Name: Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Öğrenin fare embriyonik kök hücrelerinden havayolu epitel hücreleri üretmeyi, deküllürize akciğer iskeleleri ve 3D kültür kullanarak. Bu yöntem akciğer gelişimi ve doku mühendisliği araştırmaları için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Şekiller 1-3&#39;te gösterilen deneylerde kullanılan Nkx2-1 MCherry ESC Dr. Rossant ve Dr Bilodeau teşekkür etmek istiyorum. FACS SickKids-UHN Sitometrisi Tesisinde uygulandı. Bu çalışma Sağlık Araştırma Kanada Enstitüsü ve Yenilik Kanada Vakfı bir altyapı hibe (CSCCD) hibe işletim tarafından desteklenmiştir.

Hayvan deneyleri Sick Children Araştırma Enstitüsü Hastanesi Hayvan Bakım Komitesi talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. İskele Hazırlık <ol><li> akciğer Decellularization <ol><li> CO 2 odasının kullanılarak yetişkin Wistar sıçan Euthanize. Odasında hayvan koyun ve dakikada odası hacminin% 10-30 bir dolgu hızında% 100 CO 2 pozlama başlar. <ol><li> bilinçsizlik için hayvan gözlemlemek; Bu yaklaşık 2-3 dakika sonra ortaya çıkar. bilinçsizlik Bu süre içinde oluşmazsa, hızı ve oda mühür doldurmak kontrol edin. bilinçsizlik ardından, soluk göz rengi ve solunum olmaması için hayvan gözlemleyin. Her iki gözlenmesi halinde, 1-2 dakika boyunca CO2 doldurma korumak ve daha sonra prosedür için odasından gelen hayvan çıkarın. </li></ol></li><li> forepaws ve arka ayakları sabitleyerek yüzey diseksiyon hayvan Güvenli ve% 70 etanol ile göğüs ve karın bölgeyi sprey. kalp ve lu girişsternum boyunca dikey bir kesi kullanılarak göğüs boşluğu açılarak NGS. </li><li> diyafram üzerinden küçük kesiler yapmak ilk akciğerleri delinmesiyle şansını azaltmak, akciğerler geri çekmek için neden. Bir dikiş ile inferior vena kava bağlanır ve küçük diseksiyon makas ile sol atrium küçük bir kesi yerleştirin. </li><li> Heparinize Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) (HBSS, 10 U / ml heparin) ile dolu bir 25 G iğne ile hazırlanmış bir 10 ml şırınga kullanarak, akciğer dolaşımı sayesinde tampon itmek için sağ ventrikül içine iğne sokarak akciğer perfüzyon başlatmak (2 ml / dakika oranı). Akciğerler beyaz çevirmek ve sol atrium akan sıvı berrak bitene kadar bu işleme devam edin. </li><li> perfüzyon ardından, tiroid kıkırdak yakın plastik bir kateter ile trakea ve cannulate ortaya çıkarmak ve bir dikişle yerine sabitleyin. </li><li> Kur bir imbik standı ve kelepçe bir 10 ml şırınga sabitleyerek bir yerçekimi perfüzyon sistemi. Kaldır discard şırınga pistonu. akciğerler üzerinde 20 cm şırınga varil üzerinde maksimum doldurma noktasını sabitleyin. şırınga sonuna ve kanüle trakeaya decellularization çözümü sunmak için vana diğer ucuna uzun bir plastik boru için iki yönlü stopcock takın. şırıngaya çözüm dökün ve çözüm ekli plastik boru ve kateter doldurmak için izin verir. <ol><li> 1 dakika boyunca total akciğer kapasitesi (yaklaşık 12 ml) doldurarak akciğerleri lavaj ve sıvı akciğerlerin dışarı akmasına izin vermek için trakea plastik kateter çıkarın. H 2 O 20 cm altına basınç tutmak için akciğerlere lavaging şırınga fazla 10 ml doldurmayın </li></ol></li><li> fosfat tamponlu tuz (PBS) ile 10 kez batırıldıktan ardından sekiz kez decellularization çözeltisi ile akciğerlerin tekrar lavajı. </li><li> boyun ve göğüs boşluğundan serbest trakea ve akciğerler incelemek ve hayvan kaldırmak. vibratome se hazırlık kadar 4 ° C &#39;de soğuk PBS doku tutunctioning. </li></ol></li><li> Kalın bölüm nesil <ol><li> % 2 yaklaşık 15 ml (ağırlık / hacim) agaroz% 4 ve% 6 kadar küçük dikdörtgen bloklar halinde, tüm lobu yerleştirmek için (ağırlık / hacim) agaroz hazırlayın. mikrodalga PBS içinde düşük erime noktalı agaroz toz eritilir. Bir ısı bloğu 50 ml tüpler agaroz aktarın ve jelleşmenin önüne geçmek üzere 40 ° C &#39;nin üzerindeki sıcaklığı muhafaza. </li><li> Küçük bir makas kullanarak her lob (kranial, orta, aksesuar ve kuyruk sağa loblar ve sol lob) ayırmak için her lober bronş sonunda decellularized akciğer teşrih. Pat aşırı PBS kaldırmak ve% 2 içine yerleştirmek için emici yaprak kullanarak her lob kurutun (w / v) agaroz ısıtma bloğu üzerinde iken. </li><li> Petri kabı yerleştirmek, agaroz içinde kaplamanın 5 dakika sonra her bir lob kaldırma ve yüzey soğuk plaka üzerinde 1 dakika boyunca jel sağlar. </li><li> Yavaşça 5 dakika sonra, tekrar% 4 (ağırlık / hacim) agaroz serin lobları yerleştirin ve% 6 (ağırlık / hacim) agaroz ile bir kez daha kaplama tekrarlayın. </li><li> ardışık co sonraHer lob ating, kenarlarından çevreleyen doku agaroz en az 3 mm olan metal taban kalıplar kullanılarak% 6 (ağırlık / hacim) agaroz ayrı her lobun yerleştirin. Orient her lob deneyci bakan metal kalıbın yüzeyinde lobunun en büyük yassı kenarını konumlandırarak forseps kullanarak. Bu kenar vibratome kesit için numune plakasına sabitlenmiş taraf olacaktır. </li><li> blok önceden vibratome ile kesit için en az 30 dakika süreyle soğuk plaka üzerinde jel izin verin. 4 ° C&#39;de en çok 12 saat boyunca nemlendirilmiş bir odada saklayın blok önce kesit vibratome. </li><li> Kur soğuk PBS 12 ile kesit odasını doldurarak vibratome. Çevre buz banyosu ile kesit boyunca soğuk sıcaklık korumak. metal kalıplar blokları kaldırmak ve doku kenarından yaklaşık 3 mm tutarken, lobu çevreleyen aşırı agaroz aşağı trim bir jilet kullanın. </li><li> yapıştırıcı kullanılarak numune plakasının merkezine doku düzeltmek ve t içine plaka daldırınO kesit odasını PBS dolu. 0,2 mm / sn, 1.85 mm ve 350 um: sırasıyla aşağıdaki hız, genlik ve kalınlık değerleri seçerek vibratome sınırlarını kesit Kur. Not: lob yönlendirme uzunlamasına ve enine iki kısmı, kabul edilebilir. </li><li> Bölüm her lob tamamen. Bir bölüm tam bölüm dizisinin sonunda bıçak ile ayrılmış değilse elle kesilmiş bölümleri küçük makas kullanarak ücretsiz. nazikçe iskele bölümleri toplayın ve bir sonraki adıma kadar buz üzerinde PBS tutmak. Not: Oluşturulan Bölümler proksimal ve distal akciğer alanlarına ve recellularization için kullanılabilir her iki kaynaktan içerecektir; Bununla birlikte, yüzeyin en uzak akciğer içerecektir. </li></ol></li><li> skafold bölümlerinin atım <ol><li> mikrosantrifüj tüpler (30 bölüm / tüp) PBS 350 mikron kalınlığında iskele bölümleri aktarın ve nükleaz ile tedavi (PBS içinde 90 U / ml) (Malzeme listesi bakınız) 12 - üzerinde oda sıcaklığında 24 saat,Bir rotator. </li><li> nükleaz işlemin ardından, yeni bir mikrosantrifüj tüplerine forseps kullanılarak bir döndürücünün üzerine, oda sıcaklığında 6 saat süre ile, steril koşullar altında (PBS içinde 200 U / ml penisilin streptomisin ve 25 ug / ml amfoterisin B), antimikrobiyal çözeltisi ile muamele transferi bölümlerinden oluşmaktadır. Not: iskeleleri, kullanımdan önce bir hafta kadar 4 ° C antimikrobiyal çözelti içinde saklanabilir. </li><li> antimikrobiyal çözeltisi ile arındırma adımından sonra steril şartlar altında iki kez PBS ile yıkayın iskeleleri ve hücreler ile tohumlanmasından önce serbest farklılaşma ortamı (SFDM) serum aktarın. </li></ol></li></ol> 2. Endodermal Hücre Hazırlama <ol><li> Kesin Endoderm İndüksiyon <ol><li> 2i koşullar 13 kullanılarak besleyici içermeyen, serum serbest kültürü altında fare ESC hatları korumak. Trypsinization tarafından yapışık pluripotent kültüründen hücreleri kaldırarak endoderm indüksiyon başlayın. </li><li> 20,000 bir yoğunlukta SFDM tohum hücrelerin yeniden süspanseOrtam değişikliği olmadan hücreler üç gün boyunca, düşük yapışkan tabaklar / ml EB oluşumuna imkan vermek için. </li><li> Üç gün yavaşça, 10 ml bir pipet kullanarak 50 ml konik tüp EBS aktarmak ve onları oda sıcaklığında 3 dakika boyunca alt almasına izin sonra. </li><li> Dikkatlice aspire medya ve eklemek taze SFDM medya 50 ng / ml aktivin A ile desteklenmiş </li><li> geri 1 düşük yapışık plakalar üzerine Tohum hücreleri üç gün daha 2 yoğunluğu ve kültür kesin endoderm farklılaşma elde etmek. </li></ol></li><li> Kesin Endoderm zenginleştirme <ol><li> Gün 6 EBS toplamak tripsin ile ayırmak ve konjuge floresan antikorlar 14 kullanılarak c-KIT ve CXCR4 ifade etiket. </li><li> Her ikisinin de işaretleyicilerin ekspresyonu için floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) kullanılarak Sıralama etiketli hücreler zenginleştirilmiş bir nihai endoderm popülasyonu 15 elde edildi. </li></ol></li></ol> 3. Recellularization Kurulumu <ol><li> Hava-sıvı arayüzükültür kurulumu <ol><li> Steril forseps kullanarak bir hidrofobik yüzen membran (8 mikron gözenek boyutu) üzerine SFDM her decellularized iskele bölümü (adım 1.2.9) aktarın. iskele sağlamak bölümler zar üzerinde eşit yayılır. </li><li> sırasıyla SFDM 1 ya da 0.5 ml ile kuyu doldurarak 6 veya 12 oyuklu plakalar hazırlamak. Yavaşça bir hava-sıvı kültür kurulum oluşturma, zar medyanın üstünde yüzen sağlayan kuyu içine membranlar yerleştirin. </li></ol></li><li> 3D iskelelerinin tohumlama <ol><li> Kesin endoderm belirteçleri (adım 2.2.2) için aşağıdaki FACS, hemasitometre kullanarak sıralanmış hücreleri saymak SFDM 5 dakika ve tekrar süspansiyon için 400 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. Yaklaşık olarak 100,000 hücre / 10 ul / iskelet ihtiva eden bir birim elde etmek için tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> doğrudan adım 3.1.2 her hazırlanmış bölümü üzerine pipet, hücrelerin 10 ul iskelesi recellularize için. </li><li> kültürlerinde, her 48 saat SFDM ortamı değiştirin. hafif bir eğim de plaka tutarak eski medya aspirekültür bozmamak için. Yavaş yavaş dalgalı membran batan önlemek için oyuk kenarı boyunca kültüre taze SFDM ekleyin. </li><li> olgun havayolu epitel numaralı seribaşı hücrelerin farklılaşmasını sağlamak kadar 21 gün boyunca hava-sıvı kültürleri korumak. Not: Recellularized bölümler hücre kültürü 16 boyunca herhangi bir zaman noktasında, doku boyama ve imünoflöresan (IF) mikroskopi için işlenebilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+Factors%2C+Matrices%2C+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li>
<li>Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+dynamics+in+development+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine.</a> J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).</li>
<li>Ghaedi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+alveolar+epithelium+repopulates+lung+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix.</a> J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).</li>
<li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Jensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+lung+de-cellularization+protocol+supports+embryonic+stem+cell+differentiation+in+vitro+and+following+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation.</a> Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).</li>
<li>Longmire, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+purified+lung+and+thyroid+progenitors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li>
<li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mature+airway+epithelia+expressing+functional+CFTR+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein.</a> Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).</li>
<li>Gilpin, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Lung+Epithelial+Specification+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+on+Decellularized+Lung+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Annal.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix.</a> Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Acellular+Natural+Lung+Matrix+on+Murine+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation+and+Tissue+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).</li>
<li>Princivalle, M., De Agostini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+roles+of+heparan+sulfate+proteoglycans%3A+a+comparative+review+in+Drosophila%2C+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human.</a> Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).</li>
<li>Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+in+lung+morphogenesis%3A+The+elephant+in+the+room%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+Part+C%2C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room.</a> Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).</li>
<li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li>
<li>Ying, Q. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Fox, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Culture+and+FGF+Signaling+Drive+Differentiation+of+Murine+Pluripotent+Cells+to+Distal+Lung+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells.</a> Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Shojaie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+lung+scaffolds+direct+differentiation+of+endoderm+to+functional+airway+epithelial+cells%3A+requirement+of+matrix-bound+HS+proteoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans.</a> Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).</li>
<li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).</li>
<li>Longmire, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Derivation+of+Purified+Lung+and+Thyroid+Progenitors+from+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li>
<li>Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+mouse+embryo+atlas+based+on+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT.</a> Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).</li>
</ol>

beyan için hiçbir rakip mali çıkarları vardır.

Burada açıklanan protokol başka hiçbir takviyesi ile farklılaşmayı doğrudan sadece doğal akciğer iskeleleri kullanarak olgun ESC türetilmiş havayolu epitel üretir. Bu kültür, kurulum, serumsuz, pahalı olmayan ve tekrarlanabilir tanımlanır. Baz farklılaşma medya yok büyüme faktörü takviyesi gereklidir. Kök hücre kökenli akciğer epitel hücreleri üretmek için daha önce yayınlanmış yöntemler soy kısıtlama 3,4,8,18,19 teşvik etmek büyüme faktörü takviyesi ile 2 boyutlu stratejiler kullanmışlardır. tanımlı kültür k...

Akciğer soy pluripotent hücrelerin Yönetmen farklılaşma mikro-1,2 hassas sinyal olayları bağlıdır. Bu nedenle sürecin dinamik doğası in vitro akciğer organogenez kesin olayları taklit etmek zor olmuştur. Son raporlar akciğer farklılaşma 3-8 ulaşmak için iki boyutlu kültürlerin çözünür büyüme faktörü takviyesi ile adım adım soy kısıtlama stratejilerini kullanmışlardır. adım adım farklılaşma protokollerde, pluripotent hücreler, embriyonik kök hücreleri (ESC) veya uyarılmış pluripotent kök hücreler olup, ilk kesin endoderm germ tabakasına ayırt edildi. homeodomen içeren transkripsiyon faktörü NKX2-1 ifadesi ile tanımlanan endodermal hücreler daha sonra, akciğer progenitör hücrelere daha sonra bir ön endoderm kaderine itti ve bulundu. Bu akciğer atalarıdır daha proksimal (havayolu) veya uzak (alveolar) akciğer epitel hücrelerinin wi için ayırt edildiinci büyüme faktörü takviyesi devam etti. Böyle 2 boyutlu stratejiler akciğer epitel hücreleri üreten bazı başarı vardı, ancak orada belirsiz verimlilik, diğer Endodermal soy mümkün kirlenme, 3 boyutlu (3D) yapı eksikliği gibi çeşitli sınırlamalar vardır ve bazı durumlarda tanımlanmamış kültürlerin kullanımı serum takviyesi ile. Hücresizleştirilmiş akciğer iskeleler üzerine pluripotent veya farklılaşmış hücrelerin kültürü artan akciğer epitelyal yapılar 3,5,6,8,9 oluşturan Serpilen hücreleri, rejeneratif potansiyelini değerlendirmek için bir tahlil olarak kullanılır. Bu tür raporlar kültür sürekli büyüme faktörü veya serum takviyesi ile İskele üzerinde hücreleri ekildi. Akciğer gelişimi çevresel işaretlere yanıt olarak bölünmesi, göç, gen ekspresyonu ve tek tek hücrelerin farklılaşmasını içermektedir. hücre dışı matrisi (ECM) yapısal destek sağlamanın yanı sıra, tissu yönlendiren glikoproteinlerin bir kafes olanentegre ve bu süreçleri 10,11 düzenleyerek e morfolojilerinden. Daha iyi in vivo akciğer gelişim ortamını taklit etmek endoderm kültürü için doğal bir platform olarak akciğer ECM iskele kullanarak, yüksek verimlilik ve tekrarlanabilirlik ile ayar tanımlanmış 3D-kültürde hücre kökenli havayolu epitel hücrelerini kök yarattı. Fare, akciğer ECM iskeleleri oluşturulan Decellularization hem de fare ESC türetilmiş endodermal hücreler tarafından üretilen ve daha sonra, bu iskeleler üzerine ekilmiştir. CXCR4 ve c-KIT proteinlerinin Çift ifade havayolu (proksimal akciğer) progenitör hücreler olarak tanımlanır Sox2 &amp; NKX2-1 ifade hem pozitif kesin bir endoderm hücre kimliğini ve hücreleri gösterir. Kesin endoderm hücreleri in vitro fonksiyonel hava yolu epitel hücreleri üretmek için üç hafta kadar hava sıvı arayüzü (ALI) de kültüre edildi. Bu protokol tanımdan akciğer soy farklılaşmasını teşvikgibi erken NKX2-1 + / Sox2 + erken proksimal akciğer ataları ortaya çıkması ile gözlenen 7 gün olarak tive endoderm. 14. günde ve kirpikli de ortaya kültür olgun hava yolu epitel hücre popülasyonlarının 21 (TUBB4A +), kulüp (SCGB1A1 +) ve bazal (TRP63 + KRT5 +) yerel fare solunum yollarında morfolojik ve fonksiyonel benzerlik ile hücreleri tarafından. Bu protokol epitel hücreleri hava yolu sağlam farklılaşma elde etmek için 3D-matris mikroçevresinin önemini ortaya koymaktadır.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Perfüzyon çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>H0777</td><td>10 U / ml heparin</td></tr><tr><td>Perfüzyon çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td>Hank'in dengeli tuz çözeltisinde çözülür (HBSS-)</td></tr> <tr><td>Hücre Giderme çözeltisi</td><td>BioShop</td><td>CHA003</td><td>8&nbsp; mM CHAPS</td></tr><tr><td>Hücre Giderme çözümü</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td>25&nbsp; mM EDTA</td></tr><tr><td>Hücre Hücreden Arındırma çözümü</td><td>BioShop</td><td>SOD002</td><td>1&nbsp; M NaCl</td></tr><tr><td>Decellularization solüsyonu</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td>, <td>PBS</td></tr><tr><td>Benzonaz nükleaz</td><td>Novagen</td><td>70664-3</td><td>90&nbsp içinde çözülmüş; U/ml Benzonaz nükleaz&nbsp;</td></tr>PBS Antimikrobiyal <tr><td>çözeltisinde seyreltilmiş</td> <td>benzonaz nükleaz</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>200&nbsp; U/ml penisilin streptomisin</td></tr><tr><td>Antimikrobiyal solüsyon&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15290</td><td>25&nbsp; &mu; g/ml amfoterisin B</td></tr><tr><td>Antimikrobiyal solüsyon&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Tripsinizasyonunda seyreltilmiş&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>TrypLE</td></tr><tr><td>Serum içermeyen farklılaşma ortamı (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>IMDM 2440-053, F12 11765-054</td><td>3: 1 IMDM ve Jambon oranı s modifiye F12 ortamı</td></tr><tr><td>Serum serbest diferansiyasyon ortamı (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>B27 takviyesi (50x seyreltme)</td></tr><tr><td>Serum içermeyen farklılaşma ortamı (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>N2 takviyesi (100x seyreltme)</td></tr><tr><td>Serum serbest diferansiyasyon ortamı (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>%0.05 (Fraksiyon V) sığır serum albümini</td></tr><tr><td>Serum serbest diferansiyasyon ortamı (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>200&nbsp; mM Glutamax</td></tr><tr><td>Serum serbest diferansiyasyon ortamı (SFDM)</td> <td>Sigma</td><td>M6145</td><td>4&nbsp; &mu; M monotiogliserol</td></tr><tr><td>Serum serbest diferansiyasyon ortamı (SFDM)</td> <td>Sigma</td><td>A4403&nbsp;</td><td>0.05&nbsp; mg / ml askobik asit</td></tr><tr><td>Endoderm indüksiyon</td><td>R& D</td><td>338-AC / CF</td><td>Aktivin A</td></tr><tr><td><güçlü > Antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>Fare, konjuge olmayan, 1:100</td></tr><tr><td>C-KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>558163</td><td>Sıçan, PE-CY7, 1:100</td></tr><tr><td>CXCR4</td><td>BD Biosciences</td><td>558644</td><td>Sıçan, APC, 1:100</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab24647</td><td>Tavşan, konjuge olmayan, 1:1.000</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>Tavşan, konjuge olmayan, 1:200</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-144</td><td>Tavşan, konjuge olmayan, 1:200</td></tr><tr><td>SCGB1A1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9772&nbsp;</td><td>Keçi, eşleniksiz, 1:1.000</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>AF2018&nbsp;</td><td>Keçi, eşleniksiz, 1:400</td></tr><tr><td>TRP63</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8431</td><td>Fare, konjuge olmayan, 1:200</td></tr><tr><td>TUBB4A</td><td>BioGenex</td><td>MU178-UC</td><td>Fare, konjuge olmayan, 1:500</td></tr><tr><td>Keçi IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>Eşek, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Fare IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>Eşek, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Fare IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Eşek, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td>Tavşan IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Eşek, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Tavşan IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31573</td><td>Eşek, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td><güçlü>Diğer Malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düşük yapışan plakalar</td><td>Nunc</td><td>Z721050&nbsp;</td><td>Düşük hücreli bağlama plakaları,&nbsp; 6 kuyu&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Hava-sıvı arayüz membranları&nbsp;</td><td>Whatman</td><td></td><td>110614 Hidrofobik Nükleopore zarı, 8&nbsp; &mu; m gözenek boyutu</td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica</td><td>VT1200S&nbsp;</td><td>Leica Vibratom</td></tr><tr><td>Doku Yapıştırıcısı</td><td>Ted Pella</td><td>10033</td><td>Pelco doku yapıştırıcısı</td></tr></tbody></table>

decellularized akciğer yapı iskeleleri kullanarak esc türetilmiş fare havayolu epitel hücreleri Üretimi

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Akciğer soy farklılaşma büyüme faktörü sinyalizasyon, hücre-hücre etkileşimleri ve hücre-matriks etkileşimleri içeren karmaşık çevresel ipuçları entegrasyonunu gerektirir. Bu nedenle karmaşıklığı nedeniyle, in vitro olarak akciğer gelişiminin tekrarlama zorlu olan akciğer epitelyal hücrelerine kök hücrelerin farklılaşmasını teşvik etmek. Bu protokol, hücresizleştirilmiş akciğer iskeleleri kök hücre türevli yolu epitel hücreleri akciğer, 3 boyutlu bir ortam taklit eden ve üretmek için kullanılır. Fare embriyonik kök hücre ilk önce decellularized iskelelerinin üzerine ekilir aktivin A Endoderm hücreleri ile bir embriyoid gövde (EB) kültür yöntemi kullanılarak endoderm soyuna farklılaşmış ve en fazla 21 gün süreyle hava-sıvı arayüzü kültüre edilir. Bu teknik, ek büyüme faktörü takviyesi olmadan fonksiyonel hava yolu epitel hücrelerine seribaşı hücreler (kirpikli hücreler, kulüp hücreleri ve bazal hücreler) farklılaşmasını teşvik eder. Bu kültür kurulum tanımlanır, serum-ücretsiz, ucuz ve tekrarlanabilir. Sınırlı kirlenme kültüründe olmayan akciğer endoderm soydan gelen olmamasına rağmen, bu protokol sadece hava yolu epitel popülasyonları üretir ve alveol epitel hücrelerinin neden vermez. Bu protokol ile oluşan hava yolu epitelial akciğer organojenez esnasında ve hastalık modelleme ya da sistik fibroz gibi hava yolu ilgili patolojilerin ilaç keşfi platformları için hücre-matris etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir.

Bu protokolde belirtildiği gibi, kesin endoderm sağlam farklılaşma epitel hücreleri decellularized akciğer iskele bölümleri numaralı seribaşı hücrelerin uzun kültürünü kullanılarak elde edilebilir havayolunu olgun. Decellularized iskeleleri (1) konak hücreler tamamen çıkarıldığından emin olmak için karakterize, ve (2) hücre dışı matriks proteinleri farklılaşması için iskeleler kullanmadan önce korunmuş tavsiye edilir. Şekil 1A &#39;de gösterildiği gibi Decellularization,...

Bu protokol verimli hava yolu epitel hücreleri olgun fare embriyonik kök hücre kaynaklı kesin endoderm yönlendirir. Bu farklılaşma tekniği tanımlanmış bir serum içermeyen kültür ortamında, akciğer soy özellikleri doğrudan 3 boyutlu hücresizleştirilmiş akciğer iskeleleri kullanır.

Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Bu prosedürün genel amacı, deselülerize akciğer iskeleleri ile oluşturulmuş bir 3B kültür düzeneği kullanarak, fare embriyonik kök hücrelerinin olgun havayolu epitelyal hücrelerine farklılaşmasını yönlendirmektir. Bu yöntem, akciğer soy hattı farklılaşması sırasında hücre matris kontraksiyonlarının ve büyüme faktörü sinyallerinin rolü gibi akciğer gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tanımlanmış serumsuz bir ortamda 3B kültür sistemi kullanması ve diğer endoderm soy hatlarından gelen kontaminasyonu sınırlı tutarak güçlü bir havayolu epitelyal farklılaşması sağlamasıdır.Yetişkin bir Wistar sıçanını metin protokolüne göre ötenazi yaptıktan sonra, ön patileri ve arka bacakları sabitleyerek hayvanı bir diseksiyon yüzeyine yerleştirin ve göğüs ile karın bölgesine %70 ethanol püskürtün.Kaburga kafesinin hemen altına bir insizyon yapın.Deriyi kesin ve diyaframı açığa çıkarın.Ardından, akciğerlerin geri çekilmesini sağlayarak akciğerlerin delinme riskini azaltmak için diyafram boyunca küçük insizyonlar yapın.Daha sonra, sternum boyunca dikey bir insizyon oluşturun ve kalp ile akciğerlere erişmek için torasik boşluğu açın.Ardından

generation-esc-derived-mouse-airway-epithelial-cells-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz bir decellularized akciğer ekstraselüler matriks ve fonksiyonel akciğer dokusu oluşturmak için kullanılan olabilir romanı biomimetic biyoreaktör geliştirdik. Biyoreaktör matris ve kültür hücreleri ekim, kısa bir süre için in vivo olarak nakledilen zaman etkili gaz değişimi gösteren doku oluşturur.

Akciğer Mühendisliği Prosedürü

Bu videoda, doku mühendisliği uygulamaları için biyokimyasal mimarisi ve bileşimi korunmuş, hücresinden arındırılmış bir domuz özofagusu iskelesinin hazırlanışını gösteriyoruz.

Hücreden Arındırılmış Domuz Özofagus İskelesi Hazırlığı: Domuz Yemek Borusundan Aselüler İskele Oluşturma Tekniği

Tüm organ hücresizleştirme, rejeneratif tıp için kullanılabilecek doğal biyolojik iskeleler üretir. Tüm akciğerlerin hücrelerden arındırıldığı ve daha sonra vasküler dolaşımı ve sıvı ortam ventilasyonunu kolaylaştıran bir biyoreaktörde yetişkin kök hücreler ve endotel hücreleri ile tohumlandığı insan dışı bir primat akciğer rejenerasyonu modelinin tanımı sunulmaktadır.

Özel Bir Büyük Organ Biyoreaktörü Kullanılarak İnsan Dışı Primat Akciğerinin Hücreden Arındırılması ve Yeniden Hücreselleştirilmesi

Bu protokol farelerin kalbini ve akciğerlerini hücreden çıkarmayı amaçlamaktadır. Elde edilen hücre dışı matris (ECM) iskeleleri, bileşenlerinin konumunu ve topolojisini haritalamak için immünostain edilebilir ve görüntülenebilir.

Murine Kardiyopulmoner Kompleksinin Hücreden Arındırılması

Bu protokol, desellülarize hassas kesilmiş akciğer dilimlerini alveoler epitel tip 2 hücreleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri ile yeniden doldurarak tekrarlanabilir, küçük ölçekli mühendislik ürünü akciğer dokuları oluşturmak için bir yöntemi açıklar.

Desellülerize Akciğer Dilimlerinden Hazırlanan Mühendislik Akciğer Dokuları

Protokol, endojen epitelin sıçan trakeasından seçici olarak çıkarılmasına ve lümen yüzeyindeki eksojen hücrelerin homojen dağılımına izin veren, ardından hücre dokusu yapısının uzun süreli in vitro kültürüne izin veren görüntüleme özellikli bir biyoreaktörü tanımlar.

Biyomühendislik hava yolu dokusu üretmek için görüntüleme kılavuzlu biyoreaktör

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre farklılaşma protokollerindeki son gelişmeler, organa özgü hücre tiplerinin kademeli olarak türetilmesine izin vermektedir. Burada, iPSC türevi hava yolu bazal hücrelerinin bakımı ve genişlemesi ve hava-sıvı arayüz kültürlerinde mukosiliyer bir epitel halinde farklılaşması için ayrıntılı adımlar sunuyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Hava Yolu Epitel Hücresi Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Burada bölgesel desellülarize akciğer dokusunun izolasyonu için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, hücre dışı matris ve hücre-matris etkileşimlerindeki karmaşıklıkları incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Bölgeye Özgü Desellülarize Akciğer Dokusunun Diseksiyonu ve İzolasyonu

Bu makale, bir hava-sıvı arayüz kültüründe indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi akciğer epiteli, mezenşim, endotel hücreleri ve makrofajlardan oluşan karmaşık, çok hücreli bir hava yolu bariyer modelinin oluşturulmasını açıklamaktadır.

Akciğer Sağlığı ve Hastalığında Hava Yolu Bariyeri Bütünlüğünü Modellemek için iPSC'den Türetilmiş Epitelyal, Mezenkimal ve İmmün Hücre Ko-Kültürü

Bu makale, hücreden arındırma ve yeniden hücreselleştirme yöntemleri kullanılarak biyomühendislik ürünü fare akciğerlerinin nasıl oluşturulacağını açıklamaktadır. Ayrıca sonraki ortotopik akciğer naklini de detaylandırır.

Hücreden Arındırılmış Fare Akciğerleri ve Primer İnsan Endotel Hücreleri Kullanılarak Biyomühendislik Ürünü Akciğerin Transplantasyonu

Öğrenin fare embriyonik kök hücrelerinden havayolu epitel hücreleri üretmeyi, deküllürize akciğer iskeleleri ve 3D kültür kullanarak. Bu yöntem akciğer gelişimi ve doku mühendisliği araştırmaları için güvenilir bir protokol sunar.

Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi

Daha fazla video keşfet