Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Bu prosedürün genel amacı, yeni diseke edilmiş beyin dilimlerinde tam hücre yama-klemp kayıtlarının nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktır. Bu yöntem, deneysel kontrol manipülasyonlarının belirli beyin bölgelerindeki belirli nöronların aktivitesini nasıl değiştirdiği gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, sağlam uyanık hayvanlarda gelişen nöron fonksiyonlarında uzun süreli değişiklikler olan bir X vivo preparatını tanımlamak için ortam sağlamasıdır.

Bu yöntem beyin dilimlerindeki nöronal işlevler hakkında bilgi sağlayabilse de, kültürdeki hücreler ve in vivo nöronlar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir öğrenci olan Francisco Garcia-Oscos olacak. Bu işleme başlamak için, plastik uçlu plastik bir transfer pipeti kullanarak, kurtarma odasından yavaşça bir beyin dilimi çekin.

Transfer pipetini kayıt haznesine yerleştirin ve pipetten çıkan dilimi haznenin altındaki kapak kayma astarına nazikçe sıkın. Ardından, mikroskop 4x objektifini kullanarak, dilimi, istenen alan tam olarak kayıt odasının ortasına yerleştirilecek şekilde konumlandırın. İstenilen pozisyon elde edildikten sonra, arp olarak da bilinen dilim tutma ile beyin dilimi pozisyonunu sabitleyin.

Bundan sonra, 40x objektife geçin ve lensi, haznedeki ACSF ile temas edene kadar yavaşça indirin. Ardından, dokuyu odaklamak için ince ayar çarkını kullanın. Odak doku düzeyinde olduğunda, hedeflenen bölgedeki hücreleri gözlemleyin.

Şimdi, bir hedef hücre arayın. Kayıt mikropipetini yönlendirmeye yardımcı olması için bilgisayar ekranında işaretleyin. Kayıt mikropipetinin yerleştirilmesi için yeterli alan sağlamak üzere objektif lensi kaldırın.

Bu adımda, bir mililitrelik bir şırınga, metalik olmayan bir mikroşırınga iğnesi ve özel bir filtre kullanarak, bir mikropipeti önceden hazırlanmış dahili solüsyonla doldurun. Mikropipette hava kabarcığı olmadığından emin olun. Ardından mikropipeti bir elektrot tutucusuna yerleştirin, böylece çözelti gümüş klorür kaplı tel elektrotla temas eder.

Pipet kapağını, koni rondelası mikropipetin etrafında bir conta oluşturacak şekilde sıkın. Ardından, pisliklerin girmesini önlemek için mikropipeti ACSF'ye daldırmadan önce pipet tutucusuna bağlı hava dolu şırınga ile pozitif basınç uygulayın. Mikro manipülatörü kullanarak, pipeti kabaca daldırılan objektifin merkezinin altında olacak şekilde hazneye doğru yönlendirin.

Mikropipeti mikro manipülatör ile orta ila yüksek hızda hareket ettirirken, mikropipeti bilgisayar ekranında bulun ve mikropipeti XY eksenindeki hücrenin konumuna doğru yönlendirin. Bu arada, bir voltaj adımı uygulayarak mikropipet direncini ölçün. Mikropipeti tıkayan hava kabarcıklarını veya diğer yabancı cisimleri çıkarmak için pozitif basınç uygulayın.

Mikropipeti temizledikten sonra, pipet akımını sıfıra indirmek için bir voltaj ofseti gerçekleştirin. Mikroskobun ince odak tekerleğini kullanarak, mikropipeti kademeli olarak indirirken aşağı odaklamaya başlayın. Her zaman önce aşağıya odaklanın ve ardından mikropipet ucunun dilime aniden nüfuz etmemesini sağlamak için mikropipeti odak düzlemine indirin.

Mikropipet dilimin yüzeyi ile temas ettiğinde, mikro manipülatör hızını orta düşük moda yavaşlatın. Yoldaki kalıntıları temizlemek için hafifçe hafif pozitif basınç uygulayın. Ardından, XYZ kontrol düğmeleri ile dönüşümlü olarak veya Z ekseni düğmesinin döndürülmesiyle her iki XZ ekseninin değiştirildiği çapraz olarak yaklaşarak hücreye yaklaşın.

Mikropipet hücreye yeterince yakın olduğunda, hücre yüzeyinde bir çukur belirecektir. Şimdi bir sızdırmazlık oluşturmak için pipet tutucu emme borusuna bağlı olan borudan zayıf ve kısa bir emme uygulayın. Bir giga-mühür oluşurken, zar yırtıldıktan sonra ani değişiklikleri önlemek için potansiyel tutan hücreleri fizyolojik dinlenme potansiyeline getirmek için bilgisayar kontrollü amplifikatör kumandasını kullanın.

Giga-seal oluştuktan sonra, hızlı veya yavaş kapasitonları telafi edin. Burada uygulanan emişin çok güçlü olmaması çok önemlidir. Aksi takdirde, conta oluşturulmadan önce zar yırtılabilir.

Conta sabit kalırsa ve bir gigaomun üzerindeyse, plazma zarını yırtmak için kısa ve güçlü bir emme uygulayın. Emme, bir sızdırmazlık oluştururken uygulanan basınçtan kısa ve daha güçlü olmalıdır. Membranı düzgün bir şekilde yırtmak ve stabil bir tam hücre konfigürasyonu elde etmek için.

Membran testinde hücre moduna geçerek, giriş direnci, seri direnç ve membran kapasitonları gibi hücrenin farklı parametrelerini görüntüleyin. Tüm hücre konfigürasyonunu elde ettikten sonra, kayıt sırasında bu parametreleri izlemeye devam edin. Burada gösterilen, tek bir çekirdek accumbens kabuğu MSN'den uyarılmış EPSC eğiminin bir örneğidir.

Sıcaklığın 24 dereceden 28 dereceye ve 32 santigrat dereceye yükseltilmesi, uyarılmış EPSC'lerin eğimini arttırır. Burada uyarılmış EPSC genliği, eksi 80 milivoltta voltaj kelepçesi modunda değerlendirilir. Seri direnç arttığında, uyarılan EPSCS'nin genliği azalır.

Ve burada, iki nörondan alınan izlerin bir örneği, giriş direncinin nöronun ani yükselme yeteneği üzerindeki etkisini gösteriyor. Nöronlar akım kenetlenir ve eksi 80 milivoltta tutulur. Giriş direnci arttığında, aksiyon potansiyellerinin sayısı da artar.

Bu prosedürü denerken, sağlıklı beyin dilimleri oluşturmanın kritik olduğunu hatırlamak önemlidir. Seri direnç, giriş direnci ve sıcaklık gibi elektrik sinyali dalga biçimini etkileyebilecek parametrelerin izlenmesi de önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, beyin dilimlerinde tam hücre kayıt tekniğinin temel yönünü iyi anlamış olmalısınız.