Ex Vivo Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Bu prosedürün genel amacı, toplam hücre sayısına karşı normalizasyon tekniklerine vurgu yaparak, patojenik zorluğun ince bağırsak organoidleri üzerindeki etkilerini ölçmektir. Bu yöntem, bakterilerin bağırsak epitel hücreleri ile konakçı patojen etkileşimlerini in vitro olarak araştırmak için bir araç sağlayarak doğuştan gelen ve mukozal immünoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedür için gerekli olan, organoid kültür için ELISA.To hasat faresi ince bağırsak kriptleri gibi tekniklerle organoid salgılanan proteinleri ölçerken bir gereklilik olan toplam hücre sayısına karşı normalizasyon yöntemidir, villusları ince bağırsağın lümen yüzeyinden nazikçe kazımak için steril bir cam slayt kullanarak başlayın. Daha sonra, dokuyu 1-2 santimetre uzunluğunda şeritler halinde kesmek için diseksiyon makası kullanın. Ve şeritleri 10 mililitre buz gibi soğuk PBS içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. İçeriği hafifçe ters çevirerek karıştırın ve doku içeriğinin tüpün dibine çökmesine izin verin. Ardından, PBS'yi aspire edin ve şeritleri her seferinde aynı şekilde 10 mililitre taze PBS'de üç kez daha yıkayın. Son yıkamanın sonunda, tüpü on dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ardından, PBS'yi 2 milimolar EDTA ile desteklenmiş 25 mililitre PBS ile 45 dakika boyunca sallanan bir platform üzerinde bir buz kovasında değiştirin. İnkübasyonun sonunda, doku şeritlerinin tüpün dibine yerleşmesine izin verin ve PBS-EDTA'yı% 10 FBS ile desteklenmiş 10 mililitre PBS ile değiştirin. Tüpü elinizle on kez kuvvetlice çalkalayın. Daha sonra, dokunun tüpün dibine yerleşmesine izin verin ve süpernatanı Fraksiyon 1 etiketli 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Süpernatanın her seferinde yeni bir fraksiyon tüpüne aktarılması. Son çalkalamadan sonra, tüm numuneleri santrifüjleyin ve peletleri ilave büyüme faktörü olmadan beş mililitre önceden ısıtılmış DMEM / F12 içinde yeniden süspanse edin. Şimdi, numuneleri tekrar döndürün ve her tüpten dört mililitre süpernatan aspire edin. Peletleri kalan ortamın son mililitresinde yeniden süspanse edin ve cam slaytlar üzerindeki kriptleri ve kalıntıları görselleştirmek için her fraksiyondan 20 mikrolitre alikot kullanın. En yüksek kript / enkaz oranı yüzdesini elde etmek için uygun fraksiyonları bir araya getirdikten sonra, havuzlanan fraksiyonları santrifüjleyin ve süpernatantların son 50-100 mikrolitresi hariç hepsini aspire edin. Tüpleri buz üzerinde tutarak, hava kabarcıklarının eklenmesini önlemek için yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek havuzlanan fraksiyonlara 1 mililitre protein matrisi ekleyin. Ardından, 37'lik her bir kuyucuğun ortasına 50 mikrolitre protein matrisi / kript süspansiyonu ekleyin