Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerinin, hücreden arındırılmış akciğer iskeleleri ile kurulan bir 3D kültür kullanarak olgun hava yolu epitel hücrelerine farklılaşmasını yönlendirmektir. Bu yöntem, akciğer soyu farklılaşması sırasında hücre matrisi kasılmalarının rolü ve büyüme faktörü sinyalizasyonu gibi akciğer gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, tanımlanmış bir serum içermeyen ortamda bir 3D kültür sistemi kullanması ve diğer endoderm soylarından sınırlı kontaminasyon ile sağlam hava yolu epitel farklılaşması elde etmesidir. Yetişkin bir wistar sıçanına ötenazi yaptıktan sonra, metin protokolüne göre, ön ayakları ve arka ayakları sabitleyerek hayvanı diseksiyon yüzeyine sabitleyin ve göğsüne ve karnına püskürtmek için% 70 etanol kullanın. Göğüs kafesinin hemen altında bir kesi oluşturun. Cildi kesin ve diyaframı ortaya çıkarın. Ardından, akciğerlerin geri çekilmesine neden olmak ve akciğerlerin delinme olasılığını azaltmak için diyaframdan küçük kesiler yapın. Ardından, sternum boyunca dikey bir kesi oluşturun ve kalbe ve akciğerlere erişmek için göğüs boşluğunu açın. Daha sonra bir dikişle inferior vena kava'yı bağlayın ve sol atriyuma küçük bir kesi yerleştirmek için küçük diseksiyon makası kullanın. Heparinize Hank's Balance tuz çözeltisi ile doldurulmuş 25 gauge iğne ile hazırlanmış 10 ml'lik bir şırınga kullanarak, iğneyi sağ ventriküle sokarak akciğer perfüzyonunu başlatın ve tamponu pulmoner dolaşımdan itin. Akciğerler beyazlaşana ve sol atriyumdan akan sıvı berraklaşana kadar perfüzyona devam edin. Perfüzyonu takiben, trakeayı açığa çıkarın ve kanülasyon için tiroid kıkırdağının yakınında küçük bir kesi yapın. Daha sonra plastik bir kateter ile trakeayı kanüle edin ve yerine sabitlemek için bir dikiş kullanın. Şimdi, 10 ml'lik bir şırıngayı bir imbik standına ve kelepçeye sabitleyerek bir yerçekimi perfüzyon sistemi kurun. Ardından, şırınga pistonunu çıkarın ve atın. Şırınga haznesindeki maksimum doldurma noktasını akciğerlerin 20 cm yukarısına sabitleyin, ardından şırınganın ucuna iki yönlü bir musluk ve musluğun diğer ucuna uzun bir plastik boru takın. Kateteri trakeadan yavaşça dışarı çekin ve plastik borunun ucuna takın. Ardından, hücre giderme solüsyonunu şırıngaya dökün ve solüsyonun takılı plastik boruyu ve kateteri tamamen doldurmasına izin verin. Solüsyon dolu kateteri tekrar trakeaya yerleştirin ve bir dakika boyunca toplam akciğer kapasitesine kadar doldurarak akciğerleri lavajlayın. Ardından, sıvının akciğerlerden dışarı akmasına izin vermek için kateteri trakeadan çıkarın. Akciğerlerin lavajını hücre giderme solüsyonu ile sekiz kez tekrarlayın, ardından PBS ile on durulama yapın. Lavaj adımlarının tamamlanmasıyla akciğerler beyaz görünecektir. Daha sonra trakea ve akciğerleri boyun ve göğüs boşluğundan inceleyin. Yemek borusu ve kalp de dahil olmak üzere diseke edilmiş akciğerlerden fazla dokuyu çıkarın, ardından vibratom kesitine hazırlanana kadar akciğerleri soğuk PBS'ye aktarın. Kalın kesitler hazırlamak için, PBS'de yaklaşık 15 ml %2 ve %4 düşük erime noktalı agaroz ve tüm lobları küçük dikdörtgen bloklara gömmek için yeterli miktarda %6 agaroz yapın. Agarozu 15 ml'lik tüplere aktardıktan sonra, tüpleri bir ısı bloğuna yerleştirin ve jelleşmeyi önlemek için sıcaklığı 40 santigrat derecenin üzerinde tutun. Küçük bir makas kullanarak, her lober bronşun sonundaki hücreden arındırılmış akciğeri inceleyin ve her bir lobu ayırın. Daha sonra fazla PBS'yi çıkarmak için emici tabakalar kullanın ve dokuyu kaplamak için lobları beş dakika boyunca ısıtma bloğu üzerinde% 2 agaroza aktarın. Her lobu bir petri kabına aktardıktan sonra, kabı soğuk bir tabağa koyun ve yüzeyin bir dakika jelleşmesine izin verin. Lobları nazikçe %4 agarozun içine yerleştirin ve beş dakika inkübe ettikten ve soğuduktan sonra kaplamayı %6 agaroz ile tekrarlayın. Kaplamadan sonra, dokuyu kenarlardan çevreleyen en az 3 ml agaroz ile her bir lobu ayrı ayrı% 6 agaroz içine gömmek için metal tabanlı kalıplar kullanın. Daha sonra, forseps ile, dokunun en büyük düz kenarını deneyciye bakan metal kalıbın yüzeyine yerleştirerek her bir lobu yönlendirin ve plastik kasetler kullanarak gömmeyi tamamlayın. Vibratom kesitinden önce blokların en az 30 dakika soğuk bir plaka üzerinde jelleşmesine izin verin. Alternatif olarak, vibratom kesitinden önce blokları nemlendirilmiş bir odada dört santigrat derecede 12 saate kadar saklayın. Bölümleri hazırlamak için, kesit odasını soğuk PBS ile doldurarak vibratomu ayarlayın. Kesit boyunca soğuk bir sıcaklığı korumak için çevrede bir buz banyosu kurun. Şimdi, blokları metal kalıplardan çıkarın ve dokunun kenarından yaklaşık üç milimetre uzakta tutarken lobları çevreleyen fazla agarozu kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Yapıştırıcı kullanarak, dokuyu numune plakasının merkezine sabitleyin ve plakayı PBS dolgulu kesit odasına daldırın. Seksiyon bıçağını vibratomun üzerine yükleyin. Sırasıyla aşağıdaki hız, genlik ve kalınlık değerlerini seçerek vibratom üzerindeki kesit sınırlarını ayarlayın. Her lobu tamamen bölümlere ayırın ve bölümler birbirinden tamamen ayrılmazsa, bölümleri manuel olarak kesmek için küçük makas kullanın. Ardından, iskele bölümlerini nazikçe toplayın ve soğuk PBS'ye aktarın. Forseps kullanarak, her bir bölümü çevreleyen agarozdan nazikçe serbest bırakın. İskele bölümlerini dekontamine etmek için, bunları PBS'den mikrosantrifüj tüplerine aktardıktan sonra, PBS'de mililitre nükleaz başına 90 birim ekleyin ve oda sıcaklığında 12 ila 24 saat boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Bölümleri yeni mikrosantrifüj tüplerine aktardıktan sonra, metin protokolüne göre, steril koşullar altında antimikrobiyal çözelti ekleyin ve altı saat boyunca oda sıcaklığında bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Daha sonra steril koşullar altında, iskeleleri iki kez durulamak için PBS kullanın ve hücrelerle tohumlamadan önce bunları serum içermeyen ortama veya SFDM'ye aktarın. Bir hava sıvı arayüz kültürü oluşturmak için, hidrofobik membranları bir petri kabına yerleştirmek için steril forseps kullanın. Ardından, hücrelerden arındırılmış her bir iskele bölümünü SFDM'den bir membran üzerine aktarın ve bölümlerin membran üzerine eşit şekilde yayılmasını sağlayın. Kuyucukları sırasıyla 1 ml veya 0.5 ml SFDM ile doldurarak altı veya on iki kuyulu plaka hazırlayın. Ardından, membranları nazikçe kuyucuklara yerleştirin ve membranın ortamın üzerinde yüzmesine izin vererek bir hava sıvı kültürü kurulumu oluşturun. Kesin bir endoderm için zenginleştirmek üzere endodermal hücrelerin hazırlanmasını ve floresanla aktive edilen hücre sıralamasını takiben 3D iskeleleri tohumlamak için, sıralanan hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın. Daha sonra hücreleri beş dakika boyunca 400 Gs'de döndürün. SFDM kullanarak, peletlenmiş hücreleri 10'da yaklaşık 100.000 hücreye yeniden askıya alın