Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize'a

Bu yöntemin genel amacı, hücrelerin veya diğer matris olmayan materyallerin yokluğunda kardiyak matrisin yapısını görselleştirmektir. Bu yöntem, fibroz alanındaki temel sorulara, özellikle matrisin içeriğindeki farklılıkların matrisin organizasyonunu nasıl etkileyebileceğine ve bu değişikliklerin farklı kardiyomiyopatileri veya diğer fibrotik hastalıkları nasıl etkileyebileceğine cevap verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, nicel ölçümleri artırmak için kullanılabilecek matrisin nitel bir görünümünü sağlamasıdır.

Dr. Galindo ve Dr. Sawyer, bu tekniği kullanma fikrini, enfarktüs sonrası domuzun düzenli tedavisinin, tedaviden sonra matris içeriğindeki değişikliklere benzer gen ekspresyonunda değişikliklere sahip olduğunu bulduktan sonra buldular. Bu yönteme yeni başlayan kişiler, gerekli ince motor beceriler nedeniyle daha önce SEM numune hazırlama deneyimine sahip değillerse mücadele edebilirler. Doku örneği kolayca görülebilecek kadar büyük olmalı ve dört santigrat derecede yüzde dört glutaraldehit çözeltisi içinde saklanmalıdır.

Dokuyu soğuk hava deposundan çıkarın ve damıtılmış suda durulayın. Daha sonra dokuyu, sudaki peletlerden taze yapılmış yüzde 10'luk bir sodyum hidroksit çözeltisine batırın. Uygun önlemleri aldığınızdan emin olun.

Dokuyu sodyum hidroksit çözeltisinde oda sıcaklığında altı ila 10 gün tutun. Dokunun rengi kirli beyaz veya beyaz olduğunda devam edin. Ardından, dokuyu şeffaf hale gelene kadar damıtılmış suyla durulayın.

Daha sonra eldiven giyin ve dokuyu oda sıcaklığında dört saat boyunca yüzde bir tanik aside batırın. Tanik asit banyosundan sonra, dokuyu gece boyunca damıtılmış suda durulayın. Hazırlık olarak, eldiven giyen bir davlumbazda, 0.2 molar stok sodyum kakodilat tamponu çözeltisi ve yüzde iki sulu stok osmiyum tetroksit çözeltisi yapın.

Osmiyum tetroksit ciddi bir soluma tehlikesi olduğu için bir sıçrama koruması kullanın. Şimdi, sodyum kakodilat tamponunun 0.1 molar seyreltmesini yapın ve içindeki dokuyu hafif bir çalkalama ile beş dakika inkübe edin. Dokuyu sodyum kakodilat ile toplam üç kez yıkamak için tamponu iki kez değiştirin.

Ardından, stok sodyum kakodilat ve stok osmiyum tetroksitin bire bir karışımını yapın. Yeni karışımdaki dokuyu bir saat boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Daha sonra, dokuyu 0.1 molar sodyum kakodilata geri koyun ve beş dakika boyunca hafif bir çalkalama ile inkübe edin.

Bu banyo solüsyonunu 15 dakika boyunca iki kez değiştirin. Daha sonra, artan konsantrasyonlarda bir dizi etanol banyosu kullanarak dokuyu kurutun. Dokunun her banyoda hafif bir çalkalama ile 15 dakika ıslanmasına izin verin.

Daha sonra, doku ve çözeltiyi yüzde 100 etanol ile doldurulmuş sığ bir Petri kabına aktarın. Daha sonra, çok keskin iki tıraş bıçağını, yanların düzlükleri birbiriyle temas edecek ve kesici kenarlar, numunenin üzerinde bir eşkenar üçgenin iki kenarını oluşturacak şekilde çaprazlanacak şekilde dikkatli bir şekilde tutun. Şimdi, ikinci bıçağı numunenin en soluna yerleştirmek için baskın elinizi kullanın ve sağa doğru dilimleyin.

Böylece, minimum bozulma veya yırtılma kuvveti ile tek bir pürüzsüz kesim yapmak için bıçakları zıt yönlerden birbirine doğru kaydırın. Amaç, numuneye zarar vermeden mümkün olduğunca geniş bir yüzey alanı ortaya çıkarmaktır. SEM tarafından incelenmek üzere yeterince tatmin edici kesitler hazırlanana kadar işlemi tekrarlayın.

Bir spatula veya cımbız kullanarak, dokuyu yüzde 100 etanole batırılmış halde tutarken, dokuyu CPD'nin numune tutucusuna aktarın. Doku birkaç saniyeden fazla havaya maruz bırakılamaz. Etanolü sıvı karbondioksit ile değiştirmek için CPD'yi kullanın ve kurutma döngüsünü üretici tarafından belirtildiği gibi gerçekleştirin.

Ardından, her numune için bir SEM numune saplaması hazırlayın. Alüminyum saplamanın üst yüzeyine bir karbon yapışkan şerit yapıştırın. Bir stereoskop altında, numuneyi, ilgilenilen kesit yüzeyi yukarı bakacak şekilde, sekmeden uzakta ve saplama yüzeyi ile maksimum düzlemsel olacak şekilde yapışkan tırnağa dikkatlice yapıştırın.

İlgilenilen yüzeyi araştırmayın veya dokunmayın. En küçük, en zor örnekler için, spatula olarak kullanmak üzere ahşap aplikatör çubuğunu kırın. Ayrıca, düşen bir numuneyi kaybetmemek için büyük bir filtre kağıdı parçası üzerinde çalışın.

Daha iyi yapışma için, konik bir fırça yapmak için kırık bir aplikatör çubuğu kullanın ve numunenin tabanına ve yanlarına gümüş veya karbon boya uygulayın. İlgilenilen yüzeyin bir kenarına kadar çok ince bir boya çizgisi uzatın. Bu, ilgilenilen yüzeyden zemine bir şarj yolu oluşturacaktır.

Ardından, sekmenin yüzeyinden metal saplamaya iletken bir yol sağlamak için karbon tırnağın çevresine iki veya üç küçük boya damlası uygulayın. Bu zemin işlevi görür. Numuneyi bir kenara koyun ve iletken boyanın iki saat kurumasını bekleyin.

Kuruduktan sonra, numuneye nispeten ağır bir altın paladyum alaşımı veya altın tabakası uygulamak için bir püskürtme kaplayıcı çalıştırın. 30 ila 40 nanometre kalınlığında bir kaplama istenmektedir. Numunedeki zayıf yük dağılımı ile ilişkili sorunları en aza indirmek için taramalı elektron mikroskobunu nispeten düşük bir hızlanma voltajında gerçekleştirin.

Varsa değişken basınç modunu kullanın. İlk olarak, Z boyutundaki fiberlere odaklanmak için yeterli alan derinliği sağlamak için çalışma mesafesini iyileştirin. Bunu yapmak için sağ üstteki Gezinme sekmesini açın.

Ardından, sahne alanından Koordinatlar sekmesine erişin. Burada, Z koordinatı için 20 milimetre gibi daha büyük bir değer girin. Son olarak, değişikliği yürütmek için Git sekmesine basın.

Ardından, ilgilenilen yüzeyi elektron demetine dik olarak konumlandırın. Farenin sağ düğmesini tıklayın ve basılı tutun, ardından numuneyi hazırlanan ilgili yüzey düzleminin çevresine yakın bir yere odaklamak için sola veya sağa kaydırın. Odaklanılan çalışma mesafesine dikkat edin.

Ardından, manuel kullanıcı arayüzü joystick'ini kullanarak görünümü karşı kenara taşıyın ve odaklama yöntemini tekrarlayın. Çalışma mesafesi değiştiyse, her iki konumda da yaklaşık bir uyum sağlamak için numuneyi eğin. Sahne Alanı menüsünün Koordinatlar sekmesini kullanın ve T koordinatına bir eğim değeri girin.

Şimdi, bu değeri R koordinat alanına girerek numuneyi 90 derece döndürün. Ardından, tüm pozisyonlar yaklaşık olarak aynı çalışma mesafesine odaklanana kadar eğme işlemini tekrarlayın. Açıklanan teknik, kullanılmayan bir insan kalp nakli donöründen alınan kalp dokularına uygulandı.

İnsan kardiyak matrisi, enine kesitte bal peteği benzeri bir desene sahip olan çapraz bağlı proteinlerin karmaşık bir örgüsüdür. Her bal peteği yapısı yaklaşık 40 mikron genişliğindedir ve normalde tek bir miyositi çevreler. Birbirine bağlı disklerle bağlandığında, birkaç kardiyokardiyo miyosit, tünel benzeri bir şekil boyunca uzunlamasına uzanan bir çubuk olarak tasavvur edilebilir.

Yapısal bilgi sağlamanın yanı sıra, hücreden arındırılmış dokuların bir SEM'i, bir domuzdan alınan enfarktüslü kalp dokuları gibi yaralanma veya yaralanma olmayan kardiyomiyopati formlarına yanıt olarak anlamlı kalitatif değerlendirmeye izin verebilir. Ayrı bir çalışmada, NRG-1 beta'nın GGF2 izoformunun kalp yetmezliği için potansiyel bir terapötik tedavi olduğu gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, ilgilenilen yüzeyi açığa çıkarma ve numuneyi monte etme tekniği de dahil olmak üzere, taramalı elektron mikroskobu için doku, kalp dokusunun nasıl işleneceği hakkında iyi bir fikre sahip olmalısınız.

Bu prosedürü takiben, hücre dışı matris proteinlerini ve sinyalleme ve diğer organizasyonel gözlemsel olaylardan sorumlu diğer proteinleri ölçmek için kütle spesifikasyonu, RNA dizilimi ve diğer çeşitli diğer testler gibi diğer teknikler kullanılabilir. Ayrıca, osmiyum tetroksitin mukoza zarının buharla sabitlenme potansiyeli nedeniyle tehlikeli bir kimyasal olduğunu unutmayın. Her zaman nitril eldivenlerle, sıçrama koruması veya kaput kanadı kullanarak çeker ocakta çalışmayı unutmayın.