanklardaki sistem suyunu değiştirmek için 500 mililitre çözelti kullanın.

Tankları 72 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin, balıkları taze etanol çözeltisine aktarın ve kuluçka sırasında günlük olarak ölü balıkları çıkarın. Yüzde 0.1 DMSO ile sistem suyunda taze on milimolar MTZ çözeltisi hazırlayın, ardından bir litrelik çiftleşme tanklarında balıklara 500 mililitre önceden ısıtılmış MTZ çözeltisi ekleyin. Tankları kaplamak için alüminyum folyo kullanın.

Sekiz saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin ve metin protokolüne göre analiz edin. Metin protokolüne göre anestezi uyguladıktan sonra, cildi kesmek için makas kullanarak gastrointestinal organları açığa çıkarın ve anal yüzgecten operkuluma kadar göbek boyunca kasın altını çizin. Sonra balığın kenarı boyunca anal yüzgecine kadar arkaya doğru kesin.

Balıkları on beş mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve bir kez yıkamak için PBS kullanın. Daha sonra PBS'yi çıkarın ve PEM tamponuna dört mililitre taze hazırlanmış yüzde üç formaldehit ekleyin. Balıkları sabitlemek için gece boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Ertesi gün, numuneleri metin protokolüne göre yıkadıktan sonra, tüm bağırsağı karaciğer ile vücut boşluğundan çıkarmak için yemek borusunu kesin. Daha sonra gastrointestinal organları bir kesit kalıbına yerleştirin ve dokuyu gömmek için yüzde dört düşük erime agarozu kullanın. Ardından, bloğu yamuk şeklinde kesin ve tabana yapıştırın.

Daha sonra bir vibratom kullanın ve dokunun iç ucundan başlayarak, numuneleri elli mikrometre aralıklarla buz gibi soğuk PBS'ye enine kesitler halinde kesin. Bölümleri PBS ile altı kuyulu bir plakaya aktarmak için bir numaralı boya fırçası kullanın. Bölümleri metin protokolüne göre immün boyamadan sonra, bölümleri nazikçe cam slaytlara aktarmak için bir numaralı boya fırçası kullanın.

Bir damla montaj ortamı ve bir kapak kayması, eklemeden önce fazla PBS'yi çıkarmak için kimwipes kullanın. Ardından kapak camını kapatmak için oje kullanın. Son olarak, 40x 1.3 NA yağ lensi ile donatılmış bir konfokal sistem kullanarak, Z-Stack görüntülerini yüzde 20 ila 50 güçte ve bir mikroampermetre aralıklarla yakalayın.

Bu şekil, etanol MTZ ile muamele edilen larvaların gövde ve kuyrukta yukarı doğru eğrilik, parikardiyaödem ve yüzme kesesini şişirmede başarısızlık geliştirdiğini göstermektedir. Burada görüldüğü gibi, DMSO ile tedavi edilen kontrol karaciğerleri fibula tip bir kollajen birikimi göstermedi. Etanol MTZ ile tedavi edilen karaciğerler, ablasyondan 25 ve 50 saat sonra yüksek tip bir kollajen birikimi gösterdi.

Ek olarak, DMSO ile tedavi edilen kontrollü karaciğerlerle karşılaştırıldığında, HSC'lerin sayısı artmış ve etanol MTZ ile tedavi edilen rejenere karaciğerlerde sitoplazmik süreçlerden yoksun miyofibrilblast benzeri bir şekil benimsemiştir. Bu şekil, yüzde bir etanol ve ardından MTZ ile tedavi edilen yetişkin Zebra balıklarında etanolün neden olduğu fibrotik karaciğer modelinin gelişimini göstermektedir. Bu zaman seyri analizlerinden, DSMO ile tedavi edilen karaciğerlere kıyasla, etanol MTZ ile muamele edilen rejenere karaciğerlerde, ablasyondan iki, üç ve dört gün sonra önemli ölçüde artmış tip bir kollajen birikimi gözlenmiştir.

Bu kimyasal tarama deneyinde, hepatositler yüzde 1.5 etanol ve 15 milimolar MTZ varlığında ablasyon edildi. Larvalar daha sonra 50 saat boyunca kimyasallara maruz bırakıldı. Glikojen sentaz kinaz-3 inhibitörleri ve bir wint aktivatörü gibi bir dizi wint agonisti, DMSO'ya kıyasla hepatosit rejenerasyonunu destekledi.

Bu veriler, bu sürekli fibrotik modelin, hepatosit rejenerasyonunu artıran küçük molekülleri keşfetmek için paha biçilmez bir araç sağladığını göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir hafta içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, hepatositlerin neredeyse tamamen ablasyonunu sağlamayı ve prosedür boyunca etanol konsantrasyonunu korumayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, tanımlanan kimyasal bileşiklerin etkinliği memeli karaciğer hasarı modellerinde test edilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, kronik karaciğer yetmezliği hastaları için yeni terapötik stratejilerin potansiyel keşfini keşfetmek için hücresel rejenerasyon tedavisi alanında yeni yollar açabilir. Bu videoyu izledikten sonra, Zebra balığında etanol kaynaklı fibrotik karaciğer modelinin nasıl geliştirileceğini ve kimyasal taramaların nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Formaldehitle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven giymek ve reaktifi kimyasal davlumbazda kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.