Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için
May 18th, 2016
Bu el yazması, geç evre enfeksiyonun izlenmesini sağlamak için Afrika tripanozomlarının biyolüminesan bir suşunun kullanımını açıklar ve in vivo canlı görüntülemenin merkezi sinir sistemi içindeki enfeksiyonları gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini gösterir.
Bu protokolün genel amacı, gerçek zamanlı bir tripanozom enfeksiyonunu izlemek için in vivo canlı görüntüleme kullanmak, faredeki erken kanı geç beyin enfeksiyonu aşamalarına görselleştirmek ve klinik uyku hastalığı ilerlemesini taklit etmektir. Bu yöntem, tripanozom biyolojisi alanındaki temel soruların cevaplanmasına, potansiyel yeni terapötik tedavilerin belirlenmesine ve enfeksiyona karşı etkinliğin değerlendirilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilaç değerlendirmesinin önceki rol tipi model için gereken 180 günün aksine 90 günde kurulabilmesidir.
Bu protokol, insan Afrika tripanozomiyazı hakkında bilgi sağlayabilir, ancak aynı zamanda tüberküloz veya Chagas hastalığı gibi diğer bulaşıcı hastalık modellerine de uygulanabilir. Kuyruk damarlarını genişletmek için 21 ila 25 gram CD1 dişi fareyi bir ısıtma kutusuna koyarak başlayın. Daha sonra, ısıtılmış fareleri ayrı ayrı plastik bir kısıtlama cihazına yerleştirin ve 25 gauge bir iğne kullanarak 0.2 mililitre seyreltilmiş tripanozom brucei innokulumunu intravenöz olarak kuyruk damarına enjekte etmek GVR35VSL2 kanamayı durdurmak için enjeksiyon bölgesine basınç uygulayın.
Enfeksiyonu kan filmi mikroskobu ile izlemek için, beş mikro litre kanı bir cam slayt üzerine yerleştirin. Damlayı ilk slayt boyunca nazikçe sürmek için ikinci bir cam slayt kullanın ve ince bir film oluşturun. Slaytların kurumasına izin verin ve ardından kanı% 100 metanolde sabitleyin ve ardından Giemsa'da 10 dakika bekleyin.
Kuluçka işleminin sonunda, slaytları damıtılmış suyla durulayın ve kurumaya bırakın. Ardından, 10x öznel altında 10 görüş alanındaki tripanozomların sayısını sayın. Biyolüminesan görüntüleme ile enfeksiyonu izlemek için, bir D-lusiferin alikotunu oda sıcaklığına ısıtın.
Daha sonra, hayvan başına ısıtılmış lusiferinin kilogramı başına 150 miligram intraperitoneal olarak enjekte etmek için 25 gauge bir iğne kullanın. Ardından, üreticinin talimatlarına göre görüntüleyici yazılımını kullanarak makineyi başlatın. Ardından, kamera ve ısıtılmış plaka uygun sıcaklıklara ulaştığında, herhangi bir parlak biyo ışıldayan sinyalin sızmasını en aza indirmek için anestezi uygulanmış hayvanlar arasına büyük siyah ayırıcılar yerleştirin.
Orta gruplama, bir F-stop ve bir açık filtre ve 12,5 kat 12,5 santimetrelik bir görüş alanı E ile bir dizi pozlama süresi kullanarak fareleri görüntüleyin. Farelerin kapsamlı bir şekilde görüntülenmesini sağlamak için, ventral, dorsal ve lateral görünümler elde etmek için hayvanları döndürün. 21. günde, gösterildiği gibi fareleri görüntü ve kan filmi
ile kontrol edin.Daha sonra, periferik parazitemiyi temizlemek için hayvanlara intraperitoneal olarak kilogram başına 40 miligram diminazin aseturat dozlayın. 35. günde hayvanları görüntüledikten sonra, eksize edilen beyinleri siyah plastik bir bölüme yerleştirin ve dokuların üzerine mililitre başına 15 miligram 50 mikro litre 15 miligram pripet yapın. Ardından, tüm hayvan görüntülemesi için gösterilenle aynı ayarları kullanarak beyni görüntüleyin.
Belirli ilgi alanlarındaki biyo lüminesans derecesini veya ROI'leri ölçmek için, görüntüleme yazılımı içindeki ROI aracını seçin ve tüm hayvan miktarı için dikdörtgen bir ROI oluşturun. ROI'yi burun ucundan kuyruğun tabanına kadar fare görüntüsünün üzerine yerleştirin ve her hayvan ve her zaman noktası için aynı boyutta kutuyu kullanarak toplam akıyı ölçün. Tek başına beynin yatırım getirisini değerlendirmek için dairesel bir yatırım getirisi oluşturun ve bunu hayvanın baş bölgesinin üzerine yerleştirin.
Her hayvan için tekrarlayın ve toplam akıyı ölçün. Ardından, en yüksek biyo lüminesansa sahip görüntüyü ve araç paletindeki görüntü ayarlama sekmesini kullanarak, görüntü için bir logaritmik ölçek ve minimum ve maksimum uygun bir renk ölçeği seçin ve bu ölçeği deney içindeki tüm görüntülere uygulayın. Enfeksiyon gelişimi, bir deney boyunca hayvanlarda enfeksiyon derecesini belirlemek için biyo lüminesansın sıralı ölçümleriyle in vivo olarak takip edilebilir.
Enfeksiyon ilerledikçe, sinyal daha yayılmış ve yoğun hale geldikçe, ilk 21 gün boyunca tüm hayvanlarda biyo lüminesansta bir artış gözlenebilir ve en yüksek biyo lüminesans bölgeleri dalak bölgesinde görülür. 21. günde, fareler, az önce gösterildiği gibi, görüntüleme sonrası diminazin aseturat ile tedavi edilir, bu da periferik enfeksiyon temizlendiği için 28. güne kadar beyinde sadece düşük biyo lüminesans seviyeleri ile sonuçlanır. 35. günde, sinyal sadece baş bölgesinde hala mevcut olmakla kalmaz, aynı zamanda daha yoğun hale gelir ve olası bir beyin enfeksiyonunu gösterir.
Hem periferik paraziteminin hem de biyolüminesansın kantitasyonu, hastalık kinetiğinin değerlendirilmesine olanak sağlar. Örneğin, bu deneyde, 7. günde, saniyede 10 ila 8. fotonların yüksek bir biyo lüminesans sinyali gözlenirken, aynı gün üretilen kan filmlerinde gözlenen parazitemi çok düşüktü. 28. günde, 21. günde uygulanan diminazen asetürat tedavisi nedeniyle kan filmlerinde parazitemi tespit edilemez hale gelirken, biyolüminesans 35. güne kadar arka plan seviyelerinin üzerinde kalmaya devam etti, bu da kafa bölgesinde gözlenen biyo lüminesansı temsil ediyor ve biyolüminesans analizinin kan filmi çekimi üzerindeki daha yüksek hassasiyetini doğruluyor.
Beynin kendisinin biyo uminescence görüntülemesi, dokunun belirli anatomik bölgelerine lokalize görünmeyen hayvanlar arasındaki enfeksiyon yükündeki farklılıkları ortaya çıkarır. Bu prosedürü denerken, örneğin aşırı pozlama önemli lokalizasyon ayrıntılarını olumsuz etkilediğinden, kaliteli görüntüleme verileri sağlamak için iyi bir pozlama süresi aralığı elde etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, beyin parazit yükü ve parazit lokalizasyonu ile ilgili ek soruları yanıtlamak için kantitatif PCR ve immünohistokimya gibi diğer alt yöntemler uygulanabilir.
Geliştirildikten sonra, bu teknik, tripanozom biyolojisi alanındaki araştırmacıların, nüks tespitinin duyarlılığının artması nedeniyle, enfeksiyondan sonraki 90 gün içinde ilaç değerlendirmesi yapmalarının yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, hastalığın kandan beynin geç evre enfeksiyonuna ilerlemesini takip etmek için TB brucei enfeksiyonunun biyo lüminesans görüntülemesinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu el yazması, geç evre enfeksiyonunun izlenmesini sağlamak için biyolüminesan bir Afrika tripanozom suşunun kullanımını açıklar ve merkezi sinir sistemi içindeki enfeksiyonları gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için in vivo canlı görüntülemenin nasıl kullanılabileceğini gösterir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Bulaşıcı Hastalıklar
- Canlı Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Afrika tripanozomiyazı, uyku hastalığı olarak da bilinir ve önemli bir sağlık sorunudur.
- Hastalığın ilerlemesini izlemek, etkili tedaviler geliştirmek için kritik öneme sahiptir.
- In vivo görüntüleme, enfeksiyon aşamalarını görselleştirmek için yeni bir yaklaşım sağlar.
- Bu çalışma, gerçek zamanlı izleme için biyolüminesan bir tripanozom suşunu kullanır.
Çalışmanın Amacı
- Tripanozom enfeksiyonunun kandan beyne ilerlemesini görselleştirmek.
- Potansiyel tedaviler için daha hızlı bir ilaç değerlendirme yöntemi kurmak.
- Diğer bulaşıcı hastalıklara uygulanabilir bilgiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Fare üzerinde tripanozom enfeksiyonlarının in vivo canlı görüntülemes.
- Fare kuyruk damarına tripanozom brucei GVR35VSL2 enjeksiyonu.
- Gerçek zamanlı olarak enfeksiyon aşamalarının izlenmesi.
- İlaç değerlendirme zaman çizelgelerinin önceki modellerle karşılaştırılması.
Ana Sonuçlar
- Merkezi sinir sistemindeki geç evre tripanozom enfeksiyonlarının başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- İlaç değerlendirme süresinin 180 günden 90 güne düşürülmesi.
- Elde edilen bilgiler, insan Afrika tripanozomiyazı için tedavi stratejilerini bilgilendirebilir.
- Metodoloji, tüberküloz ve Chagas hastalığı gibi diğer bulaşıcı hastalıklar için uygulanabilir.
Sonuçlar
- Çalışma, tripanozom enfeksiyonlarını izlemek için yeni bir yaklaşım sunar.
- In vivo görüntüleme, ilaç değerlendirme süreçlerini önemli ölçüde artırabilir.
- Bulgular, çeşitli bulaşıcı hastalıklar için iyileştirilmiş tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Bioluminescence imaging enables real-time, non-invasive tracking of pathogen dissemination from blood to central nervous system, addressing a critical gap in late-stage infection modeling for neglected tropical diseases. This approach accelerates preclinical drug evaluation timelines by improving sensitivity for relapse detection, supporting faster go/no-go decisions in antiparasitic and antimicrobial discovery programs. The methodology provides a translatable platform for studying CNS-penetrant pathogens, enhancing predictive confidence in target validation and lead optimization workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing parasite kinetics and CNS invasion in real time.
- Operational Value: Supports biological de-risking through longitudinal monitoring of infection burden in individual animals.
- Predictive Value: Enhances target confidence by correlating bioluminescent signals with peripheral parasitemia and CNS invasion thresholds.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative flux measurements for whole-organ and organ-specific regions of interest.
- Reproducibility: Enables consistent imaging protocols across time points and animals using defined exposure settings and ROI templates.
- Scalability: Facilitates longitudinal studies in single animals, reducing cohort size and variability in infection progression tracking.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models late-stage CNS infection of African trypanosomiasis, reflecting clinical progression from hemolymphatic to meningoencephalitic stages.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing non-invasive readouts compatible with downstream PCR and histology.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by detecting persistent CNS signals after peripheral parasite clearance, indicating relapse potential.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery through lead identification stages, supporting hypothesis testing, assay standardization, and translational readout generation for CNS-active compounds.
- Discovery Biology: Enables real-time visualization of infection dissemination and tissue tropism, clarifying pathogenic mechanisms and target engagement in vivo.
- Screening: Delivers quantitative bioluminescence flux data suitable for hit validation and lead optimization campaigns requiring longitudinal infection tracking.
- Analytics: Provides longitudinal photon flux measurements that allow comparison of infection kinetics across treatment groups and time points.
- Translational Research: Outputs compatible with ex vivo validation (e.g., qPCR, IHC) to confirm brain parasite burden and distribution.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to other CNS-invasive pathogens such as those causing tuberculosis or Chagas disease.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around CNS invasion and relapse.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility through defined imaging protocols, ROI quantification, and signal normalization.
- Strategic Value: Accelerates drug evaluation from 180 to 90 days, increasing capital efficiency and reducing late-stage biological risk in antiparasitic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on CNS penetration and sustained target engagement evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in vivo imaging, animal handling, and luciferase substrate administration.
- Dependent on sensitive bioluminescence imaging systems with temperature-controlled stages and light-tight environmental controls.
- Necessitates standardization of inoculation dose, luciferin dosing, and ROI placement across longitudinal studies.
- Requires adaptation of ROI strategies for different animal models or pathogen tropism profiles.
- Limited by the need for genetic modification of pathogens to express luciferase, which may affect fitness or virulence.
