Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, deselülerize akciğer iskeleleri ile oluşturulmuş bir 3B kültür düzeneği kullanarak, fare embriyonik kök hücrelerinin olgun havayolu epitelyal hücrelerine farklılaşmasını yönlendirmektir. Bu yöntem, akciğer soy hattı farklılaşması sırasında hücre matris kontraksiyonlarının ve büyüme faktörü sinyallerinin rolü gibi akciğer gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tanımlanmış serumsuz bir ortamda 3B kültür sistemi kullanması ve diğer endoderm soy hatlarından gelen kontaminasyonu sınırlı tutarak güçlü bir havayolu epitelyal farklılaşması sağlamasıdır.Yetişkin bir Wistar sıçanını metin protokolüne göre ötenazi yaptıktan sonra, ön patileri ve arka bacakları sabitleyerek hayvanı bir diseksiyon yüzeyine yerleştirin ve göğüs ile karın bölgesine %70 ethanol püskürtün.Kaburga kafesinin hemen altına bir insizyon yapın.Deriyi kesin ve diyaframı açığa çıkarın.Ardından, akciğerlerin geri çekilmesini sağlayarak akciğerlerin delinme riskini azaltmak için diyafram boyunca küçük insizyonlar yapın.Daha sonra, sternum boyunca dikey bir insizyon oluşturun ve kalp ile akciğerlere erişmek için torasik boşluğu açın.Ardından bir sütür ile vena cava inferior'u bağlayın ve sol atriyuma küçük bir insizyon yapmak için küçük diseksiyon makasları kullanın.Heparinize Hank's Balance salt solution ile doldurulmuş 25 gauge iğneli, hazırlanmış 10ml şırınga kullanarak, iğneyi sağ ventriküle yerleştirip tamponu pulmoner dolaşım boyunca iterek akciğer perfüzyonuna başlayın.Akciğerler beyazlaşana ve sol atriyumdan akan sıvı berraklaşana kadar perfüzyona devam edin.Perfüzyonun ardından trakeayı açığa çıkarın ve kanülasyon için tiroid kıkırdağına yakın bir yere küçük bir insizyon yapın.Ardından, plastik bir kateter ile trakeayı kanüle edin ve yerinde sabitlemek için bir sütür kullanın.Şimdi, 10ml şırıngayı bir statif ve klemense sabitleyerek bir yerçekimi perfüzyon sistemi kurun.Ardından, şırınga pistonunu çıkarıp atın.Şırınga gövdesindeki maksimum dolum noktasını akciğerlerin 20 cm üzerine sabitleyin, ardından şırınganın ucuna iki yollu bir stopkok ve stopkokun diğer ucuna uzun plastik bir tüp takın.Kateteri trakeadan nazikçe çekin ve plastik tüpün ucuna bağlayın.Ardından, şırıngaya deselülerizasyon solüsyonu doldurun ve solüsyonun bağlı plastik tüpü ve kateteri tamamen doldurmasını sağlayın.Solüsyonla dolu kateteri tekrar trakeaya yerleştirin ve bir dakika boyunca toplam akciğer kapasitesine kadar doldurarak akciğerleri lavaj yapın.Ardından, sıvının akciğerlerden dışarı akmasını sağlamak için kateteri trakeadan çıkarın.Akciğer lavajını deselülerizasyon solüsyonu ile sekiz kez tekrarlayın ve ardından PBS ile on kez durulama yapın.Lavaj adımları tamamlandığında akciğerler beyaz görünecektir.Ardından trakeayı ve akciğerleri boyun ve göğüs boşluğundan disseke edin.Özofagus ve kalp dahil olmak üzere disseke edilen akciğerlerdeki fazla dokuları temizleyin, ardından vibratom kesit hazırlığına kadar akciğerleri soğuk PBS'ye aktarın.Kalın kesitler hazırlamak için, PBS içinde yaklaşık 15ml %2 ve %4 düşük erime noktalı agaroz ve tüm lobların küçük dikdörtgen bloklara gömülmesi için yeterli miktarda %6 agaroz hazırlayın.Agarozu 15ml tüplere aktardıktan sonra, tüpleri bir ısıtma bloğuna yerleştirin ve jelleşmeyi önlemek için sıcaklığı 40 degrees celsius üzerinde tutun.Küçük makaslar kullanarak, deselülerize akciğeri her lober bronşun ucundan disseke edin ve her lobu ayırın.Ardından fazla PBS'yi temizlemek için emici kağıtlar kullanın ve dokuyu kaplamak için lobları ısıtma bloğu üzerindeki %2 agaroza beş dakika boyunca aktarın.Her lobu bir petri kabına aktardıktan sonra, kabı bir soğutucu plaka üzerine yerleştirin ve yüzeyin bir dakika boyunca jelleşmesine izin verin.Lobları nazikçe %4 agarozun içine yerleştirin; beş dakika inkübasyon ve soğutmadan sonra kaplama işlemini %6 agaroz ile tekrarlayın.Kaplamadan sonra, metal tabanlı kalıplar kullanarak her lobu ayrı ayrı %6 agaroza gömün, dokunun kenarlarını en az 3ml agaroz çevrelesin.Daha sonra, pens ile dokunun en geniş düz kenarını metal kalıbın deneyciye bakan yüzeyine konumlandırarak her lobu yönlendirin ve gömme işlemini plastik kasetler kullanarak tamamlayın.Blokların vibratom kesimi öncesinde soğuk plaka üzerinde en az 30 dakika jelleşmesine izin verin.Alternatif olarak, blokları vibratom kesimi öncesinde dört degrees celsius'ta nemlendirilmiş bir odada 12 saate kadar saklayın.Kesitler hazırlamak için, kesim odasını soğuk PBS ile doldurarak vibratomu kurun.Kesim boyunca soğuk sıcaklığı korumak için çevresine bir buz banyosu kurun.Şimdi, blokları metal kalıplardan çıkarın ve bir jilet kullanarak, dokunun kenarından yaklaşık üç milimetre mesafe bırakarak lobları çevreleyen fazla agarozu kırpın.Yapıştırıcı kullanarak dokuyu numune plakasının merkezine sabitleyin ve plakayı PBS ile dolu kesim odasına daldırın.Vibratom üzerindeki kesim bıçağını yerleştirin.Vibratom üzerindeki kesim sınırlarını sırasıyla aşağıdaki hız, genlik ve kalınlık değerlerini seçerek ayarlayın.Her lobu tamamen kesin ve kesitler birbirinden tam olarak ayrılmazsa, kesitleri manuel olarak ayırmak için küçük makaslar kullanın.Ardından, iskele kesitlerini nazikçe toplayın ve soğuk PBS'ye aktarın.Pens kullanarak her kesiti çevreleyen agarozdan nazikçe kurtarın.İskele kesitlerini dekontamine etmek için, onları PBS'den mikrosantrifüj tüplerine aktardıktan sonra, PBS içinde mililitre başına 90 unit nükleaz ekleyin ve oda sıcaklığında bir rotatörde 12 ila 24 saat inkübe edin.Kesitleri yeni mikrosantrifüj tüplerine aktardıktan sonra, metin protokolüne göre, steril koşullar altında antimikrobiyal solüsyon ekleyin ve oda sıcaklığında bir rotatörde altı saat inkübe edin.Ardından steril koşullar altında, hücre ekimi öncesinde iskeleleri PBS ile iki kez durulayın ve serumsuz besiyerine veya SFDM'ye aktarın.Hava-sıvı ara yüzey kültürü kurmak için, steril pensler kullanarak bir petri kabına hidrofobik membranlar yerleştirin.Ardından, her deselülerize iskele kesitini SFDM'den bir membran üzerine aktarın ve kesitlerin membran üzerinde eşit şekilde yayıldığından emin olun.Kuyucukları sırasıyla 1ml veya 0.5ml SFDM ile doldurarak altı veya on iki kuyucuklu plakalar hazırlayın.Ardından, membranları nazikçe kuyucuklara yerleştirin ve membranın besiyerinin üzerinde yüzerek bir hava-sıvı kültür düzeneği oluşturmasını sağlayın.3B iskelelere ekim yapmak için, endodermal hücrelerin hazırlanması ve definitif endodermi zenginleştirmek için floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama (FACS) işleminin ardından, ayıklanan hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın.Ardından hücreleri 400 Gs'de beş dakika santrifüjleyin.SFDM kullanarak, çökelen hücreleri 10 ml içerisinde yaklaşık 100,000 hücre olacak şekilde yeniden süspande edin.