Name: Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Öğrenin biyoparlaklık görüntüleme yöntemiyle Trypanosoma brucei enfeksiyonunun merkezi sinir sistemindeki ilerlemesini fare modelinde gerçek zamanlı izlemeyi. Bu teknik ilaç değerlendirmesini 90 güne indirger.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz T. sağlamak için John Kelly ve Martin Taylor (Hijyen ve Tropikal Tıp London School) teşekkür ederim b. brucei GVR35-VSL-2 ve in vivo görüntüleme tavsiye için Dr. Andrea Zelmer (LSHTM). Bu çalışma Bill ve Melinda Gates Vakfı Küresel Sağlık Programı (hibe sayısı OPPGH5337) tarafından desteklenmiştir.

ahlâk Tüm çalışmalar UK Home Office Animals onayı (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 ve Hijyen ve Tropikal Tıp Hayvan Refahı ve Etik Değerlendirme Kurulu London School of altında yürütülmüştür. kılavuz ARRIVE bu raporda takip edilmektedir. Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei Vivo Passage 1. <ol><li> T. bir Kriyoprezerve stok (adlandırılır stabilate) çıkarın b. brucei suşu sıvı azot 9 (MTA aracılığıyla Hijyen ve Tropikal Tıp London School Profesörü John Kelly temin edilebilir) GVR35-VSL-2 ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Steril fosfat tamponlu glukoz tuz (PBS-G), pH 8.0 (1 L PBS + 15 g glukoz) 10, 2 x 10 4 tripanozomlar / ml stabilate seyreltilir. Not: T. b. brucei GVR35-VSL-2 insanlarda bulaşıcı olmayan ve SAPO deneyleri yürütmek için imkanları lisanslı gerektirir. </li><li> enjvb 25 G iğne ile intraperitonal yoldan (İP) ile tripanozomlarına seyreltilmiş 0.2 ml 20-25 gram ağırlığında dişi CD1 fare. Bu &quot;donör fare&quot; dir. Belirli Patojen Free (SPF) -cage ve yem ad libitum içine enfekte fare yerleştirin. Not: CD1 fareler bir outbred zorlanma ve T. vardır b. brucei GVR35 enfeksiyonlar suşta iyi karakterize edilir. Ancak, bu protokol aynı zamanda doğal ya da genetiği değiştirilmiş suşları için geçerli olmakla birlikte, görüntüleme 6,9 hassasiyetine etkileyebilecek o kürk rengi dikkat etmek önemlidir. </li><li> kan numunesi alarak periferik parasitemia izleyin. plastik süzgeç içine fare koyun ve 21 G iğne veya venesection ile venepunkturdan tarafından kuyruk kan 5 ul almak ve kırmızı kan hücreleri parçalanması ve daha kolay sayım sağlamak için% 0.85 steril amonyum klorür ile 1/10 karıştırın. </li><li> Neubauer hemositometrede Seyreltilmiş Kan sayın. <ol><li> Her iki odalarına seyreltilmiş kan yükleyin. tüm merkez gr saymakbir odanın id n tripanozomlann vermek. Kan = n x 10 4 tripanozomlar / ml tripanozomlann konsantrasyonu, herhangi bir seyreltme faktörü ayarlamak ve iki odadan ortalamasını hesaplar. Not: Yaklaşık 5-7 gün sonra enfeksiyon, periferal parazitemi 2 x 10 4 tripanozomlar / ml&#39;lik bir konsantrasyonda bir enfeksiyon gerçekleştirmek için yeterli artacaktır. </li></ol></li><li> tripanosom seviyeleri 1.6 adıma geçmek, gerekli farelerin sayısı için yeterince yüksek olduğunda. Bir verici bir fare 6 x 10 4 tripanozomlar / ml&#39;lik bir parazit seviyesi 10 farelerin enfeksiyonu için yeterlidir. Not: istatistiksel olarak anlamlı bir grup boyutları için, n = 6 fare, her tedavi grubu için 8 ihtiyaç vardır. diğer enfeksiyon modeller için, güç hesapları uygun grup boyutlarını belirlemek için uygulanacak gerekir. </li><li> (Yaklaşık 5-10 dakika 28-30 ° C&#39;de) bir ısı kutusu içine yerleştirin fareler kuyruk damarları genişletmek için izin vermek.Terminal anestezi neden 20 mg / 25 G iğne ile kg pentobarbital iv yönetmek için. Onayla fare hafifçe hiçbir geri çekilme refleksi olmadığından emin olmak için, pedallar Sürüş Esnasında basılarak uyuşturulduktan. </li><li> Bir Bijou tüpüne 5.000 USP birim / ml&#39;de 5 mi heparin aliquoting ve bir 1 ml şırınga ucunda iğne üzerinden iki emerek, bir 21 G iğne Heparinize. </li><li> heparinize 21 G iğne ile 1 ml şırınga alın ve göğüs kafesi altında merkezi iğne sokarak anestezi geçiş fare üzerinde kalp ponksiyon gerçekleştirin (kan boncuk iğne tabanında havuz olacak) ve yavaşça pistonu geri çekin böylece kalbin odasına daraltmak için değil. kan 0.7 ml az toplayın. </li><li> Yukarıdaki adım 1.1 olarak PBS-G pH 8.0 içinde 2 x 10 4 tripanozomlar / ml&#39;lik bir aşının üretilmesi için enfekte olmuş kan seyreltilir. Not: Bu noktada, geri kalan kan% 8 gliserol,% 20 ısıyla inaktive edilmiş cenin ca karıştırılarak stabilate üretilmesi için dondurularak saklanabilirEğer serumu (hi-FCS) ve% 72 enfekte kan. Yavaş yavaş sıvı azot aktarmadan önce, C / dk ° -1 soğutma hızını elde etmek için bir kap dondurma yavaş dondurma kullanılarak -80 ° C &#39;de dondurma. </li></ol> Deneysel Fare 2. Enfeksiyon <ol><li> nazikçe ılık damarları genişletmek için bir ısıtma kutusu içine CD1 dişi fareler (~ 21-25 gr) yerleştirin. plastik kısıtlama içine ısıtılmış fareler yerleştirin ve fare başına 4.000 tripanozomlann eşdeğer kuyruk damar içine 25 G iğne ile damar 0.2 ml seyreltilmiş inokulum enjekte. Kanamayı durdurmak için daha sonra enjeksiyon yerinde basıncı yerleştirin. Karın içi enfeksiyon enfeksiyonun geçerli bir yol olduğunu ve daha önceki çalışmalarda 10 kullanılmıştır, ancak intravenöz yolla bu daha az tekrarlanabilir bulduk: edin. </li><li> SPF-havalandırmalı kafeslerde 3&#39;lü gruplar halinde enfekte fare ve kafesi Rastgele. Bir kontrol olarak, yabani tip olmayan biyolojik olarak ışık veren parazit, T ile CD1 dişi farelerin enjekte b. brucei GVR35 (n =3). </li><li> Kan Film Mikroskopi sayesinde Enfeksiyon Monitör <ol><li> Noktası 5 ul bir cam lam üzerine venepunkturdan ya venesection kan ve (hafifçe ince bir film oluşturmak için bir slayt üzerinde kan damlayı ikinci cam slayt kullanılarak) kan yayma gerçekleştirin. kuru hava slaytlar bırakın. </li><li> DH 2 O ile yıkamadan önce 10 dakika süreyle Giemsa ile% 100 metanol ve leke kan yayma düzeltmek ve kurumaya bırakın. 100X objektif altında görünümü (fov) 10 alanda tripanozomlann sayısını. Not: Kan çekim gibi erken bir gün sonrası enfeksiyon gibi bütün hayvan invaziv olmayan görüntüleme yanında yapılır. Hayvanlar, bir dizi işleme tabi tutarken numuneler, oda sıcaklığında saklanabilir ve daha sonra sayılabilir gibi, tripanosom kantitatif bu yöntem hemositometre sayımı tercih edilir. </li></ol></li></ol> 3. Biyoparlaklık Görüntüleme Enfeksiyon iz Not: enfeksiyon izlemek için, bütün animEl non-invaziv görüntüleme kullanılabilir. <ol><li> 30 mg / ml&#39;de Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) D-lusiferin, ateşböceği lusiferaz alt-tabaka, bir stok çözelti hazırlayın. Filtre sterilize ve -20 ° C&#39;de parçalar halinde dondurma. Not: D-luciferase duyarlı ışık, bu nedenle folyo alikotları sararak ışıktan korumak. Bu aktiviteyi 11 etkileyebilir olarak art arda luciferase-çözülme donma yok. </li><li> Oda sıcaklığına kadar D-luciferase bir kısım ısıtın. (Nonbioluminescent vahşi tip parazit türü ile enfekte edilmiş kontrol farelerinde de dahil olmak üzere), kafesin her fare çıkarın ve intraperitonal 25 G iğne ile 150 mg / (DPBS içinde seyreltilmiş) ısıtıldı, D-luciferase kg enjekte edilir. / Dakika 2.5 L% 2 izofloran / O 2 karışımı ile anestezi sağlamak için yaklaşık 5 dakika boyunca, bir izofloran odasına fareler yerleştirin. Not: Onlar anestezi altında olduğunda Fareler hareketsiz hale gelir. Burada kullanılan kamera için, 3 fare, bir anda işlenebilir. farenin anesthet isedaha uzun bir süre 30 dakika yanıstarak, oftalmik merhem, yapay gözyaşı kurumasını farelerinin gözleri önlemek için uygulanabilir. </li><li> Burada anlatılan görüntüleyici için Yazılımı açmak ve üreticinin talimatlarına göre yazılımı kullanarak makineyi başlat. Kamera ve ısıtmalı plaka sıcaklığı ulaştığında görüntü kazanır. Not: Bu cihaz, genellikle bir gecede arka plan kalibrasyonları yapmak için makinenin sağlayan kapalı değil. yeniden başlatmak gerekiyor durumunda, öncelikle bir kalibrasyon kontrolü çalıştırmanız gerekir. </li><li> (3.5 bakınız) kamera içine anestezi fareler yerleştirin. herhangi bir parlak bioluminescent sinyal yoluyla kanama en aza indirmek için fareler arasında büyük siyah ayırıcılar kullanın. pozlama süreleri bir dizi kullanarak görüntü fareler; Görünüm E orta binning, 1 f / durdurma ve açık filtre ve alanla 1, 3, 10, 30, 60 ve 180 saniye, (12.5 x 12.5 cm 2). Not: vahşi tip nonbioluminescent GVR35 parazit ile enfekte kontrol fareleri bir backgr sağlamakound biyoparlaklık değer. Bu model ile, bir lusiferin kinetik deney (Şekil 6), biz 10 dakika biyoışıldama sinyal tepe Uygulamayı takip ve görüntüleme yaklaşık 3 fareler için 5 dakika sürer bulmuşlardır. anestezi ve fareler görüntüleme dikkate bu zaman ölçeği alın. </li><li> Farelerin tam görüntüleme sağlamak için, ventral, dorsal ve lateral görünüm elde etmek için döndürün. ardışık hayvanlar arasındaki görüntüleme için oryantasyon sırayla tutarlılığı korumak. </li><li> görüntüleme sonra fareler SPF-kafes dönmeden önce gözlem altında anestezi kurtarmak için izin verir. </li><li> gün 21 sonrası enfeksiyon kadar her 7 gün fareler görüntüleme devam edin. tüm hayvan üzerinde biyoparlaklık sinyali istikrarlı bir artış olmalıdır. </li><li> D21, görüntü ve kan filmi / kg diminazene aceturate intraperitonal 40 mg fareler, yukarıda tarif edilen ve bir doz olarak fareler. Bu ilaç periferik parasitemia silecektir ancak kan Brai geçmeyeceğimn bariyer ve bu nedenle MSS enfeksiyonu daha iyi görselleştirme sağlar. Not: Diminazene aceturate erken evre, hayvan trypanosomiasis tedavisi için kullanılan iyi bilinen bir ilaçtır. </li><li> D28 ve D35 de görüntüleme ve izleme devam edin. </li></ol> 4. MSS Enfeksiyon Onaylama <ol><li> D35 &#39;de, yukarıda açıklandığı gibi resim fareleri (3.1-3.4 adım). </li><li> görüntüleme sonra, daha fazla analiz için kan toplama aşamasında 1.6-1.8 detaylı olarak farenin anestezi ve asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​farelerden kurtarmak için izin verir. </li><li> kardiyak delme ardından, 20 ml PBS ile fareler serpmek (isteğe bağlı: 3 mg / perfüzyon çözüm luciferase ml ekleyin) organlara kan temizlemek ve zaman aralığındaki beyin bölgesi temizlenir olabilir luciferin etiketi reintroduce kalp yoluyla adım 4.1. </li><li> Yavaşça beyin izin, kavisli makas kullanılarak kafatası çevresi etrafında tabanından kesme ve kafatasının üst kısmı kapalı kaldırarak beyin kaldırmakhafifçe kavisli bir forseps ile kaldırılması gerekir. </li><li> Yeterli luciferase Kesilerek çıkarılan beynin eklendi sağlamak için, siyah plastik pipet önce görüntüleme organ üzerindeki 15 mg / ml lusiferin 50 ul bir bölümü üzerine Kesilerek çıkarılan beynin yerleştirin. Yukarıdaki ayarları kullanarak görüntü. Bu beyin hemisfer enfeksiyon lokalizasyonu gösterecektir. Not: Daha önce 8 açıklandığı gibi kesilmiştir beyin üzerinde parazitemi Mansap miktar qPCR yapılabilir. Diğer alternatif aşağı uygulamalar tespit sonucu beyin dokusunda parazitleri tespit etmek histoloji veya immünohistokimyasal içerebilir. </li></ol> Biyoparlaklık Görüntüleme 5. kantitasyonu Not: Biyoparlaklık görüntüleme yazılımı ile ilgi alanları (ROI) bölgesini kullanarak sayısal ve arka plan biyoparlaklık için düzeltilebilir. <ol><li> ROI aracını kullanarak, bütün hayvan kantitatif a için bir dikdörtgen ROI oluşturmaknd fare kuyruk tabanına burnunun ucunu kapatmak için fare resmin üzerine getirin. Her hayvan ve her zaman noktası için aynı boyutta kutusunu kullanın. beyin için ROI bakarken, görüntüdeki fare kafası bölge üzerinde konumlandırma, aynı şekilde dairesel ROI kullanın. </li><li> İstenirse, enfeksiyon görsel gösterimi için aynı spektrum görüntülenmesini ayarlayın. Not: Burada kullanılan yazılım otomatik olarak minimum ve maksimum foton sayıları için ayarlanmış her bir görüntü için bir renk haritası oluşturur. görüntülerin bir dizi arasındaki görsel karşılaştırma etkinleştirmek için, renk skalası, tüm görüntüler için aynı değerlere ayarlanmalıdır. <ol><li> En yüksek biyolüminesans ve araç paleti üzerinde &#39;Görüntü ayarlamak&#39; sekmesi ile görüntüyü kullanarak, logaritmik ölçek ve uygun bir renk skalası minimum ve maksimum (ampirik olarak tespit edilmesi) seçin. deney boyunca tüm görüntüleri bu ölçek uygulayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 375 (9709), 148-159 (2010).</li>
<li>Rodgers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosomiasis+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Trypanosomiasis and the brain.</a> Parasitology. 137 (14), 1995-2006 (2010).</li>
<li>Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%3A+pharmacological+re-engagement+with+a+neglected+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease.</a> Br. J. Pharmacol. 152 (8), 1155-1171 (2007).</li>
<li>Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+in+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drug resistance in human African trypanosomiasis.</a> Future Microbiol. 6 (9), 1037-1047 (2011).</li>
<li>Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+duration+of+infection+with+Trypanosoma+brucei+in+mice+and+the+efficacy+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy.</a> Parasitology. 75 (2), 143-153 (1977).</li>
<li>Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+biophotonic+imaging+for+studies+of+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease.</a> FEMS Microbiol. Rev. 35 (2), 360-394 (2011).</li>
<li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (6), 537-540 (2005).</li>
<li>Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+reproducible+in+vivo+imaging+mouse+model+for+evaluation+of+drugs+against+late-stage+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis.</a> J. Antimicrob. Chemother. 70 (2), 510-517 (2015).</li>
<li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+%27red-shifted%27+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (11), e2571(2013).</li>
<li>Jennings, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%3A+potential+therapeutic+benefits+of+an+alternative+suramin+and+melarsoprol+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Int%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen.</a> Parasitol. Int. 51 (4), 381-388 (2002).</li>
<li>Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+monitoring+of+in+vivo+colonization+and+clearance+dynamics+by+light-emitting+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria.</a> Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).</li>
<li>Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+chemotherapy+with+a+substance+P+receptor+antagonist+%28aprepitant%29+and+melarsoprol+in+a+mouse+model+of+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Int%22%5BJournal%5D)">Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis.</a> Parasitol. Int. 56 (4), 321-324 (2007).</li>
<li>Kamerkar, S., Davis, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+on+the+brain%3A+understanding+host-pathogen+interactions+in+chronic+CNS+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection.</a> J. Parasitol. Res. 2012, 589295(2012).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (32), 11468-11473 (2005).</li>
<li>Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+Toxoplasma+gondii+to+immunoprivileged+organs+and+role+of+Toll%2Finterleukin-1+receptor+signalling+for+host+resistance+assessed+by+in+vivo+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging.</a> Cell. Microbiol. 7 (6), 837-848 (2005).</li>
<li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+chronic+Trypanosoma+cruzi+infections+reveals+tissue-specific+parasite+dynamics+and+heart+disease+in+the+absence+of+locally+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection.</a> Cell. Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bir biyolojik olarak ışık veren T gelişimi b. brucei GVR35 suşu geç dönemde erken bir tripanozom enfeksiyon görselleştirme sağlar. Önceki enfeksiyon modelleri parazitler beyin olduğunda kan filmi mikroskopi gerçek zamanlı olarak, geç evre tespit koyamadık ve parazit yükünün 12 belirlemek için enfekte farelerin beyinleri seçilmesini ve çıkarılması gerekti. tek bir fare enfeksiyon bütünlükleri içinde ve herhangi bir aşamada gözlemlenebilir enfeksiyonun hızlı bir nicel değerlendirme süresi boyu...

İnsan Afrika tripanozomiyazı (HAT) veya uyku hastalığı, Trypanosoma brucei spp1'in vektör kaynaklı protozoan parazitlerinden kaynaklanır. Tahmini mevcut vaka sayıları her yıl 7 binden azdır ve Afrika kıtasında yaklaşık 70 milyon insan parazit enfeksiyonu riskine maruz kalmaktadır. Tedavi edilmezse çoğunlukla ölümcül olan hastalık, parazitlerin kanda bulunduğu, parazitlerin merkezi sinir sistemini (CNS) istila ettiği ve artık erken evre tripanozomal ilaçlarla tedaviye duyarlı olmadığı geç evreye ilerleyen erken bir hemolenfatik aşamayı içerir2. Geç evre HAT için mevcut ilaç tedavileri hem karmaşık, uzun süreli tedavi rejimlerine hem de ciddi yan etkilere ve bildirilen dirence sahiptir, bu nedenle yeni ilaç tedavilerine yönelik araştırmalar zorunludur3,4. 
Geleneksel fare modellerinde geç evre insan Afrika tripanozomiyazı (HAT) çalışması uzun ve karmaşıktır, parazitik yükü izlemek için beyin dokusunun çıkarılması gereklidir5. Hayvan enfektif suşu T. b. brucei, tripanozomiyazisin çalışma modeli olarak kullanılır ve geç evre enfeksiyondan 21 gün sonra (dpi) ortaya çıkar. Fare modelinde vahşi tip biyolüminesan olmayan parazit enfeksiyonunu izlemek için, periferik kan filmleri veya kantitatif PCR, parazit yükünü belirlemenin tek yöntemidir. Beyindeki parazit yükü için, farenin itlaf edilmesi, beynin eksize edilmesi ve dokular üzerinde qPCR yapılması gerekir, bu da geç evre enfeksiyonda parazitlerin birden fazla zaman noktasında izlenmesini imkansız hale getirir. Bu, merkezi sinir sistemi (CNS) içindeki gerçek zamanlı enfeksiyonları takip edememe ile sonuçlanır. 
 İn vivo biyolüminesans görüntüleme (BLI), deneyin tamamı boyunca tek bir hayvanda izlenebilen bir fare modelinde parazit yayılımının ve hastalık ilerlemesinin son derece hassas, invaziv olmayan tespitini sağlayabilir6. BLI, lusiferaz katalizli bir reaksiyon tarafından üretilen görünür spektrumdaki ışık emisyonuna dayanır. Yayılan fotonlar daha sonra bir şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera7 tarafından algılanır. Bu amaçla, patojen, bir lusiferaz proteinini eksprese etmek için genetik olarak modifiye edilir ve substrat, lusiferin, ilgilenilen zaman noktalarında enjeksiyon yoluyla eklenir. Bu yöntemin temel avantajı, aynı hayvanın minimum yan etki ile birkaç kez görüntülenebildiği uzunlamasına çalışmalar yapabilme yeteneğidir. Elde edilen biyolüminesans sinyali ölçülebilir, böylece patojen yükü gösterilir.
Kırmızıya kaymış bir biyolüminesans T. b. brucei'nin optimizasyonu ve validasyonu, non-invaziv prosedürler yoluyla geç evre enfeksiyonun araştırılmasını, parazitlerin kan filmi mikroskobundan daha erken tespit edilmesini ve geç evre tripanozomiyazda CNS enfeksiyonu ve ilaç taramasını incelemek için gereken zamanı, maliyeti ve hayvan sayısını büyük ölçüde azaltmıştır8,9. Bu protokolde, farelerin biyolüminesan tripanozomlarla enfeksiyonunu ve daha sonra hastalık ilerlemesinin ve CNS penetrasyonunun nicelleştirilmesi için parazitlerin in vivo olarak nasıl görselleştirileceğini gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma, İngiltere</td><td>P4417</td><td>tabletleri pH 7.4</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma, İngiltere</td><td>G8270</td><td>%99,5 (moleküler) sınıf</td></tr><tr><td>Amonyum klorür</td><td>Sigma, İngiltere</td><td>A9434</td><td>%99,5 (moleküler) sınıf</td></tr><tr><td>Heparin (lityum tuzu)</td><td>Sigma, İngiltere</td><td>H0878</td><td></td></tr><tr><td>Hi-FCS</td><td>Gibco, Life Technologies, İngiltere</td><td>10500-064</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma, İngiltere</td><td>D4031</td><td>Steril filtreli</td></tr><tr><td>Bay Frosty</td><td>Nalgene, İngiltere</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Sigma, İngiltere</td><td>G5637</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Perkin Elmer, İngiltere</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma, İngiltere</td><td>115144-35-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diminazen asetürat</td><td>Sigma, İngiltere</td><td>D7770</td><td>Analitik sınıf</td></tr><tr><td>IVIS Lumina II</td><td>Perkin Elmer, Birleşik Krallık</td><td></td> Bruker, Kodak Living Image v. 4.2 Perkin Elmer, Birleşik Krallık'ta Perkin Elmer IVIS cihazları için Birleşik Krallık'a <td>ait tescilli yazılımdan temin edilebilen diğer biyogörüntüleyiciler e.</td></tr> mevcuttur<tr><td></td><td></td><td>; diğer aletlerin kendi</td>1 ml Şırıngaları olabilir Fisher Scientific, Birleşik Krallık 10142104 20 ml Şırınga Fisher Scientific, Birleşik Krallık 10743785 25 G İğneler <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>N2516</td><td></td></tr><tr><td>21 G İğneler</td><td>Greiner Bio-one</td><td>N2138</td><td></td></tr><tr><td>Çift buzlu mikroskop lamı</td><td>VWR, İngiltere</td><td>631-0117</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Mikrosantrifüj tüpü</td><td>StarLab, İngiltere</td><td>I1415-1000</td><td></td></tr><tr><td>7 ml Bijou tüpü</td><td>StarLab, İngiltere</td><td>E1412-0710</td><td></td></tr><tr><td>Fare tutucu</td><td>Sigma, İngiltere</td><td>Z756903</td><td>Kısıtlayıcımız şirket içinde yapıldı, bu benzer bir model</td></tr></tbody></table>

biyoparlaklık görüntüleme afrika trypanosomiasis geç evre enfeksiyon algılama için

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

İnsan Afrika tripanozomiyazı (HAT), iki aşamada ortaya çıkan çok aşamalı bir hastalıktır; erken kan evresi ve parazitin merkezi sinir sistemini (CNS) istila ettiği geç evre. Geleneksel metodolojiler parazitlerin varlığını belirlemek için beynin çıkarılmasını gerektirdiğinden, geç evrenin in vivo çalışması sınırlı kalmıştır.
Biyolüminesans görüntüleme, lusiferaz transfekte edilmiş bir patojenin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayan, invaziv olmayan, oldukça hassas bir optik görüntüleme şeklidir. Farelerde geç evre hastalık üretme kabiliyetine sahip transfekte edilmiş bir tripanozom suşu kullanarak, enfeksiyon seyri boyunca tek bir hayvanda bir CNS enfeksiyonunun kinetiğini inceleyebilir ve sistemik bir enfeksiyonun hareketini ve yayılmasını gözlemleyebiliriz.
Burada, Afrika tripanozomiyazisin biyolüminesans modelini kullanarak CNS enfeksiyonlarını incelemek için sağlam bir protokol açıklıyoruz ve isteğe bağlı aşağı akış yaklaşımlarıyla daha fazla analiz edilebilecek gerçek zamanlı non-invaziv gözlemler sağlıyoruz.

Bu protokol T. ile farelerin enfeksiyonu takiben hastalığın ilerlemesini takip etmek nasıl gösterir b. brucei, insan Afrika trypanosomiasis için bir model. Şekil 1 tedavi ve görüntüleme aşamaları için takvimi gösteren deneysel protokol çizelgesini gösterir. 2 periferik parasitemia ölçmek için kullanılan sabit bir Giemsa lekeli kan yayması bakış tipik bir alanı gösterir Şekil, tripanozomlar ve kırmızı kan hücreleri ile m...

Bu el yazması, geç evre enfeksiyonun izlenmesini sağlamak için Afrika tripanozomlarının biyolüminesan bir suşunun kullanımını açıklar ve in vivo canlı görüntülemenin merkezi sinir sistemi içindeki enfeksiyonları gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini gösterir.

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Bu protokolün genel amacı, in vivo canlı görüntüleme kullanarak gerçek zamanlı bir trypanosome enfeksiyonunu takip etmek ve farede, klinik uyku hastalığı ilerlemesini taklit ederek erken kan evrelerinden geç beyin enfeksiyonu evrelerine kadar olan süreci görselleştirmektir. Bu yöntem, trypanosome biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, potansiyel yeni terapötik tedavilerin belirlenmesini sağlayabilir ve enfeksiyona karşı etkinliğin değerlendirilmesine imkan tanıyabilir. Bu tekniğin temel avantajı, önceki model tipinin gerektirdiği 180 güne kıyasla, ilaç değerlendirmesinin 90 gün içinde tamamlanabilmesidir.Bu protokol, insan Afrika tripanosomiyazı hakkında bilgi sağlayabilir ancak tüberküloz veya Chagas hastalığı gibi diğer enfeksiyöz hastalık modelleri için de uygulanabilir. Öncelikle, kuyruk venlerini genişletmek için 21 ila 25 gram ağırlığındaki CD1 dişi fareleri bir ısıtma kutusuna yerleştirin. Ardından, ısıtılmış fareleri tek tek plastik bir sabitleme cihazına yerleştirin ve 25 gauge bir iğne kullanarak 0,2 milliliters dilüe edilmiş trypanosome brucei GVR35VSL2 inokülümünü intravenöz olarak kuyruk venine enjekte edin; kanamayı durdurmak için enjeksiyondan hemen sonra enjeksiyon bölgesine baskı uygulayın.Enfeksiyonu kan yayması mikroskopisi ile izlemek için, bir lam üzerine 5 µL kan damlatın. Damlayı ilk lam boyunca nazikçe yayarak ince bir film tabakası oluşturmak için ikinci bir lam kullanın. Lamların havada kurumasını bekleyin ve ardından kanı %100 methanol ile fikse edin, ardından 10 dakika boyunca Giemsa boyasında bekletin.İnkübasyonun sonunda lamları distile su ile durulayın ve havada kurumaya bırakın. Ardından, 100x objektif altında 10 görüş alanındaki trypanosome sayısını sayın. Enfeksiyonu biyolüminesans görüntüleme ile takip etmek için, bir miktar D-luciferin'i oda sıcaklığına getirin.Ardından, hayvan başına 150 mg/kg ısıtılmış lusiferini intraperitonal olarak enjekte etmek için 25 gauge iğne kullanın. Sonrasında, görüntüleme yazılımını kullanarak makineyi üretici talimatlarına göre başlatın. Kamera ve ısıtmalı plaka uygun sıcaklıklara ulaştığında, parlak biyolüminesans sinyallerinin birbirine karışmasını en aza indirmek için anestezi altındaki hayvanların arasına büyük siyah ayırıcılar yerleştirin.Fareleri, orta düzey binning, tek bir F-stop, açık filtre ve 12.5 x 12.5 santimetrelik bir görüş alanı E kullanarak bir dizi pozlama süresiyle görüntüleyin. Farelerin eksiksiz bir şekilde görüntülenmesini sağlamak için, ventral, dorsal ve lateral görünümleri elde edecek şekilde hayvanları döndürün. 21. günde fareleri gösterildiği gibi görüntüleyin ve kan yayması hazırlayın.Ardından, periferik parazitemiyi temizlemek için hayvanlara intraperitonal olarak kilogram başına 40 miligram diminazin aseturat uygulayın. 35. günde hayvanların görüntülemesini yaptıktan sonra, eksize edilen beyinleri siyah plastik bir yüzey üzerine yerleştirin ve dokuların üzerine 15 miligram/mililitre konsantrasyonunda 50 µL lusiferin damlatın. Daha sonra, tüm hayvan görüntülemesi için gösterilen ayarların aynısını kullanarak beyni görüntüleyin.Belirli ilgi bölgeleri (ROI'ler) içindeki biyolüminesans derecesini nicelleştirmek için görüntüleme yazılımındaki ROI aracını seçin ve tüm hayvan nicelleştirmesi için dikdörtgen bir ROI oluşturun. ROI'yi, burnun ucundan kuyruk tabanına kadar fare görüntüsünün üzerine yerleştirin ve her hayvan ile her zaman noktası için aynı boyutlardaki kutuyu kullanarak toplam akıyı ölçün. Sadece beynin ROI'sini değerlendirmek için dairesel bir ROI oluşturun ve bunu hayvanın baş bölgesinin üzerine yerleştirin.Her hayvan için işlemi tekrarlayın ve toplam akıyı ölçün. Ardından, en yüksek biyolüminesansa sahip görüntüyü ve araç paletindeki görüntü ayarları sekmesini kullanarak, görüntü için logaritmik bir ölçek ile uygun bir renk ölçeği minimum ve maksimumu seçin ve bu ölçeği deneydeki tüm görüntülere uygulayın. Enfeksiyon gelişimi, bir deney süresince hayvanlardaki enfeksiyon derecesini belirlemek amacıyla biyolüminesansın ardışık ölçümleri ile in vivo olarak takip edilebilir.Enfeksiyon ilerledikçe, sinyalin daha yaygın ve yoğun hale gelmesiyle birlikte, ilk 21 gün boyunca tüm hayvanlarda biyolüminesansta bir artış gözlemlenebilir ve biyolüminesansın en yüksek olduğu bölgeler dalak alanında belirginleşir. 21. günde, az önce gösterildiği gibi, farelere görüntüleme sonrası diminazine aceturate uygulanır; bu durum, periferik enfeksiyon temizlendiği için 28. güne gelindiğinde beyinde yalnızca düşük seviyelerde biyolüminesans kalmasıyla sonuçlanır. 35. günde, sinyal sadece kafa bölgesinde mevcut olmaya devam etmekle kalmaz, aynı zamanda daha da yoğunlaşır ve bu da olası bir beyin enfeksiyonuna işaret eder.Hem periferik parasiteminin hem de biyolüminesansın nicelendirilmesi, hastalık kinetiğinin değerlendirilmesine olanak tanır. Örneğin, bu deneyde, 7. günde saniyede 10⁸ fotonluk yüksek bir biyolüminesans sinyali gözlemlenirken, aynı gün hazırlanan kan yaymalarında gözlemlenen parasitemi oldukça düşük seviyelerdeydi. 28. günde, 21. günde uygulanan diminazen aseturat tedavisi nedeniyle kan yaymalarında parasitemi saptanamaz hale gelirken; biyolüminesans, baş bölgesinde gözlemlenen biyolüminesansı temsil ederek 35. güne kadar arka plan seviyelerinin üzerinde kalmaya devam etmiş ve biyolüminesans analizinin kan yayma yöntemine göre daha yüksek hassasiyete sahip olduğunu doğrulamıştır.Beynin biyolüminesans görüntülemesi, hayvanlar arasındaki enfeksiyon yükü farklılıklarını ortaya koymaktadır ve bu yükün dokunun belirli anatomik bölgelerinde lokalize olmadığı görülmektedir. Bu prosedürü uygularken, kaliteli görüntüleme verileri elde etmek için geniş bir pozlama süresi aralığı belirlemenin önemli olduğunu unutmamak gerekir; örneğin, aşırı pozlama önemli lokalizasyon detaylarını olumsuz etkiler. Bu prosedürün ardından, beyindeki parazit yükü ve parazit lokalizasyonu ile ilgili ek soruları yanıtlamak için kantitatif PCR ve immünohistokimya gibi diğer alt yöntemler uygulanabilir.Bu teknik geliştirildikten sonra, nüks tespitindeki hassasiyetin artması sayesinde trypanosom biyolojisi alanındaki araştırmacıların enfeksiyondan sonraki 90 gün içinde ilaç değerlendirmesi yapmalarının önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, hastalığın kan evresinden beynin geç evre enfeksiyonuna kadar olan ilerleyişini takip etmek için TB brucei enfeksiyonunun biyolüminesans görüntülemesinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

bioluminescence-imaging-to-detect-late-stage-infection-african

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Canlı bir Host Transgenik Leishmania Parazitlerinin in vivo Imaging

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Bir roman olarak lusiferaz ve in vivo görüntüleme sistemleri (IVIS) olarak kullanılması klinik gelişmeler ortaya çıkmadan hastalığın bitiş noktaları tespit etmek anlamına gelir. IVIS bizim gelecekteki çalışma için daha doğru bir hastalık modeli sağlayan, gerçek zamanlı olarak birden fazla gün içinde encephalitic virüs istilasına görselleştirmek için izin verdi. Bu da bize daha hızlı şu anda kullanılan hayvan modellerinde daha antiviral ve aşıların potansiyel koruyucu özellikleri tanımlamak için...

Bir Nöro-İnvazif encephalitic Virüs Vivo Görüntüleme Sistemleri (IVIS) Algılama

Kaynak: de Vries, C. R. ve ark., Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonunun Gecikmiş Aşılama Modeli. J. Vis. Exp. (2020).Bu video, canlı bir fare modelinde bakteriyel enfeksiyon ilerlemesini izlemek için biyolüminesans görüntüleme tekniğini gösteriyor. LuxABCDE raporlayıcı sistemiyle tasarlanmış patojenik bakteriler, enfeksiyon bölgesinde ışık yayarak metabolik olarak aktif bakterilerin görselleştirilmesini sağlar. Araştırmacılar, fareyi zamanla görüntülemekle, enfeksiyon dinamiklerini...

Farelerde Bakteriyel Enfeksiyonların Biyolüminesans Görüntülemesi

Afrika tripanozomlarındaki glikozom dinamiklerinin, elektron ve floresan mikroskobu gibi geleneksel hücre biyolojisi teknikleriyle incelenmesi zordur.  Dinamik organel davranışını gözlemlemenin bir yolu olarak, canlı parazitlerde gerçek zamanlı glikozom dinamiklerini izlemek için akış sitometrisi ile birlikte bir floresan-organel raportör sistemi kullanılmıştır.

Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör

Bu protokol, Çift Bioluminesans görüntüleme ile tümör ilerlemesini ve anjiyogenezi gerçek zamanlı olarak izlemek için tümör taşıyan bir fare modelinin kurulması açıklanmaktadır.

Tümör Ilerlemesi ve anjiyogenezinin çift Bioluminescence görüntülenmesi

Burada sağlanan protokol, veri toplama, analiz ve yorumlamaya odaklanarak, Trypanosoma cruzi enfeksiyonunun biyolüminesans modelinde ilaç etkinliği çalışmaları gerçekleştirmek için ayrıntılı adımları açıklamaktadır. Teknik sorunları en aza indirmek için sorun giderme ve kalite kontrol prosedürleri de sağlanmaktadır.

İlaç Etkinliği Çalışmaları için Bir Chagas Hastalığı Fare Modelinin In Vivo Biyolüminesans Görüntülemesinin Gizeminin Çözülmesi

Burada, L. infantum-Luc ile intraperitoneal (IP) veya intragingival (IG) enfekte olmuş altın hamsterlerin biyolüminesan görüntüleme ve PCR ile boylamsal bir değerlendirmesini sunuyoruz. Hamsterlar enfeksiyondan 1 gün sonra (1 dpi), enfeksiyondan 1 hafta sonra (8 dpi) ve enfeksiyondan 3 hafta sonra (22 dpi) değerlendirildi ve 50. dpi ve enfeksiyondan 8 ay sonra ötenazi yapıldı.

In vivo (İn canlı) Leishmania infantum ile Enfekte Hamsterlerin Luciferaz İfade Eden Aksenik Amastigotların Dişeti Aşılaması ile Görüntülenmesi

HIV / AIDS tedavisi için anti-retroviral tedavi Güney Afrika'da büyük bir ölçekte izlenir. Flow sitometri, hematoloji (CD45), immünoloji (CD4) ve CD38 tahlil bağlantılı viral yük için birleştirilmiştir. NHLS-SA laboratuarları, Johannesburg kaydedildi, kaynak sınırlı teşhis için rol modelleri olarak hizmet veren bu modern yöntemleri, artan yerel iç kalite kontrolü ile maliyet-etkin.

HIV / AIDS Kapsamlı ve Maliyet Etkin Laboratuvar Kontrolü: Afrikalı bir Rol Modeli

NADPH oksidaz fagositler reaktif oksijen türlerinin ana kaynağı (ROS) 'dir. Çünkü ROS geçici doğası nedeniyle, canlı hayvanlarda ROS seviyelerini ölçmek ve izlemek zordur. Yaşayan farelerde ROS seri ölçümü için bir minimal invaziv bir yöntem tarif edilmiştir.

Farklı Hayvan Modelleri NADPH Oksidaz Aktivitesinin Biyoparlaklık Görüntüleme

Öğrenin biyoparlaklık görüntüleme yöntemiyle Trypanosoma brucei enfeksiyonunun merkezi sinir sistemindeki ilerlemesini fare modelinde gerçek zamanlı izlemeyi. Bu teknik ilaç değerlendirmesini 90 güne indirger.

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Daha fazla video keşfet