Name: Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualizea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Öğrenin, hücre dışı matrisin yapısını taramalı elektron mikroskobu ile görselleştirme yöntemini. Bu teknik, kardiyak fibroz ve kardiyomiyopatilerde matris organizasyonunu incelemek için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NIHLB) tarafından sağlanan hibelerle finanse edilmiştir: K01-HL-121045, K08-HL-094703, 5T32HL007411-35, P20 HL101425, U01 HL100398. 
Görüntüleme ve doku işleme (NaOH maserasyonundan sonra) Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi (VUMC) Hücre Görüntüleme Ortak Kaynağı (CISR) (NIH hibeleri CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 ve EY08126) kullanılarak gerçekleştirildi. VUMC CISR çekirdek direktörlerine (Dr. Sam Wells ve Dr. W. Gray (Jay) Jerome) değerli teknik tavsiyeler için ve ayrıca bu yazıda vurgulanan tekniğin filme alınması amacıyla temel alan ve kaynaklar sağladıkları için özellikle minnettarız. 
Vanderbilt Üniversitesi Translasyonel ve Klinik Araştırma Kardiyoloji Çekirdek Laboratuvarı'ndan Dr. Yan Ru Su ve Bayan Kelsey Tomasek'e teknik uzmanlık sağladıkları ve bu çalışmada kullanılan insan dokusu örneklerini topladıkları için en derin takdirlerimizi sunarız.

Etik Beyanı: Hayvan taşıma için protokoller Vanderbilt Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC tarafından onaylanmış, AAALAC-Uluslararası standartlara göre sayı M / 10/117 (domuz) ve M / 10/219 (fareler) ve yapılan protokoller. banked insan kalp dokularının kullanımı Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi IRB (protokol numarası 100887) tarafından onaylandı. 1. Örnek Toplama ve Depolama <ol><li> 0.1 M fosfat tamponu (PB) çözelti içinde, taze% 4 glutaraldehit sağlayın. DİKKAT: Glutaraldehyde, toksik davlumbaz eldiven ve iş giyim. <ol><li> 1000 ml dH 2 O. 21.8 g 2 Na HPO 4 ve 6.4 g NaH 2 PO 4. Kuantum satis (Qs) ile PB, pH 7.4 0.2 M stok solüsyonu yapmak </li><li> PB stok çözeltisi 2.5 ml 2.1 mL dH 2 O% 50 glutaraldehid 400 ul ekle </li></ol></li><li> bir yığın daldırın (hayır daha büyük 2 c% 4 glutaraldehid çözeltisi içine doku m2). Not: Daha küçük parçaları da kullanılabilir ama kolayca protokol daha adımları kolaylaştırmak amacıyla göz tarafından görüntülenmiştir için yeterli bir boyutta (Resim 5 mm&#39;den 2) arasında olmalıdır. </li><li> 4 ° C sıcaklıkta süresiz depolamak, daha sonra 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol> Kalp Doku 2. Decellularization <ol><li> 10 g NaOH peletleri / 100 ml DH 2 O kullanılarak taze,% 10 sulu NaOH çözeltisi yapmak DİKKAT: NaOH çözeltileri aşındırıcı ve alkali yanıklara neden olabilir, eldiven giymek. </li><li> DH 2 O. doku durulayın </li><li> 6, oda sıcaklığında% 10 NaOH çözeltisi içinde inkübe - 10 gün boyunca (kadar kırmızımsı-kahverengi bir doku değişiklikleri, kirli beyaz veya beyaz). </li><li> Doku şeffaf hale gelinceye kadar dH 2 O durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 4 saat% 1 tanik asit içinde doku bırakın. 4 ml dH 2 O başına 1 ml% 5&#39;lik stok solüsyonu kullanın DİKKAT: Tannik asitGüçlü tahriş edicidir, eldiven giymek. </li><li> Gecede DH 2 O durulayın. </li></ol> 3. Osmication ve (Güvenlik Çeker Hood) Kalp Dokusu Dehidrasyon <ol><li> 21.4 g sodyum kakodilat, 10.0 g kalsiyum klorür ve 450 mi dH 2 O kullanılarak, sodyum kakodilat tamponu, 0.2 M stok çözelti yapmak 7.4 pH ayarlamak için gerektiği kadar karıştırın, daha sonra hidroklorik asit ilave edin. Qs 500 ml dH 2 O ile DİKKAT: Sodyum kakodilat ve hidroklorik asit, toksik davlumbaz eldiven ve iş giyim. </li><li> 50 ml dH 2 O 1 g osmiyum tetroksit kristal eriterek güvenliği için davlumbaz osmiyum tetroksit% 2&#39;lik sulu stok solüsyonu yapmak DİKKAT: osmiyum tetroksit ciddi inhalasyon tehlikesi; mukozasına veya gözbebekleri buhar tespit mümkündür, dolayısıyla sadece eldiven ile davlumbaz anlaştım. Bir sıçrama koruma tavsiye edilir. </li><li> dH ile 1: stok çözelti 1 mix (0.1 M sodyum kakodilat tampon doku durulayın <sub&gt; 2 O) 5 rotator dakika (ya da yavaşça sallanarak için). </li><li> Üç tampon durulama toplam iki kez önceki adımı yineleyin. </li><li> döndürücü üzerinde 1 saat süreyle: 0.1 M sodyum kakodilat tampon (1 stok sodyum kakodilat ve stok osmiyum tetroksit 1 mix)% 1 osmiyum tetroksit doku daldırın. </li><li> 5 dakika rotator her 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda 3 kez doku durulayın. </li><li> döndürücü üzerinde her biri 15 dakika için etanol artan konsantrasyonlarda (% 30,% 50,% 75,% 85,% 95, ve son olarak% 100) kullanılarak doku durulayın. </li></ol> SEM 4. Kesit Yüzey Hazırlama <ol><li> Ayrıca,% 100 etanol ihtiva eden sığ bir Petri kabı,% 100 etanol içinde doku aktarın. </li><li> kenarlarının yassı numune üzerinde bir eşkenar üçgenin iki tarafı meydana getirmek için birbirleriyle ve kesme kenarları haç biçimli parçası ile temas halinde olacak şekilde, iki keskin Jilet tutun. Bunu başarmak için, numunenin sağında bir bıçak yerleştirmek için sol elinizi kullanın vekesim sola. Aynı zamanda, çok örnek ve dilim sağa sol ikinci bıçak yerleştirmek için sağ elinizi kullanın. Böylece, bıçaklar tek pürüzsüz kesim yapmak için ters yönden birbirlerine karşı kaydırılabilir olacaktır. </li><li> numune zarar vermeden tercihen mümkün olduğunca büyük bir yüzey alanı açığa minimum distorsiyon veya güç yırtılma ile numunenin çok temiz bir kesim yapmak için birbirlerine karşı düz bıçak tarafı kaydırın. </li><li> SEM muayene için mümkün olan en temiz kesit yüzeyleri açığa her numune için tekrarlayın. </li></ol> 5. Kritik Nokta Kurutma (CPD) Kalp Doku <ol><li> Doku her zaman% 100 etanol içinde kalmasını sağlayarak, kritik nokta kurutucu (CPD) örnek sahibinin doku transferi için bir spatula ya da cımbız kullanın. tutucu etanol içinde ve transfer birkaç saniye fazla havayla temas doku ile elde edilir batırma olduğundan emin olun. </li><li> Bizim başına CPD İşletER el kitabı, sıvı karbon dioksit ile etanol yerine bir şekilde doldurmayı tasfiye-ve-3 tamamlayın. </li><li> Numunelerin kritik nokta kurutma ulaşmak ve CO 2 kontrollü havalandırma ile atmosfer basıncına onları dönmek için kullanım kılavuzuna başına CPD çalıştırın. </li></ol> SEM Kalp Doku Örneklerinin 6. montajı <ol><li> alüminyum saplama üst yüzeyine bir karbon yapıştırıcı sekmesini kalarak, her numune için bir SEM örnek saplama hazırlayın. </li><li> Bir stereomikroskopta yardımı ile dikkatlice (uzak görünen sekmesinden gelen) yukarı bakacak şekilde ilgi kesit yüzeyi ile yapışkan sekmesine numune uygun ve mümkün olduğunca yakın örnek saplama yüzeyinin düzlemi ile paralel. prob veya ilgi yüzeyine dokunmayın. </li><li> Boya uygulaması için ideal bir konik fırça, elde etmek için bir tahta aplikatör çubuk kırın. saplama bağlılığı geliştiren, taban ve numunenin kenarlarında gümüş ya da karbon boya uygulayın. </li><li> Yere ilgi yüzeyinden bir ücret yolu sağlamak için, ilgilenilen yüzeyin bir kenarına kadar boya gümüş ya da karbon çok ince bir çizgi uzatın. </li><li> şasiye böylece metal saplama karbon sekme yüzeyinden iletken bir yol temin etmek üzere karbon sekmesinin çevresinde gümüş veya C-boya, 2 veya 3 küçük dabs uygulayınız. </li><li> iletken boya iki saat kurumaya bırakın. </li><li> altın-paladyum alaşımı veya altın - bir nispeten ağır kaplama (40 nm 30 hedef aralığı) uygulamak için kullanım kılavuzuna başına püskürtme kaplayıcı çalıştırın. yaklaşık olarak 0.1 mbar numune odacığı içinde, pompa; 40 sn Timer ayarlayın. 08:00 pozisyonu (orta Argon gazı akışı) Açık Set valfi. Başlat tuşuna basın 30 mA püskürtme kaplama başlatmak için. Mor kızdırma deşarj numune odasında görünür olmalıdır. </li></ol> Kalp Doku Örneklerinin 7. SEM Sınav <ol><li> Görüntüleme P en aza indirmek için, nispeten düşük bir ivmelendirici gerilim taramalı elektron mikroskopuyla gerçekleştirmenumunedeki zayıf şarj yayılımı ile ilişkili GİDERME (şarj). Önerilen ilk görüntüleme koşulu vardır: 5 kV 10 mm çalışma mesafesi, gerilim hızlandırılması. </li><li> Deneyimli bir operatör yardımı ile, istihdam z boyutta önemli bir uzunluğu boyunca uzanan birden fazla odak düzlemlerinde liflerin veya lif odak gerektiren görüntüleme koşulları bu alanda derinliğinin genişletmek için çalışma mesafesi artmıştır. <ol><li> Burada kullanılan mikroskop için kullanıcı arabirimi erişimi, sağ üst taraftaki Gezinti sekmesini (Malzeme Tablo). </li><li> Sahne menüsünden Koordinatlar sekmesine erişin. Daha sonra girilen çalışma mesafesi örnek sahne taşımak için sekmesinden Git tıklayın koordinat Z için milimetre daha büyük bir değer girin, çalışma mesafesini arttırmak için. </li></ol></li><li> deneyimli bir operatörün yardımı ile, elektron ışını faiz dik yüzeyini yerleştirmek için örnek tilt ve döndürme kullanır. 10 degr 30 Ek eğimees bu pozisyondan matris yapısının gözlem ve dokümantasyon artırabilir. <ol><li> Odaklı çalışma mesafesi belirterek, burada kullanılan mikroskop için, (Malzeme Tabloya bakınız) kullanıcı arayüzünde, ilgi hazırlanan yüzey düzlemine çevresine yakın örneği odaklanmak, sonra sola veya sağa kaydırın tıklayın ve sağ fare düğmesini basılı tutun . </li><li> Yüzey ve tekrar odak karşıt kenarına yakın taşımak için Manuel Kullanıcı Arabirimi joystick ile gidin. çalışma mesafesi birinci konuma yaklaşık olarak eşit değilse, eğim numune (7.2) ve T bir eğim değeri koordinat girmek Sahne menüsünden koordinatları sekmesini kullanarak iki yerde yaklaşık anlaşmaya ulaşmak için. </li><li> Numune doksan derece döndürün (alan Koordinat R içine değeri girin) ve tüm pozisyonları yaklaşık olarak aynı çalışma mesafesinde odaklı kadar işlemi tekrarlayın. Not: Değişken basınç SEM yük dağılımı geliştirmek için kullanılabilirmümkün ise. Yüksek vakum taramalı elektron mikroskobu için standart çalışma modudur. </li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Kesit yüzey hazırlama protokolü sırasında en kritik adımdır. kritik nokta Kurutma işlemi tanıtıldı kadar ince yapısını korumak için, susuz örnekleri her zaman% 100 etanol içinde kalmalıdır. Bu nedenle örneklerin dilimleme örnekleri sığ bir çanak etanol submersed ise EM muayene için yüzeyler yapılmalıdır elde etmek. Açıkta kalan yüzeyi, temas ya da daha sonraki işlem esnasında problanmış değildir de önemlidir. protokol SEM bölümü ne olursa olsun örnek kökenli temel elektron mikroskobu sorun giderme gerektirebilir, ancak ...

Fibrozis, kardiyomiyositlerin 1,2 normal mekanik fonksiyonlarının yanı sıra hücreler arası iletişim, hücre içi sinyalleşme ve hücre sağkalımı 3 için kritik olan normal miyokardiyal kollajen ağını bozar. Fibrozis gelişimi kardiyak fonksiyonun önemli bir belirleyicisidir ve çeşitli etiyolojilerden kaynaklanan kardiyak interstisyumun fibrotik yeniden şekillenmesi artmış sol ventrikül sertliğine ve diyastolik disfonksiyona yol açar 4. Miyokardiyal fibroz da aritmilere yol açabilir ve fibrotik yeniden şekillenmenin ilerlemesi genel veya lokal bir fenomen olsun, iskemik ve iskemik olmayan kardiyomiyopatili hastalarda kötü prognoz ile yüksek oranda ilişkilidir 5. Benzer şekilde, miyokardiyal fibrozisin olmaması, ventriküler fonksiyonel iyileşmenin ve uzun süreli sağkalımın güçlü bir göstergesidir 6. 
Fibrozun ayırt edici özelliği, çelik 7'nin gerilme mukavemetine sahip olan ve kardiyomiyosit fonksiyonunu birden fazla düzeyde olumsuz yönde etkileyebilen fazla kollajen birikimidir. Aşırı kollajen bir matristen kaynaklanan mekanik kuvvetler, kardiyomiyosit atrofisine 8,9, pasif doku sertliğine 10, tonik kasılmaya bağlı miyokard sertliğine 11-13 ve kalan kardiyomiyosit popülasyonuna oksijen verilmesinin azalmasına neden olabilir. Kardiyomiyositlerin ve myoFb'lerin boşluk bağlantı eşleşmesi de kalbin elektriksel özelliklerini tehlikeye atabilir ve aritmi gelişimi için daha büyük bir risk oluşturur 14-16. Perivasküler fibrozis, intramural koroner arterlerin ve arteriyollerin 17 vazomotor reaktivitesini değiştirir ve oksijen kaynağını azaltan luminal daralmaya ve dolayısıyla kardiyomiyositlerin 17-22 hayatta kalmasına katkıda bulunur. İlk iskemik yaralanma veya enerji dengesizliği bölgesinden kaynaklanan patojenik fibrotik ve elektriksel yeniden şekillenme, kaçınılmaz olarak kalp yetmezliğine ilerler. 
Kardiyomiyosit nekrozu fibrotik yanıtı başlatır ve etiyolojiden bağımsız olarak müteakip advers fibrotik yeniden şekillenme meydana gelebilir. Kardiyak fibrozu kontrol etmenin bir yolunu bulmak, iskemik ve idiyopatik kardiyomiyopatiler, hipertansif kalp hastalığı, hipertrofik kardiyomiyopati, kalp kapak hastalığı ve distrofinopatilerin tedavisi için klinik olarak faydalı olacaktır 23-42. Fibrotik hastalık sürecinin nasıl başladığına bakılmaksızın, çözünür, profibrotik faktörler interstisyel boşluğu geçebilir ve ilk fibrotik skardan uzak bölgelerde interstisyel ve adventisyel fibroblastların aktivasyonunu tetikleyebilir ve sonuçta kalp yetmezliğine yol açan kademeli bir etki yaratabilir. En uygun senaryo, sistolik pompa yetmezliği, diyastolik kalp yetmezliği veya diğer son dönem sonuçlarına ilerlemeden önce kardiyomiyopatinin telafi edici hipertrofik aşaması sırasında uygulanabilecek hedefli bir terapötik kullanarak fibrilojenik süreçten yararlanmak olacaktır. Nihai hedef, fibrozu tersine çevirmek olacaktır, böylece ölü kardiyomiyositler değiştirilebilir ve kalp fonksiyonu tamamen geri yüklenebilir. 
Matrisin önemi yaygın olarak anlaşılmıştır, ancak matrisi inceleme yöntemleri esas olarak ana yapısal bileşenlerin, özellikle kollajenin kantitatif ölçümleri ve farklı matris ve ana-hücresel proteinlerin nispi seviyeleriyle sınırlıdır. Bu protokol, kardiyak matriksteki kalitatif farklılıkları değerlendirmek için yararlı olan nadiren kullanılan bir tekniği vurgulamaktadır. Bu teknik, son zamanlarda, kalp hastalığının farklı etiyolojilerinden (insan eksplantlarında) kalp matrislerindeki temel farklılıkları karşılaştırmak ve karşılaştırmak, tedavi edilmemiş hayvanlara göre neuregulin-1β'nin glial büyüme faktörü (GGF) izoformu ile tedavi edilen enfarktüslü domuzlardan alınan kalpleri incelemek ve mdx'ten kalp dokularının matrislerindeki farklılıkları araştırmak için kullanılmıştır fareler (Duchenne Musküler Distrofi'nin yaygın olarak kullanılan bir hayvan modeli) farklı yaşlarda ve vahşi tip kontrollerle karşılaştırıldığında. Bu teknik ilk olarak 1979'da Dr. Caulfield ve Borg tarafından tanıtıldı 44, ancak o zamandan beri çok az çalışma bu güçlü tekniği 45-47 kullandı ve burada sadece küçük bir değişiklikle yeniden tanıtıldı. Bu metodoloji değerli bir araştırma aracıdır, çünkü aksi takdirde matris bileşen içeriğini ve / veya fibroz seviyesini ölçerken göz ardı edilebilecek hücre dışı matris üst yapısı hakkında nitel bilgiler sağlar.

<table><tbody><tr><td>Kalsiyum Klorür Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>12340</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Karbon Yapıştırıcı Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>12664</td><td>30 g</td></tr><tr><td>Karbon Yapıştırıcı Sekmeler Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>77825</td><td>Saplamalara Sığdırma Sırası</td></tr><tr><td>Çift Kenarlı Tıraş Bıçakları Paslanmaz Çelik</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td>250/pkg</td></tr><tr><td>Etanol Elektron</td><td> Mikroskopi Bilimleri</td><td>15055</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>Gluteraldehit,% 50 Çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>16310</td><td>EM sınıfı, damıtma saflaştırılmış</td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>16760 veya 16770</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Monosodyum Fosfat NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251-250G</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Osmiyum Tetroksit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>19100</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Gümüş İletken Yapıştırıcı Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>12686-15</td><td>15 g</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Dibazik (Na<alt>2</alt>HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Tanik Asit, %5 Sulu&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>21702-5</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Trihidrat Sodyum Kakodilat</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>12300</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Altın-paladyum Alaşımı veya Altın</td><td>Rafineri Sistemleri A.Ş.</td><td>püskürtmeli kaplayıcı markasına ve modeline göre</td> <td>değişir</td></tr><tr><td>Kritik Nokta Kurutucu Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>850</td><td></td></tr><tr><td>Düz Ahşap Aplikatörler</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-102</td><td></td></tr><tr><td>Quanta 250 Çevresel SEM</td><td>FEI</td><td>Q250 SEM</td><td></td></tr><tr><td>Püskürtme</td><td>Kaplayıcı Cressington Scientific Instruments Ltd.</td><td>Model 108</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum SEM Numune Saplamaları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>75220-12</td><td>miskroskopa özel</td></tr></tbody></table>

macerated tissue taramalı elektron mikroskobu ekstraselüler matrix visualize&#39;a

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrozis, etiyolojiden bağımsız olarak tüm kalp hastalığı formlarının bir bileşenidir ve kardiyak matriks biyolojisi alanında çok ilerleme kaydedilmiş olsa da, matriksin nasıl oluştuğu, fizyolojik ve patolojik yeniden şekillenmenin nasıl farklılaştığı ve en önemlisi matriks dinamiklerinin iyileşmeyi teşvik etmek ve fibrozu inhibe etmek için nasıl manipüle edilebileceği ile ilgili hala büyük boşluklar vardır. Şu anda kardiyak fibrozu kontrol etmek, önlemek veya tersine çevirmek için herhangi bir tedavi seçeneği yoktur. Sebebin bir kısmı, muhtemelen miyokard enfarktüsünden sonra ölü veya ölmekte olan kardiyomiyositlerin hemen yerini almak için meydana gelen kardiyak skar oluşumunun karmaşıklığıdır. Hücre dışı matriksin kendisi, yerleşik hücreleri aktive ederek ve ayrıca sızan hücreleri geçersiz lezyona yönlendirmeye yardımcı olarak yeniden şekillenmeye katılır. Matris aynı zamanda normal matris döngüsü için çok önemli olan ana-hücresel proteinlerin yanı sıra fibrotik sinyalleme için bir tür saklama dolabıdır. Matrisin ayrıca kalp dokusunda elektromekanik bir rol oynadığı gösterilmiştir. Fibrozu değerlendirmek için kullanılan tekniklerin çoğu doğada kalitatif değildir, ancak iki grubu karşılaştırmak için yararlı olan ancak altta yatan matris yapısı ile ilgili bilgi sağlamayan kantitatif sonuçlar sağlar. Burada vurgulanan, kardiyak matris üst yapısını görselleştirmek için bir tekniktir. Decellularize kalp dokusunun taramalı elektron mikroskobu, geleneksel kantitatif araştırma yöntemleri kullanılarak gözden kaçırılabilecek yapıdaki çarpıcı farklılıkları ortaya koymaktadır.

Vurgulanan teknik kullanılmayan bir insan kalp nakli donör (Şekil 1), transplant alıcılarında, yabani tip ve distrofik farelerin (Şekil 3) den kalplerin eksplante dokulardan kalp dokularına ve domuz post-miyokard infarktüsü, kalp örneklerinde uygulandı kalp yaralanma modeli (Şekil 2). Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, insan kalp matris kesitte görüntülendiğinde bir petek benzeri bir desen görüntülenir çapraz bağlı prote...

Burada, hücreden arındırılmış kalp dokularında hücre dışı matriks üst yapısını görselleştirmek için bir yöntem gösterilmiştir.

Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize&#39;a

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Bu yöntemin genel amacı, hücrelerin veya diğer matris dışı materyallerin yokluğunda kardiyak matrisin yapısını görselleştirmektir. Bu yöntem, özellikle matris içeriğindeki farklılıkların matris organizasyonunu nasıl etkileyebileceği ve bu değişikliklerin farklı kardiyomiyopatileri veya diğer fibrotik hastalıkları nasıl etkileyebileceği gibi, fibrozis alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, kantitatif ölçümleri desteklemek için kullanılabilecek kalitatif bir matris görünümü sağlamasıdır.Dr. Galindo ve Dr. Sawyer, enfarkt sonrası düzenli tedavi uygulanan domuzlarda, gen ekspresyonundaki değişikliklerin tedavi sonrası matris içeriğindeki değişikliklerle benzer olduğunu fark ettikten sonra bu tekniği kullanma fikrini geliştirdiler. Gereken ince motor beceriler nedeniyle, daha önce SEM numune hazırlama deneyimi olmayan kişiler bu yöntemde zorluk yaşayabilirler. Doku örneği kolayca görülebilecek büyüklükte olmalı ve dört derece Celsius'ta yüzde dört glutaraldehit çözeltisi içinde saklanmalıdır.Dokuyu soğuk depolamadan çıkarın ve distile su ile durulayın. Ardından dokuyu, peletlerin suda taze olarak çözünmesiyle hazırlanmış yüzde 10'luk sodyum hidroksit çözeltisine daldırın. Gerekli önlemleri aldığınızdan emin olun.Dokuyu oda sıcaklığında altı ila 10 gün boyunca sodyum hidroksit çözeltisinde bekletin. Dokunun rengi kirli beyaz veya beyaz olduğunda işleme devam edin. Ardından, doku şeffaflaşana kadar distile su ile durulayın.Ardından, eldivenlerinizi giyin ve dokuyu oda sıcaklığında dört saat boyunca yüzde bir tannik asit içerisinde bekletin. Tannik asit banyosunun ardından, dokuyu gece boyunca distile su ile yıkayın. Hazırlık aşamasında, çeker ocak altında eldiven kullanarak 0,2 molar sodyum kakodilat tampon stok çözeltisi ve yüzde iki'lik sulu osmiyum tetroksit stok çözeltisi hazırlayın.Osmiyum tetroksit ciddi bir soluma tehlikesi oluşturduğundan, bir sıçrama koruyucusu kullanın. Şimdi, sodyum kakodilat tamponunun 0,1 molar bir seyreltisini hazırlayın ve dokuyu beş dakika boyunca hafifçe çalkalayarak bu çözeltide inkübe edin. Dokuyu toplamda üç kez sodyum kakodilat ile yıkamak için tamponu iki kez değiştirin.Ardından, stok sodyum kakodilat ve stok osmiyum tetroksitten bire bir oranında bir karışım hazırlayın. Dokuyu, yeni karışım içerisinde bir rotator üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, dokuyu 0.1 molar sodyum kakodilata geri döndürün ve hafif ajitasyon eşliğinde beş dakika inkübe edin.Bu banyo çözeltisini 15 dakika boyunca iki kez değiştirin. Ardından, artan konsantrasyonlardaki bir dizi etanol banyosu kullanarak dokuyu dehidre edin. Dokunun her banyoda, hafif ajitasyonla 15 dakika boyunca bekletilmesine izin verin.Ardından, dokuyu ve çözeltiyi %100 etanol ile doldurulmuş sığ bir Petri kabına aktarın. Daha sonra, dikkatlice, iki çok keskin jilet bıçağını, yan düz yüzeyleri birbirine temas edecek ve kesici kenarları numunenin üzerinde bir eşkenar üçgenin iki kenarını oluşturacak şekilde tutun. Şimdi, baskın elinizi kullanarak ikinci bıçağı numunenin en soluna yerleştirin ve sağa doğru kesin.Bu nedenle, minimum distorsiyon veya yırtılma kuvvetiyle tek bir pürüzsüz kesim yapmak için bıçakları zıt yönlerden birbirine doğru kaydırın. Amaç, örneğe zarar vermeden mümkün olan en geniş yüzey alanını açığaktır. İşlemi, SEM ile inceleme için yeterli sayıda tatmin edici enine kesit hazırlanana kadar tekrarlayın.Dokuyu %100 etanol içinde tutarak, bir spatula veya cımbız yardımıyla CPD'nin örnek tutucusuna aktarın. Dokunun havaya maruz kalma süresi birkaç saniyeyi geçmemelidir. Etanolü sıvı karbondioksit ile değiştirmek için CPD'yi kullanın ve üretici tarafından belirtilen kurutma döngüsünü gerçekleştirin.Ardından, her bir numune için bir SEM numune taşıyıcısı (stub) hazırlayın. Alüminyum taşıyıcının üst yüzeyine bir karbon yapışkan sekme yapıştırın. Bir stereomikroskop altında, ilgili kesit yüzeyi yukarıya, sekmeden uzağa bakacak ve taşıyıcı yüzeyi ile maksimum düzeyde düzlemsel olacak şekilde numuneyi yapışkan sekme üzerine dikkatlice yapıştırın.İlgilenilen yüzeyi sondalamayın veya dokunmayın. En küçük ve en zor numuneler için, ahşap aplikatör çubuğunu spatula olarak kullanmak üzere kırın. Ayrıca, düşen bir numuneyi kaybetmemek için geniş bir filtre kağıdı üzerinde çalışın.Daha iyi yapışma sağlamak için, konik bir fırça oluşturmak üzere kırılmış bir aplikatör çubuğu kullanın ve numunenin tabanına ve yanlarına gümüş veya karbon boya uygulayın. Boyayı, ilgilenilen yüzeyin kenarına kadar çok ince bir hat şeklinde uzatın. Bu işlem, ilgilenilen yüzeyden toprağa bir yük yolu oluşturacaktır.Ardından, karbon tabın yüzeyinden metal stub'a iletken bir yol sağlamak için tabın çevresine iki veya üç küçük nokta şeklinde boya uygulayın. Bu işlem topraklama görevi görür. Numuneyi kenara ayırın ve iletken boyanın iki saat boyunca kurumasına izin verin.Kurutma işlemi tamamlandıktan sonra, örneğin üzerine nispeten kalın bir altın paladyum alaşımı veya altın tabakası uygulamak için bir sputter kaplama cihazı çalıştırın. 30 ila 40 nanometre kalınlığında bir kaplama istenir. Örnekteki yetersiz yük dağılımıyla ilişkili sorunları en aza indirmek için taramalı elektron mikroskobisini nispeten düşük bir hızlandırma voltajında gerçekleştirin.Varsa, değişken basınç modunu kullanın. İlk olarak, Z boyutundaki fiberlere odaklanmak için yeterli alan derinliği sağlamak amacıyla çalışma mesafesini iyileştirin. Bunu yapmak için sağ üstteki Gezinme sekmesini açın.Ardından, sahne menüsünden Koordinatlar sekmesine erişin. Burada, Z koordinatı için 20 milimetre gibi daha büyük bir değer girin. Son olarak, değişikliği uygulamak için Git sekmesine basın.Ardından, ilgilenilen yüzeyi elektron demetine dik olarak konumlandırın. Sağ fare düğmesine tıklayıp basılı tutun, ardından numuneyi ilgilenilen hazırlanan yüzey düzleminin çevresine odaklamak için fareyi sola veya sağa kaydırın. Odaklanan çalışma mesafesini not edin.Ardından, manuel kullanıcı arayüzü joystick'ini kullanarak görünümü karşı kenara taşıyın ve odaklama yöntemini tekrarlayın. Çalışma mesafesi değişmişse, her iki konumda yaklaşık bir uyum sağlamak için örneği eğin. Sahne (Stage) menüsünün Koordinatlar (Coordinates) sekmesini kullanın ve T koordinatına bir eğim değeri girin.Şimdi, R koordinat alanına bu değeri girerek örneği 90 derece döndürün. Ardından, tüm konumlar yaklaşık olarak aynı çalışma mesafesinde odaklanana kadar eğme işlemini tekrarlayın. Açıklanan teknik, kullanılmamış bir insan kalp nakli donöründen alınan kalp dokularına uygulanmıştır.İnsan kardiyak matriksi, enine kesitte bal peteği benzeri bir örüntüye sahip olan, çapraz bağlı proteinlerin karmaşık bir dokusudur. Her bir bal peteği yapısı yaklaşık 40 mikron genişliğindedir ve normalde tek bir miyositi çevreler. İnterkale diskler tarafından birbirine bağlandığında, birkaç kardiyomiyosit, tünel benzeri bir şeklin boyunca uzanan bir çubuk olarak düşünülebilir.Yapısal bilgi sağlamanın yanı sıra, deselülerize edilmiş dokuların SEM görüntülemesi, domuzdan alınan enfarktüs geçirmiş kalp dokuları gibi hasarlı veya hasarsız kardiyomiyopati formlarına yanıt olarak anlamlı kalitatif değerlendirmeler yapılmasına olanak tanır. Ayrı bir çalışmada, NRG-1 betanın GGF2 izoformunun kalp yetmezliği için potansiyel bir terapötik tedavi olduğu gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra; ilgili yüzeyin açığa çıkarılması ve örneğin monte edilmesi teknikleri de dahil olmak üzere, kalp dokusu gibi dokuların taramalı elektron mikroskobu için nasıl işleneceği konusunda iyi bir fikir edinmiş olmalısınız.Bu prosedürün ardından, hücre dışı matris proteinlerini ve sinyal iletiminden veya diğer organizasyonel gözlem fenomenlerinden sorumlu diğer bileşenleri ölçmek için kütle spektrometrisi, RNA dizileme ve çeşitli diğer analizler gibi teknikler kullanılabilir. Ayrıca, osmium tetroxide'in mukoza zarlarında buhar fiksasyonuna yol açma potansiyeli nedeniyle tehlikeli bir kimyasal olduğunu unutmayın. Her zaman bir çeker ocak içinde, nitril eldivenler kullanarak ve bir sıçrama koruması veya ocak penceresi ile çalışmayı hatırlayın.

scanning-electron-microscopy-macerated-tissue-to-visualize

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz invadopodia aracılı matriks yıkımı görselleştirmek için floresan jelatin kaplı mikroskop lamelleri üretmek için prototip yöntem açıklanmaktadır. Mevcut yazılımını kullanarak hesaplama teknikleri karışık bir popülasyon içindeki ve bütün mikroskobik alanı kapsayan çok hücreli grupları için tek hücreler ile matris proteolizin sonuç seviyeleri ölçülmesi için sunulmuştur.

Tek ve Çok hücreli Bağlamlarda Invadopodia aracılı Ekstrasellüler Matriks Proteoliz Kantitatif Ölçümü

Hücre dışı matris yara iyileşmesi, iltihap ve kanser gelişimi sürecinde önemli bir yeniden şekil alır. Biz lifimsi dinamiklerinin yanı sıra Epifloresans veya iki-foton mikroskopi kullanılarak yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip örgü benzeri matris bileşenleri görselleştirmek için yeni bir Intravital immunofloresan mikroskopi yaklaşım sunmak.

Epifluoresan ile Doku Matrix Bileşenler ve İki foton Mikroskopi uzun vadeli Intravital İmmünofloresan Görüntüleme

Bu protokol, ECM proteinlerini dokulardan veya tümörlerden zenginleştirmek ve ECM ile zenginleştirilmiş preparatları protein bileşimlerini kütle spektrometresi ile analiz etmek için peptitlere deglikosile etmek ve sindirmek için bir prosedürü açıklar.

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

Bu makromoleküler Crowders (MMC) kullanarak, hücre dışı matris protein açısından zengin hücre-türevi matrisleri elde etmek için bir protokol mevcut. Buna ek olarak, yapının vadesinin korurken kültür süresini azaltır 3D Organotipik bir deri ko-kültür üretimi bölgesi MMC içeren bir protokol mevcut.

Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt<em&gt; İn Vitro</emMakromoleküler Dışlamasını Kullanma&gt; Modeller

Hücre dışı matris, hücrelerin mikro ortamını tanımlamada ve hücre davranışını ve fenotipini modüle etmede önemli bir rol oynar. Mikroskobik, biyokimyasal, proteomik veya fonksiyonel çalışmalar için farklı ölçeklere uyarlanabilen, hücre kaynaklı hücre dışı matrisin izolasyonu için hızlı bir yöntem tarif ediyoruz.

Hücre kaynaklı Ekstrasellüler Matrix A Hızlı, İzolasyon, Fonksiyonel Çalışmaları Ölçeklenebilir Yöntem ve Analiz

Makrofaj hücre dışı tuzakları yeni açıklanan bir varlık vardır. Bu makale confocal mikroskobu yöntemleri üzerinde konsantre ve nasıl olduklarını vitro ve in vivo akciğer örneklerinden görüntülenir.

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Bu iletişim kuralı bir rejeneratif iskele implant parçası olarak preklinik değerlendirme için uygun olan yara onarım için hedeflenen tüm hücre dışı matriks elyaf üretim hedeftir. Bu iplikler fibroblastlar hollow fiber membranlar üzerinde kültür tarafından üretilen ve membranlar dağılması tarafından ayıklanır.

Hücre dışı matriks liflerinin kurban Hollow Fiber membran hücre kültürü ile üretim

Bu protokol, deselülarizasyon ve ex vivo ışınlama sonrasında murine meme Yağ pedleri sonraki hidrojel oluşumu için bir yöntem sunar.

Ekstrasellüler matris Hidrogeller kullanarak normal doku radyasyon etkileri eğitim

Seri bölümlerin şeritlerinin hazırlanmasını ve taramalı elektron mikroskobundaki otomatik görüntüleme prosedürleriyle birlikte Dizi Tomografi örnekleri olarak kullanılmak üzere büyük aktarım desteği üzerine toplanmasını açıklıyoruz. Protokol, yerel, nadir olayların taranmalarına, alınmasına ve hedeflenen görüntülemesine ve büyük veri birimlerinin alınmasına izin verir.

TaramaLı Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Hacim Bilgilerinin Hedefli Edinimi için Dizi Tomografi İş Akışı

Mevcut protokol, alkolsüz steatohepatit (NASH) sırasında hücre dışı matriks (ECM) yeniden şekillenmesinin dinamiklerini görselleştirmek için güvenilir bir platform oluşturmak üzere karaciğer in situ perfüzyon / desellülarizasyon ve iki foton mikroskopi yöntemlerini optimize etmektedir.

Alkolsüz Steatohepatitin Bir Fare Modelinde Karaciğer Hücre Dışı Matriksin 3D Görüntülenmesi

Kemik yenilenmesini çeşitli hiyerarşik seviyelerde değerlendirmek için bir protokol öneriyoruz. Bu çok modlu yaklaşım, farklı uzunluk ölçeklerinde yapısal analizlere olanak tanır ve örnek hazırlığındaki zorlukları etkili bir şekilde ele alır. Ayrıca, biyomalzemelerin kemik yenilenmesini teşvik etmedeki etkinliğini değerlendirmek için güvenilir bir iş akışı sağlar.

Kemik Yenilenmesi ve İskelet Performansını Değerlendirmek İçin Multimodal Yaklaşım

Öğrenin, hücre dışı matrisin yapısını taramalı elektron mikroskobu ile görselleştirme yöntemini. Bu teknik, kardiyak fibroz ve kardiyomiyopatilerde matris organizasyonunu incelemek için değerli bir araç sunar.

Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize'a

Daha fazla video keşfet