Name: Ex Vivo Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Öğrenin, fare ince bağırsak organoidlerinde PAMP ve Listeria monocytogenes ile desen tanıma reseptör uyarımını incelemeyi. Bu yöntem, gen ifadesi ve normalizasyon teknikleriyle bağırsak biyolojisi çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, teknik tartışmalar için Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel ve Bettina Heid'e teşekkür eder. Yazarlar, Caco-2 hücrelerini sağladığı için Dr. Nanda Nanthakumar'a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Virginia Tech'teki Çok Kültürlü Akademik Fırsatlar Programı'na (MAOP) teşekkür eder. Bu çalışma, Ulusal Diyabet Enstitüsü ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Ödülü K01DK092355 (I.C.A.'ya) tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Freshney, R. I., Freshney, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+epithelial+cells.+2nd+edn%22">Culture of epithelial cells. 2nd edn</a>. , Wiley-Liss. (2002).</li>
<li>Vachon, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+state-selective+roles+of+p38+isoforms+in+human+intestinal+epithelial+cell+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis.</a> Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).</li>
<li>Hynds, R. E., Giangreco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+relevance+of+human+stem+cell-derived+organoid+models+for+epithelial+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine.</a> Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).</li>
<li>Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+shaping+the+gastrointestinal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment.</a> Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).</li>
<li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogenic+influence+of+human+R-spondin1+on+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium.</a> Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRX1+protein+attenuates+inflammatory+responses+to+infection+by+interfering+with+the+RIG-I-MAVS+and+TRAF6-NF-kappaB+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways.</a> Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).</li>
<li>Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella-infected+crypt-derived+intestinal+organoid+culture+system+for+host-bacterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions.</a> Physiol Rep. 2 (9), (2014).</li>
<li>Grabinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+intestinal+crypt+organoids+as+a+model+system+for+assessing+cell+death+induction+in+intestinal+epithelial+cells+and+enteropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy.</a> Cell Death Dis. 5, 1228(2014).</li>
<li>Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Succinate-Tetrazolium+Reductase+Systems.+Iii.+Points+of+Coupling+of+Four+Different+Tetrazolium+Salts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts.</a> Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).</li>
<li>Parry, M. F., Neu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-acetylcysteine+on+antibiotic+activity+and+bacterial+growth+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro.</a> J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bağırsak organoids kültürü ve bakım yeterli doku kültürü tekniği ile herhangi bir birey tarafından hakim olabilir bir işlemdir. Orada bir daha geleneksel tek tabaka hücreleri büyüyen karşılaştırıldığında Pasajlanması içinde inceliklerini, ancak bu inceliklerini üstesinden gelmek için zor değildir. Bu yöntemin kritik adımlar optimum tohumlama için yeterince yüksek bir yoğunluğa organoids büyümek için güçlü olmak içerir. genel olarak hücre hatları ile elde edilebilir, büyük ekme yoğunluğunun pratik değildir gibi deneyler ...

Becerisi hasat ve kültürü birincil organoids doku biyolojisinde 1-5 için daha fazla fizyolojik olarak Örnek olguları anlama germane verici gelişmeleri ince bağırsak, kolon, pankreas, karaciğer ve beyin için tarif edilmiştir ve. Ince bağırsak organoids kültürünü ve bakım açıklayan ilk yöntemler Sato ve arkadaşları tarafından rapor edildi. Hans Clevers 1 laboratuar dışında. Bu yöntem, hasattan ve ispat primer intestinal epitelyal hücrelerin kültürü önce sınırlı ve epitel hücre büyümesinin sürdürülmesi etkisiz olduğunu göstermiştir. Yöntem sonuçta karışmış primer fibroblast hücreleri 6 büyümesinin yol açacak gibi kollajenaz ve dispase gibi enzimler ile inkübasyon yoluyla doku ayrılmasını içermektedir. Bu koşullar aynı zamanda zaman epitel hücre kültürü sürdürülmesinde sınırlı olacaktır. epitel hücreleri nedeniyle apoptoz girecek hiçbir epitel hücre niş Minimal, kuracaktıUygun büyüme faktörleri ya da kontak bütünlüğü kaybı olmaması anokis 7 olarak adlandırılan. 3D-organoid kültür sisteminin çıkışı sürekli kültürü 1 intestinal hücre tiplerinin spektrumu içeren kültür primer bağırsak hücreleri için bir yöntem sağlamıştır. Bu epitel organoids da birkaç farklı hücrelerden oluşan, öyle ki hücre çizgileri üzerinde avantajlara sahip ve daha iyi bunlar, in vivo 8 elde edilir organı taklit eder. süreç sonunda farklı uyaranlara altında bağırsak epiteli yanıtını değerlendirmek için değerli bir araç olduğunu kanıtlamıştır &quot;bir tabak içinde mini gut büyümek&quot;. Bu moleküler desenleri host ve mikrop 9 hem farklı yanıtları düzenleyen gibi mikrobik patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPS) ile primer intestinal hücrelerinin etkileşimi araştıran immünoloji alanında alakalı. Sadece Araştırmacılar şimdi fare organoids bu etkileşimleri keşfetmek, ama onlar yapabilirsinizkuyu 2 olarak insanlardan kültüre olabilir. Bu teknoloji dramatik kişiselleştirilmiş tıp değiştirme potansiyeline sahiptir ve tekniğin yakın gelecekte mümkün hale getirecek ilerlemeler hakkında kurgulanabilir. Bu yöntem genel amacı, çeşitli uyaranlara bir kültür, genişleme için protokol ve barsak organoids bir tedavinin temin edilmesini sağlamaktır. Bu tür uyaranlar aşılar, bakteriyel PAMPS, canlı patojenler, gastrointestinal (Gİ) ve kanser tedavi dan sonuçta uzanabilir. Fare bağırsak organoids izolasyonu ve kültürü Sato ve ark adapte edilmiştir. Bu protokolü takip ederken, son ürün kültürü organoid olmak hala elde edilir orijinal yönteminden hafif sapmalar olmasına rağmen. Bu yöntem, hücre n dayalı bir tahlilin gerçekleştirilmesi dikkate alınmalıdır homojen olmayan hücre yapıları, çalışırken uygun normalizasyonu için yeterli bir teknik tarif odaklanmıştırkoyu kahverengi.

<table><tbody><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050</td><td>(Bölüm 1,3,6) Veya eşdeğer marka</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Santrifüj</td><td>Termo</td><td></td><td>(Bölüm 1,3)</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare</td><td>Sh30243.01</td><td>(Bölüm 1,6) Caco-2 ve HEK293 Rspondin1 hücreleri için</td></tr><tr><td>HEK293T-Rspondin1 salgılayan hücre hattı</td><td></td><td></td><td>(Bölüm 1) Kim, K.A. ve ark. Lentiviral partiküller, özel olarak sipariş edilen ve GeneCopoeia'dan satın alınan bir pReceiver-Lv105 omurgasına klonlanmış RSPO1 (NM_138683) ORF cDNA içeriyordu.</td></tr><tr><td>50 ml konik tüp</td><td>Falcon</td><td>352070</td> <td>(Bölüm 1) Veya eşdeğer marka</td></tr><tr><td>T-175 Flask</td><td>Corning</td><td>431079</td> <td>(Bölüm 1) Veya eşdeğer marka&nbsp;</td></tr><tr><td>Protein Matrisi</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>(Bölüm 2,3,4,5,6) Matrigel Büyüme Faktörü Azaltıldı&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco'nun (DPBS)</td> <td>GE Sağlık</td><td>SH30264.01</td> <td>(Bölüm 2,3)</td></tr> <tr><td>DMEM / F12 &nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12634-010</td> <td>(Bölüm 2,3) Gelişmiş DMEM / F12</td></tr><tr><td>Corning 24 Kuyulu TC Plakaları</td><td>Corning</td><td>3524</td> <td>(Bölüm 2)</td></tr> <tr><td>N2 Eki 100x & nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17502-048</td> <td>(Bölüm 2)</td></tr> <tr><td>A vitamini olmadan B27 50x&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12587-010&nbsp;</td><td>(Bölüm 2)</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15596-026</td> <td>(Bölüm 2)</td></tr> <tr><td>Glutamin Takviyesi (Glutamax)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050-061</td> <td>(Bölüm 2) Gelişmiş DMEM / F12</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td> ile Birleştirilebilir Yaşam <td>Teknolojileri</td><td>15630-080</td> <td>(Bölüm 2) Gelişmiş DMEM / F12 ile Birleştirilebilir;</td></tr><tr><td>10ml Serolojik</td><td>Pipet Falcon</td><td>357551</td><td>(Bölüm 2) Veya muadili marka</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>(Bölüm 2) Stok = 100 mg/ml</td></tr><tr><td>N-Asetil-L-sistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>(Bölüm 2) Stok = 1M</td></tr><tr><td>Rekombinant Fare EGF</td><td>Biolegend</td><td>585608</td><td>(Bölüm 2) Stok = 500 mg/ml</td></tr><tr><td>Rocker Değişken</td><td>Biyoexpres</td><td></td><td>(Bölüm 3)</td></tr><tr><td>diseksiyon makası</td><td></td><td></td><td>(Bölüm 3)</td></tr><tr><td>forseps</td><td></td><td></td><td>(Bölüm 3)</td></tr><tr><td>cam slaytlar</td><td></td><td></td><td>(Bölüm 3)</td></tr><tr><td>diseksiyon cımbızı</td><td></td><td></td><td>(Bölüm 3)</td></tr><tr><td>25 ml Serolojik Pipet</td><td>Falcon</td><td></td><td>(Bölüm 3)</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9821</td> <td>(Bölüm 3) 0.5M veya alternatif TC sınıfı EDTA</td></tr><tr><td>Steril Petri Kabı 100mm x 15mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td> <td>(Bölüm 3) Veya eşit boyutta TC kabı</td></tr><tr><td>1ml Şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td> <td>(Bölüm 4)</td></tr> <tr><td>Hassas Kayma İğnesi</td><td>Becton Dickinson</td><td>305120</td> <td>(Bölüm 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm)</td></tr> <tr><td>Bacillus subtilis'ten Flagellin</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-bsfla&nbsp;</td><td>(Bölüm 5,6)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>19115</td><td>(Bölüm 5,6)&nbsp;( Murray&nbsp; et&nbsp;al.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td> <td>(Bölüm 5,6) Veya eşdeğer marka</td></tr><tr><td>BBL Beyin Kalp İnfüzyonu Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>211065</td> <td>(Bölüm 5)</td></tr> <tr><td>Bacto Beyin Kalp İnfüzyonu</td><td>Becton Dickinson</td><td>237500</td> <td>(Bölüm 5)</td></tr> <tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td> <td>(Bölüm 6)</td></tr> <tr><td>Tripsin ve nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200056</td> <td>(bölüm 6)</td></tr> <tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td> <td>(Bölüm 6)</td></tr> <tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molekül Cihazları</td><td></td> <td>(Bölüm 6)</td></tr> <tr><td>96 Kuyu Tahlil</td><td>Plakası Corning</td><td>3603</td> <td>(Bölüm 6) Siyah Plaka, Şeffaf Alt TC ile muamele</td></tr><tr><td>edilmiş Nükleer Boyama Boya</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>H1399</td> <td>(bölüm 6) Hoechst 33342</td></tr><tr><td>T-75 Şişesi</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>(Bölüm 6) Veya muadili marka</td></tr><tr><td>15 ml konik tüp</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>(Bölüm 1,3) Veya muadili marka</td></tr><tr><td>1.7 ml polipropilen tüp</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td>Veya muadili marka</td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td>Veya muadili marka</td></tr><tr><td>TNF-alpha&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>Mm 00443260_g1</td><td>Taqman gen ekspresyon test kiti</td></tr><tr><td>IL-6&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td> <td>(Mm 00446190_m1</td><td>Taqman gen ekspresyonu test kiti</td></tr><tr><td>IL-1beta</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>Mm 00434228_m1</td><td>Taqman gen ekspresyonu test kiti</td></tr><tr><td>IL-18</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>Mm 00434225_m1</td><td>Taqman gen ekspresyonu test kiti</td></tr><tr><td>18s</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>Hs 99999901_s1</td><td>Taqman gen ekspresyonu test kiti</td></tr><tr><td>7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexus gradyan Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Hızlı Evrensel PCR Master Mix</td><td>Life Teknolojileri</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Life Teknolojileri/Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Optik 96 Kuyulu Reaksiyon Plakası, 0.1 mL</td><td>Yaşam Teknolojileri/Uygulamalı Biyosistemler</td><td></td><td></td>4346907</tr><tr><td>Rekombinant Fare R-Spondin 1 Protein R</td><td>& D Sistemleri</td><td>3474-RS-050</td><td>500 ng/ml</td></tr><tr><td>kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7559</td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; ex vivo</emfare bağırsak organoids ve&gt; kültür ve desen tanıma reseptör uyarım

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primer bağırsak organoids önemli ölçüde mukozal immünoloji alanında etkileme potansiyeline sahip değerli bir model sistem. Ancak, organoid büyüme özelliklerinin karmaşıklığı araştırmacı için önemli uyarılar taşır. Spesifik olarak, her bir organoid büyüme desenler oldukça değişkendir ve kültür epitel hücrelerinin bir heterojen oluşturun. Bu uyarılar, ortak bir doku kültür uygulamaları sadece bağlı hücresel yapının karmaşıklığına organoid sistemine uygulanamaz. Bazı normalizasyon tekniği uygulandığı sürece Sayma ve hücre hatları gibi ayrı ayrı ayrılmış hücreler için ortak olan hücre sayısı, yalnızca dayalı kaplama, organoids için güvenilir bir yöntem değildir. toplam protein içeriğine Normalize bağlı yerleşik protein matrisi karmaşık yapılır. salgılanmış con değerlendirirken hücre sayısı, şekli ve hücre türü açısından Bu özellikler dikkate alınmalıdırorganoid kitleden çadırları. Bu protokol kültürüne basit bir prosedür anahat ve mikrobiyal patojenler ve patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPS) ile ince bağırsak organoids tedavi oluşturuldu. Aynı zamanda protein analizi, böyle bir mücadeleden sonra yapılır iken uygulanmalıdır normalleştirme teknikleri vurgulamaktadır.

bağırsak organoids yetiştirmek için bu protokolü izlerken, karakteristik küre şeklinde organoids hasattan sonra mevcut olacaktır. R-spondin1 koşullu ortamın eklenmesi günlük organoids büyüme ve tomurcuklanmayı başlatacaktır. Organoids büyümesi Şekil 1A gösterilmiştir - F, ve 1, 2, 4, 5, 6 ve günde bağırsak organoids temsili 14. Şekil 1F 14. günde organoids homojen olmayan bir büyüme özelliklerini temsil eder. <p clas...

Burada, hasat korumak ve patojen ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) ve Listeria monocytogenes fare ince bağırsak organoids tedavisi için bir protokol da gen ifadesi ve protein için uygun normalizasyon ağırlıklı olarak, tarif edilmektedir.

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Bu prosedürün genel amacı, toplam hücre sayısına göre normalizasyon tekniklerine vurgu yaparak, patojenik challenge'ın ince bağırsak organoidleri üzerindeki etkilerini ölçmektir. Bu yöntem, bakterilerin intestinal epitelyal hücrelerle olan konakçı-patojen etkileşimlerini in vitro inceleme imkanı sunarak, hem doğal hem de mukozal immünoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedür için kritik öneme sahip olan nokta, ELISA gibi tekniklerle organoid salgılı proteinlerin ölçümü sırasında bir gereklilik olan toplam hücre sayısına göre normalizasyon yöntemidir. Organoid kültürü için fare ince bağırsak kriptlerini toplamak üzere, steril bir lam kullanarak villileri ince bağırsağın lümen yüzeyinden nazikçe kazıyarak başlayın. Ardından, dokuyu 1-2 santimetre uzunluğunda şeritler halinde kesmek için diseksiyon makası kullanın. Şeritleri 10 mL buz soğukluğunda PBS içeren 50 mL'lik konik tüpe yerleştirin. İçeriği nazikçe ters çevirerek karıştırın ve doku içeriğinin tüpün dibine çökmesini bekleyin. Ardından, PBS'yi aspire edin ve şeritleri her seferinde aynı yöntemle, 10 mL taze PBS ile üç kez daha yıkayın. Son yıkamanın sonunda, tüpü on dakika boyunca buz üzerinde tutun. Ardından, PBS'yi 2 mM EDTA ile desteklenmiş 25 mL PBS ile değiştirin ve sallantılı bir platform üzerinde buz kovasında 45 dakika bekletin. İnkübasyon sonunda, doku şeritlerinin tüpün dibine çökmesine izin verin ve PBS-EDTA'yı %10 FBS ile desteklenmiş 10 mL PBS ile değiştirin. Tüpü elle on kez kuvvetlice çalkalayın. Ardından, dokunun tüpün dibine çökmesini bekleyin ve süpernatantı Fraksiyon 1 olarak etiketlenmiş 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Dokuları PBS-FBS içinde beş kez daha çalkalayın. Her seferinde süpernatantı yeni bir fraksiyon tüpüne aktarın. Son çalkalamadan sonra, tüm örnekleri santrifüjleyin ve peletleri, eklenmiş büyüme faktörü içermeyen önceden ısıtılmış 5 mL DMEM/F12 içinde yeniden süspanse edin. Şimdi, örnekleri tekrar santrifüjleyin ve her tüpten 4 mL süpernatant aspire edin. Peletleri kalan son 1 mL besiyerinde yeniden süspanse edin ve kriptleri ve döküntüleri lamlar üzerinde görüntülemek için her fraksiyondan 20 µL'lik alikotlar kullanın. En yüksek kript/döküntü oranını elde etmek için uygun fraksiyonları birleştirdikten sonra, birleştirilmiş fraksiyonları santrifüjleyin ve süpernatantların son 50-100 µL'si hariç tamamını aspire edin. Tüpleri buz üzerinde tutarak, birleştirilmiş fraksiyonlara 1 mL protein matrisi ekleyin ve hava kabarcığı oluşumunu önlemek için yavaşça pipetleyin. Ardından, 50 µL protein matrisi/kript süspansiyonunu 37

the-ex-vivo-culture-pattern-recognition-receptor-stimulation-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Primer fare kolon tümörü organoid kurmak için basit bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem kolon tümör hücreleri hayatta kalmak ve epitel normal bir kolon yok ise, sınırlı büyüme faktörleri içeren ortamlarda organoids içine büyümeye bu özelliği kullanır.

Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür

Geliştirilmiş görüntüleme teknolojisi, gelişim sırasında organların üç boyutlu görüntülenmesine izin veriyor. Burada, fetal fare bağırsağında gelişmekte olan villusların canlı görüntülenmesine izin veren bütün bir organ kültürü sistemini tarif ediyoruz.

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi Ex vivo Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Ince bağırsak crypt organoids kök hücreler ve onların niş bağımlı kriptalarının büyümesini özetlediği bir doku kültürü sistemi sağlamaktır ex vivo kültüre. Primer fare kript organoids gerçek zamanlı olarak metabolik profil tahlil etmek için bir yöntem kurulmuştur. Biz organoids onların kaynağı tarafından tanımlanan fizyolojik özelliklerini muhafaza bulundu.

Metabolik Profil Gerçek Zamanlı Analizi Ex vivo Fare Bağırsak Crypt organoid Kültürleri

Bu video protokolünde, primer intestinal epitel organoidlerinde lentiviral transdüksiyonun ve bu kültürlerin kantitatif RT-PCR, RNA-mikroarray ve immünohistokimya ile işlenmesi ve aşağı akış analizinin adım adım açıklamasını veriyoruz.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Ex vivo organ kültürü, sağlam doku mimarisi bağlamında biyolojik süreçlerin araştırılmasına izin verir. Burada, bağırsakta doğuştan gelen bağışıklığı ve antimikrobiyal konak savunmasını incelemek için kullanılabilecek bir fare kolonunun ex vivo kültür yöntemini tanıtıyoruz.

<em&gt; Ex Vivo</emAntimikrobiyal Konak savunma Çalışmaları&gt; Kolon Organ Kültür ve Kullanımı

Bu makale, ex vivo deneyleri için yeni bir bağırsak organ kültürü sistemi kullanarak konak mikrobiyom etkileşimlerini analiz etmek için benzersiz bir yöntem salamaktadır.

Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Bu protokol, bir klodin-7 nakavt modelinde kolonik kök hücrelerin aktivitesini ve işleyişini incelemek için bir murin kolonik organoid sisteminin kurulmasını açıklamaktadır.

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

Murin ince bağırsak kriptlerini ve kültür bağırsak 3D organoidlerini kriptlerden izole etmek için bir protokol tarif ediyoruz. Ek olarak, bir alt epitelyal hücresel nişin yokluğunda tek bir bağırsak kök hücresinden organoidler üretmek için bir yöntem tarif ediyoruz.

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

Öğrenin, fare ince bağırsak organoidlerinde PAMP ve Listeria monocytogenes ile desen tanıma reseptör uyarımını incelemeyi. Bu yöntem, gen ifadesi ve normalizasyon teknikleriyle bağırsak biyolojisi çalışmalarına katkı sağlar.

Daha fazla video keşfet