Name: In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Öğrenin yetişkin fare pankreas progenitör hücrelerini izole etme ve metilselüloz içeren yarı katı ortamda koloni oluşturma yöntemlerini. Bu teknikler hücre biyolojisi ve kök hücre araştırmalarında yenilenme potansiyelini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz sıralama yardım için Umut City Analitik Sitometri Çekirdek Lucy Brown ve Alexander spalla teşekkür ederiz. Bu çalışma Sağlık (NIH) National Institutes DAT Destekler için Rejeneratif Tıp hibe RB5-07398 için Ulusal Bilim Vakfı Hibe NSF-DMR-1206121 ve California Institute tarafından R01DK081587 ve R01DK099734 HTK için, ve ADR U01DK089533 ve hibe kısmen desteklenen HTK Oxnard Vakfı ve Ella Fitzgerald Vakfı Joseph J. Jacobs DAT Caltech&#39;te Tıp Moleküler Mühendislik Enstitüsü, ve olanlardan minnetle kabul de bulunmaktadır. Finansman: Bu çalışma Sağlık (NIH) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenen HTK için R01DK081587 ve R01DK099734 verir ve ADR U01DK089533, ve Rejeneratif Tıp hibe RB5-07398 için Ulusal Bilim Vakfı Hibe NSF-DMR-1206121 ve California Institute tarafından DAT Joseph J. Jacobs desteklerDAT Caltech&#39;te Tıp Moleküler Mühendisliği Enstitüsü ve Oxnard&#39;ın Vakfı ve HTK için Ella Fitzgerald Vakfı olanlar da şükranla kabul edilmektedir. Bu yayında bildirilen araştırma ödülü numarası P30CA33572 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen Analitik Sitometri Çekirdek ve Işık Mikroskopi Dijital Görüntüleme Core yapılan çalışmaları yer alıyor. Çalışma sponsoru: Sponsor verilerinin çalışma tasarımı, toplama, analiz, ya da yorumlanması katılmadı.

<ol><li>Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+tracing+reveals+the+ontogeny+of+pancreatic+cell+fates+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis.</a> Mech Dev. 120, 35-43 (2003).</li>
<li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9%2B+ductal+cells+are+multipotent+progenitors+throughout+development+but+do+not+produce+new+endocrine+cells+in+the+normal+or+injured+adult+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas.</a> Development. 138, 653-665 (2011).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34%28%2B%29+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).</li>
<li>Inada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrase+II-positive+pancreatic+cells+are+progenitors+for+both+endocrine+and+exocrine+pancreas+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).</li>
<li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17, 849-860 (2009).</li>
<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine%2Facinar+colonies+in+laminin+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-26a+targets+ten+eleven+translocation+enzymes+and+is+regulated+during+pancreatic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).</li>
<li>Ghazalli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+Pancreas+of+Mice+Contains+Tripotent+Progenitors+Capable+of+Giving+Rise+to+Duct%2C+Acinar%2C+and+Endocrine+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+progenitor+cells+in+the+postnatal+mouse+liver+and+pancreas+give+rise+to+morphologically+distinct+insulin-expressing+colonies+in+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Diabet+Stud%22%5BJournal%5D)">Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures.</a> Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Multilineage+Differentiation+and+Self-Renewal+of+Single+Pancreatic+Colony-Forming+Cells+from+Adult+C57Bl%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice.</a> Stem Cells Dev. , (2014).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+conversion+of+human+pancreatic+ductal+cells+into+insulin-secreting+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells.</a> Elife. 2, e00940(2013).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organoid-initiating+cells+in+mouse+pancreas+and+liver+are+phenotypically+and+functionally+similar%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar.</a> Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).</li>
<li>Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoietin%2C+the+ligand+for+the+Mpl+receptor%2C+synergizes+with+steel+factor+and+other+early+acting+cytokines+in+supporting+proliferation+of+primitive+hematopoietic+progenitors+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice.</a> Blood. 87, 4544-4551 (1996).</li>
<li>Ku, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li>
<li>Winkler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+insulin-expressing+colony-forming+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors.</a> J Vis Exp. , e3148(2011).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li>
<li>Formeister, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+SOX9+levels+differentially+mark+stem%2Fprogenitor+populations+and+enteroendocrine+cells+of+the+small+intestine+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).</li>
<li>Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide (PN) 68000088 K1. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.fluidigm.com/documents">http://www.fluidigm.com/documents</a> (2015).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dosage-dependent+requirement+for+Sox9+in+pancreatic+endocrine+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation.</a> Dev Biol. 323, 19-30 (2008).</li>
<li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li>
<li>Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+multipotent+pancreatic+progenitors+using+flow-cytometric+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting.</a> Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).</li>
<li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li>
<li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455, 627-632 (2008).</li>
<li>Baeyens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+cytokine+treatment+induces+acinar+cell+reprogramming+and+regenerates+functional+beta+cell+mass+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice.</a> Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).</li>
<li>Thorel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+adult+pancreatic+alpha-cells+to+beta-cells+after+extreme+beta-cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss.</a> Nature. 464, 1149-1154 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Pankreas koloni deneyleri ve tek bir koloni burada açıklanan analizleri geçmiş yıllarda 23 hematopoetik progenitör hücrelerin biyolojisi çözmekte önemli roller oynamışlardır metilselüloz içeren hematopoetik koloni deneyleri ilham edildi. Bu analizlerde (Şekil 5), pankreas hücreleri içinde plakalanır ayrışmış metil-içeren halka, yoğun ya da endokrin / Asiner koloniler 7 oluşumunu destekleyen uygun büyüme faktörleri ve ECM proteinleri ile yarı-katı ortamı. bir hücre kolonisi ortaya v...

Pankreas üç ana hücre soylarının oluşmaktadır; asiner hücreler sindirim enzimleri, kanallar patojenleri savuşturmak ve bağırsak sindirim enzimleri taşımak için müsin salgılayan salgıladıkları ve endokrin hücreleri glikoz homeostazını korumak insülin ve glukagon da dahil olmak üzere hormonlar, salgılar. Pankreasın embriyonik gelişim sırasında, erken duktal hücreler yetişkin hayvanların 1,2 pancreata üç soy sebebiyet veren yeteneğine sahip tri-güçlü progenitör hücrelerin kaynağıdır. Kemik iliği kök hücreleri olarak yetişkin kök ve progenitör hücreler, zaten başarıyla çeşitli hastalıkların 3 tedavi etmek için kullanılır, çünkü yetişkin pankreas kök ve progenitör hücreler bulmakta yoğun ilgi var. yalıtım ve yetişkin pankreas kök ve projenitör hücrelerin manipülasyonu mümkün olsaydı, bu hücrelerin insülin salgılayan hücreleri otoimmün tahrip edildiği tip 1 diyabet gibi hastalıkları tedavi etmek için kullanılabilir. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; embriyonik gelişiminin tamamlanması yoğun bilim dünyasında tartışılan bir sorudur sonra tri-güçlü progenitör hücrelerin hala yetişkin pankreas kanallarında var olsun. Bu tartışmada, ve kullanma in vivo CRE-lox soy-izleme teknikleri, inada ve arkadaşları bir belirteç, karbonik anhidraz II ile etiketlenmiş erişkin fare duktal hücreler, her üç pankreas soy 4 yol olabileceğini gösterdi. Bununla birlikte, bu HNF1b 5 ve SOX9 2 gibi diğer duktal belirteçleri kullanarak, bu kanal sayısı, yetişkin farelerde p hücrelerinin önemli bir yöntem değildir sonucuna varılmıştır. Birkaç yıl önce, biz yukarıda belirtilen tartışmanın nedeni gerekli kendini yenileme ve çok soy farklılaşma-iki kriter ölçmek için kullanılabilecek uygun analitik araçlar, bu alanda 6,7, eksikliği nedeniyle olabilir önerdi bir kök hücre tanımlamak. Söz in vivo CRE-lox soy-tracing tekniğiYukarıdaki nüfus düzeyinde progenitör-döl ilişki için kanıt sağlayabilir. Ancak, bu soy izleme tekniği tek progenitör hücrelerin kendini yenilemesi ve birden fazla soy içine ayırt edip edemeyeceğini ayırt elinden sınırlıdır. Birkaç mono-güçlü ataları, farklı bir soy potansiyeline sahip her birlikte analiz edildi, onlar topluca çok soyundan farklılaşma yeteneklerine sahip görünebilir, çünkü Tek hücre analizi önemlidir. Buna ek olarak, kök hücreler, genellikle yetişkin bir organın küçük bir gruptur. küçük bir hücre popülasyonu faaliyetleri büyük nüfus tarafından maskeli olabilir. Bu nedenle, nüfus çalışmanın bir negatif sonuç mutlaka kök hücrelerin yokluğunu göstermez. Son olarak, CRE-lox soy izleme şu anda kendini yenileme ölçümünü izin vermez. Pankreatik progenitör hücre biyolojisi, koloninin alanında teknik boşluğu ele başlamak için 7-11 veya organoid 12-15 </su3D kültür sistemi kullanılarak p&gt; deneyleri icat edildi. Pankreas atalarıdır için iki koloni deneyleri laboratuvarda geliştirilmiştir: bir kemirgen hücre dışı matriks proteinleri (ECM) (Yöntemler ve Ekipmanları Tabloya bakınız) ticari bir hazırlık içerir ve diğer laminin hidrojel, tanımlanmış bir yapay ECM protein 7-11 içerir. Progenitör hücreler, yan-katı ortam içeren metilselüloz karıştırılır. Metilselüloz ağaç liflerinden hazırlanan biyolojik olarak eylemsiz ve yapışkan bir malzemedir ve rutin olarak hematopoietik koloni deneylerinde 16 kullanılmıştır. bunlar yeniden toplanamamış- böylece metilselüloz içeren yan-katı ortam bir progenitör hücrelerin hareketi kısıtlar. Bununla birlikte, ortam bir progenitör hücre büyümesi ve 3D uzayda bir hücre kolonisi ayırt izin verecek kadar yumuşaktır. hematolog geleneğini izleyerek, hücrelerin bir koloni sebebiyet veren yapabileceğini bir pankreatik progenitör hücre n olduamed pankreas koloni oluşturan birimi (PCFU). Fare ECM içeren koloni tahlilinde yetiştirilen PCFUs, &quot;Halka&quot; koloniler 7 adlandırılır kistik koloniler meydana getirirler. Wnt agonistinin eklenmesi üzerine, R spondin1, kemirgen ECM içeren kültürü bazı halkası koloniler &quot;yoğun&quot; koloniler 7 çevrilir. Bu makalede, fare ECM kültüründe yetişen koloniler bu iki tür toplu olarak &quot;Halka / Yoğun&quot; koloniler olarak adlandırılır. Yüzük / Yoğun koloniler tek bir hücre süspansiyonu içine ayrışmış ve laminin hidrojel ihtiva kültürlere yeniden kaplama zaman, &quot;Endokrin / Asiner&quot; koloniler 7 oluşturulmaktadır. Tek bir koloni analizleri kullanarak, 9 sıçan pankreas, ya yetişkin dan (2-4 aylık) 7,11 ya da genç (1 haftalık) Yüzük / Yoğun ve Endokrin / Asiner kolonilerinin çoğunluğu, üçünü ifade olduğu tespit edilmiştir soy belirteçleri. Bu menşe PCFUs en tri-güçlü olduğunu göstermektedir. Fare ECM içeren koloni deneyde, yetişkin fare PCFUs sağlam kendini yenilemek ve kültür 7 11 hafta boyunca yaklaşık 500.000 kez genişletin. Laminin hidrojel mevcudiyetinde, sıçangil PCFUs endokrin ve asinar hücreleri içine, tercihen ayırt etmek için teşvik duktal soy 7,9,11 çok az oysa sıçangil ECM tercihan, endokrin ve asinar soyları duktal hücrelerin farklılaşmasını destekler. Önemli olarak, insülin + Glukagon - mono- hormon hücreleri laminin hidrojel kültürde üretilir ve fonksiyonel olgunlaşmasına gösteren in vitro 7,9 bölgesindeki Glükoz uyarısına karşı tepki olarak insülin salgılar edilir. 7,9 olası üç dizi farklılaşma ve bireysel PCFUs kendini yenileme 11 koloni oluşumu için oyuk başına bir hücrenin kültürlenmesini, tek hücreli mikromanipülasyon örneğin tarafından teyit edilir. Birlikte, bu sonuçlar kendini yenileyen, tri-Poten olduğunu kanıtlar sunmaktadırt, 3D kültür faaliyetleri göstermek doğum sonrası fare pankreas progenitör benzeri hücreler. Bu makalede açıklanan sıçangil PCFU tahlilleri fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) 17 ile ayırt progenitör hücreler için tasarlanmış önceki koloni deneyi türetilir. Bu protokol başka vallahi yayında 18&#39;de detaylı olarak belgelenmiştir. Kültür bileşenleri ve yetişkin PCFUs için, sıçan ECM içeren koloni deneyi gerçekleştirmek için gereken teknikler Mesc türetilmiş progenitörleri 17,18 ile aynıdır. Bu nedenle, testin bu yönleri burada tekrar edilmeyecektir; yerine aşağıdaki prosedürler ele alınacaktır: 1) yetişkin pankreas ayrışma ve yetişkin farelerin 7, 2) sıralanmış hücrelerin tek hücreli manipülasyon, 3) Tek koloni gelen PCFUs zenginleştirmek CD133 + SOX9 / EGFP + duktal hücreleri, sıralama mikroakışkan Mah-PCR ve tüm montaj immün ve Colonie 4) ayrışmasını kullanarak analizlertek hücre süspansiyonu ve içine s fare ECM veya laminin hidrojel koloni deneyleri içine yeniden kaplama.

<table><tbody><tr><td>Murin ECM proteinleri (Matrigel)</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, ABD)</td><td>354230</td><td>Stok -20 &#176'da tutuldu; </td></tr><tr><td>David Tirrell (Pasadena, CA ABD)</td><td></td> Tarafından Sağlanan C<td>Laminin Hidrojel</td> <td>Stok -20 & # 176'da tutuldu; C</td></tr><tr><td>Metilselüloz</td><td>Shinetsu Chemical (Tokyo, Japonya)</td><td></td><td>1.500 centipoise (dinamik viskozite birimi 15 g/cm/sn'ye eşit) (yüksek viskozite)</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuzlu</td><td>Mediatech (Manassas, VA, ABD)</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu</td> Su <td>Gibco (Grand Island, NY, ABD)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Flacon Konik flakon</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, ABD)</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm Süspansiyon kültür kabı</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, ABD)</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümin</td><td>Sigma (St. Louis, MO, ABD)</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco (Grand Island, NY, ABD)</td> <td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>DNase1</td><td>Calbiochem (Darmstadt, Almanya)</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz B</td><td>Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, İsviçre)</td><td>11088831001</td><td>Stok -20 &#176'da tutuldu; C</td></tr><tr><td>Anti-fare CD16 / 32</td><td>Biolegend (San Diego, CA, ABD)</td> <td>101310</td><td>düşük endotoksin, azid içermeyen</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Sıçan IgG2a ve kappa; İzotip Kontrolü</td><td>Biyoefsanesi (San Diego, CA, ABD)</td><td>400522</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan IgG1 ve kappa; İzotip Kontrolü</td><td>eBioscience (San Diego, CA, ABD)</td><td>13-4301-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD133-Biotin</td><td>eBioscience (San Diego, CA, ABD)</td><td>13-1331-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD71-PE-CY7</td><td>Biolegend (San Diego, CA, ABD)</td><td>113812</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Allophycocyanin</td><td>Biolegend (San Diego, CA, ABD)</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>4 ',6-Diamidino-2-fenilindol</td><td>Invitrogen ( Waltham, MA,&nbsp; ABD)</td><td>3571</td><td>Hisse senedi -20 &#176'da tutuldu; C</td></tr><tr><td>Anti-müsin 1</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA ABD)</td> <td>HM-1630-P1</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 649 Keçi anti-Ermeni Hamster Jackson</td><td>Immuno (West Grove, PA, ABD)</td> <td>127-495-160</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı: Besin Karışımı F-12</td><td>Mediatech (Manassas, VA, ABD)</td> <td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Tissure Kültürü Biyolojikleri (Long Beach, CA, ABD)</td><td>101</td><td>Hisse senedi -20 &#176'da tutuldu; C</td></tr><tr><td>Tris Etilendiamintetraasetik asit</td><td>TEKnova (Hollister, CA, ABD)</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mikro Kiti</td><td>Qiagen (Venlo, Hollanda)</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTec Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Qiagen (Venlo, Hollanda)</td><td>205310</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect Tek Adımlı qRT-PCR Kiti</td><td>Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, ABD)</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, ABD)</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, ABD)</td><td>005-000-121</td><td>Stok -20 & # 176'da tutuldu; C</td></tr><tr><td>Eşek serumu</td><td>Jackson Immuno (West Grove, PA, ABD)</td><td>0017-000-121</td><td>Stok -20 & # 176'da tutuldu; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma (St. Louis, MO, ABD)</td> <td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma (St. Louis, MO, ABD)</td> <td>T-4799</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>İnvitrojen (Waltham, MA, &nbsp; ABD)</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri (Waltham, MA, ABD)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Steril Su</td><td>Gibco (Grand Island, NY, ABD)</td><td>15230-147</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Pasteur Pipet</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, ABD)</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>40 & mu; m Filtre Mesh</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, ABD)</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m filtre ağı</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, ABD)</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>TC Plaka 96 Kuyu Süspansiyonu</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924 (Önceden 83.1835)</td><td></td></tr><tr><td>1 cc Şırınga</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, ABD)</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 cc Şırınga</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, ABD)</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>48.48 Dimantik Dizi Çip</td><td>Akışkanlığı (San Francisco, CA, ABD)</td><td>BMK-M-48.48</td><td></td></tr><tr><td>Fluidigm GE 48.48 Dinamik Dizi Örneği & Tahlil Yükleme Reaktif</td><td>Kiti Fluidigm (San Francisco, CA, ABD)</td><td>85000800</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Uygulamalı Biyosistemler (Grand Island, NY, ABD)</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen glikol sorbitan monolaurat</td><td>Sigma (St. Louis, MO, ABD)</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Cam Tabanlı Çanak</td><td>MatTek (Ashland, MA, ABD)</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>35 mm Cam tabanlı</td></tr> <tr><td>petri kabıAğızlık/Kauçuk Boru</td><td>Renova Life Inc. (College Park, MD, ABD)</td><td>MP-SET</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma (St. Louis, MO, ABD)</td><td>N0636</td><td>Stok -20 &# 176'da tutuldu; C</td></tr><tr><td>Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü R</td><td>& D Systems (Minneapolis, MN, ABD)</td><td>293-VE</td><td>Hisse senedi -80 &#176'da tutuldu; C</td></tr><tr><td>Aktivin B Ar-Ge</td><td> D Systems (Minneapolis, MN, ABD)</td><td>659-AB</td><td>Hisse Senedi -80 &#176'da tutuldu; C</td></tr><tr><td>Extendin 4</td><td>Sigma (St. Louis, MO, ABD)</td><td>E7144</td><td>Stok -20 &#176'da tutuldu; C</td></tr><tr><td>Rspondin-1 Ar-Ge</td><td> D Systems (Minneapolis, MN, ABD)</td><td>3474-RS</td><td>Hisse senedi -80 &#176'da tutuldu; C</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Polistiren Yuvarlak Tabanlı Boru</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, ABD)</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide İğnesi 18 G x1 1/2</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, ABD)</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide İğnesi 16 G x 1 1/2</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, ABD)</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Costar Ultra Düşük Bağlantı Yüzeyi 24 kuyulu düz tabanlı plaka&nbsp;</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, ABD)</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 Siyah Kuyu Plakası</td><td>Corning Inc. (Corning, NY, ABD)</td><td>3603</td><td>Düz, kapaklı şeffaf taban. Siyah polistiren TC ile muamele edilmiş mikroplakalar</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Ters Mikroskop</td><td>Carl Zeiss AG (Oberkochen, Almanya)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD&nbsp;</td><td>Fluidigm (San Francisco, CA, ABD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aria Özel Sipariş Araştırma Ürünü Hücre Sıralayıcısı</td><td>Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, ABD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS/BSA</td><td></td><td></td><td>1x PBS 
%0,1 (ağırlık/hacim) BSA 
PenStrep (49 Ünite/ml Penisilin, 49 &mu; g / ml Streptomisin)</td></tr> <tr><td>PBS / BSA / Dnase1</td><td></td><td></td><td>1x PBS 
%0,1 (ağırlık/hacim) BSA 
PenStrep (49 Ünite/ml Penisilin, 49 &mu; g / ml Streptomisin) 
Dnase 1 (pankreas başına 2.400 Birim / ml)</td></tr></tbody></table>

in vitro colony tahliller tri-güçlü progenitör hücreleri karakterize yetişkin fare pankreas İzole

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Kök ve yetişkin pankreas progenitör hücreler tip 1 şeker hastalığı olan hastaları tedavi etmek için terapötik bir beta-benzeri hücrelerin potansiyel bir kaynak olabilir. kök ve progenitör hücrelerin yetişkin pankreas mevcut olup olmadığını Bununla birlikte, hala bilinmemektedir. Yetişkin farelerde soy-tracing CRE-lox kullanarak araştırma stratejileri desteği ya da iki beta hücreleri kanalları, yetişkin pankreas atalarıdır bulunabilir tahmin yerden oluşturulabilir fikrini çürütmek olduğunu sonuçlar vermiştir. Bunlar, in vivo CRE-lox soy-izleme yöntemleri, ancak, kendini yenileme ve bir kök hücre tanımlamak için gerekli olan multi-soy farklılaşma iki kriter sorulara cevap veremez. Bu teknik boşluğu ele başlamak için, biz pankreas atalarıdır için 3 boyutlu koloni deneyleri tasarladı. Yakında bizim ilk yayınlanmasından sonra, diğer laboratuarlar bağımsız organoid tahlil denilen benzer, fakat özdeş değildir, yöntemi geliştirdi. organoid tahlil ile karşılaştırıldığında, bizim yöntem kullanırdüşük konsantrasyonlarda hücre dışı matris proteinlerinin dahil edilmesine izin yapışkan solüsyonlar oluşturur metilselüloz,. birçok yetişkin organı kök hücreleri için olduğu gibi metilselüloz içeren deneyler, daha kolay tespit ve progenitorlar küçük bir alt-nüfusu meydana getirdiğinde kritik olan tek hücre düzeyinde projenitör hücrelerinin analizleri izin verir. Birlikte, birkaç laboratuar sonuçları farelerden pankreatik progenitör benzeri hücrelerin in vitro kendini yenileme ve çok nesilli farklılaşmasında göstermektedir. Geçerli protokoller fare pankreas atalarıdır karakterize etmek iki metilselüloz tabanlı koloni analizler açıklanmaktadır; biri laminin hidrojel olarak bilinen murin hücre dışı matris proteinlerinin bir ticari preparatıdır ve diğer yapay hücre dışı matris protein içerir. Burada gösterilen teknikler 1) pankreas ayrışma ve CD133 + SOX9 / EGFP sıralama erişkin farelerin + duktal hücreler, s 2) tek bir hücre manipülasyon vardırorted hücreler, 3) tek bir koloni kendini yenileme veya farklılaşmasını değerlendirmek için ikincil koloni deneyleri içine mikroakışkan QRT-PCR ve tüm montaj immün ve tek hücre süspansiyonları ve yeniden kaplama içine birincil kolonilerin 4) ayrışmayı kullanarak analiz eder.

Yetişkin pankreatik progenitör hücreler, floresan aktive hücre sınıflandırma (Şekil 1) ile zenginleştirilmiş olabilir. ~ SOX9 20 75 kb yukan ve ~ 150 kb aşağı sekansları burada kullanılan SOX9 / EGFP transgenik fare hattı ilk GENSAT Beyin Atlas Proje 19 bir sonucu olarak oluşturulan ve EGFP raportör ihtiva eden bir bakteriyel yapay kromozom kontrolü altındadır . Bu farelerde, EGFP verimli ve özellikle 22 pankreas kanalları etiketler. Pank...

Kendini yenileme ve erişkin fare pankreas izole progenitör hücrelerin farklılaşmasını tespit etmek için in vitro koloni deneylerde icat edilir. Bu analizlerde, pankreas ataları metilselüloz içeren yan-katı bir ortam içinde 3-boyutlu bir uzayda hücre kolonileri yol açar. tek hücreler ve bireysel koloniler karakterizasyonu taşıma protokolleri açıklanmıştır.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Bu protokollerin genel amacı, metilselüloz içeren yarı katı ortam kullanan kültür analizleri aracılığıyla, yetişkin farelerden izole edilen pankreatik progenitör hücrelerden büyütülen hücre kolonilerini karakterize etmektir. Yöntemlerimiz, yetişkin pankreastaki progenitör hücrelerin kendi kendini yenileme ve farklılaşma kapasiteleri nelerdir gibi, pankreatik progenitör hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajı, gerçek biyolojik potansiyellerini ayırt etmek için önemli olan tekil progenitör hücrelerin incelenmesine olanak tanımalarıdır.Bu yöntemlere dair ilk fikrimiz, hematopoetik kök hücreleri incelemek için kullanılan koloni analizlerinin pankreas hücre popülasyonlarına da uygulanabileceğini fark ettiğimizde ortaya çıktı. Prosedürleri, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Jacob Tremblay, doktora sonrası araştırmacı Dr. Janine Quijano ve teknisyen Bayan Angela Luo gerçekleştirecekler. Sakrifikasyondan sonra mümkün olan en kısa sürede, makas kullanarak karın duvarının orta hattı boyunca dikey bir insizyon yapın ve karın boşluğunu açın.Pens yardımıyla dalağı nazikçe kaldırın ve dalak ile pankreasın splenik lobu arasın

in-vitro-colony-assays-for-characterizing-tri-potent-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Kanser kök hücreleri (CSCS) malignitelerin çok sayıda tespit edilmiştir. Bu protokolde, aldehit dehidrogenaz aktivitesi ve CD44 ve CD24 ifade kullanan bir insan pankreas adenokarsinomu xenografts CSCS yalıtmak için akım sitometri yöntemi açıklar. Bu canlı hücreler, sonra fonksiyonel ve analitik çalışmalar kullanılabilir.

İnsan Pankreas Kanseri Xenografts Kök Hücre İzolasyonu

Pankreas gibi atalarıdır insülin ifade koloniler içine ayırt etmek için izin veren üç boyutlu clonogenic tahlil açıklanmıştır. Bu yöntem, metilselüloz, Matrigel ve büyüme faktörleri içeren yarı-katı medya yararlanır, tek atalarıdır çoğalırlar ve...

İnsülin ifade Koloni oluşturan atalarıdır için Kantitatif Testi

Çalışmada insan embriyonik kök hücreleri pankreas farklılaşma uyarması yönlendirilmiş bir farklılaşma yaklaşım anlatılmaktadır. Büyük önem insülin salgılayan hücrelerin içine pankreas ataları edilen insan embriyonik kök hücre bulma olduğu endotel hücre ko-kültür aracılık olgunlasmasi.

İnsan Embriyonik endotel hücre Co-kültür aracılık Olgunlaşma Bir Yönetmen Farklılaşma Yaklaşım Pankreas insülin üreten hücreler için Kök Hücre

Burada, fare embriyonik pankreas izolasyonu, kültür ve manipülasyon için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu mükemmel bir...

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

Bu protokol açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi dallı bir organ haline onların önemli genişleme, farklılaşma ve morfojenezinin dahil dağınık embriyonik fare pankreas atalarıdır, gelen pankreas gelişimini özetlediği. Bu yöntem, görüntüleme, niş fonksiyonel müdahale ve manipülasyon için uygun değildir.

Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste

Burada, serbest dalgalı e10.5 ayrışmış pankreas ataları ve ilişkili Mezenşim 3D fare pancreatoids ifade insülin üretmek için bir iletişim kuralı mevcut.

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

Bu protokol ortotopik pankreas tümörlerinin cerrahi nesil ve taze izole mürin pankreas tümörlerinin hızlı sindirim açıklar. Sindirimden sonra, canlı bağışıklık hücresi popülasyonları daha fazla downstream analizi için kullanılabilir, akış sitometri ile hücre içi sitokin tespiti için T hücrelerinin ex vivo stimülasyon dahil.

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

Bu protokol, insan diş pulpası kök hücrelerini (hDC'ler) pankreas soylarına in vitroolarak ayırt etmek için iki farklı indüksiyon protokolü arasında bir karşılaştırma sunar: bütünleştirici protokol ve bütünleştirici olmayan protokol. Bütünleştirici protokol daha fazla insülin üreten hücre (IPC) üretir.

Tüp bebek pankreas soylarına doğru İnsan Diş Pulpası Kök Hücrelerinin İndüksiyonu

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Öğrenin yetişkin fare pankreas progenitör hücrelerini izole etme ve metilselüloz içeren yarı katı ortamda koloni oluşturma yöntemlerini. Bu teknikler hücre biyolojisi ve kök hücre araştırmalarında yenilenme potansiyelini anlamaya yardımcı olur.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Daha fazla video keşfet