18 Mayıs 2016
Burada, hasat korumak ve patojen ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) ve Listeria monocytogenes fare ince bağırsak organoids tedavisi için bir protokol da gen ifadesi ve protein için uygun normalizasyon ağırlıklı olarak, tarif edilmektedir.
Bu prosedürün genel amacı, toplam hücre sayısına göre normalizasyon tekniklerine vurgu yaparak, patojenik challenge'ın ince bağırsak organoidleri üzerindeki etkilerini ölçmektir. Bu yöntem, bakterilerin intestinal epitelyal hücrelerle olan konakçı-patojen etkileşimlerini in vitro inceleme imkanı sunarak, hem doğal hem de mukozal immünoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedür için kritik öneme sahip olan nokta, ELISA gibi tekniklerle organoid salgılı proteinlerin ölçümü sırasında bir gereklilik olan toplam hücre sayısına göre normalizasyon yöntemidir. Organoid kültürü için fare ince bağırsak kriptlerini toplamak üzere, steril bir lam kullanarak villileri ince bağırsağın lümen yüzeyinden nazikçe kazıyarak başlayın. Ardından, dokuyu 1-2 santimetre uzunluğunda şeritler halinde kesmek için diseksiyon makası kullanın. Şeritleri 10 mL buz soğukluğunda PBS içeren 50 mL'lik konik tüpe yerleştirin. İçeriği nazikçe ters çevirerek karıştırın ve doku içeriğinin tüpün dibine çökmesini bekleyin. Ardından, PBS'yi aspire edin ve şeritleri her seferinde aynı yöntemle, 10 mL taze PBS ile üç kez daha yıkayın. Son yıkamanın sonunda, tüpü on dakika boyunca buz üzerinde tutun. Ardından, PBS'yi 2 mM EDTA ile desteklenmiş 25 mL PBS ile değiştirin ve sallantılı bir platform üzerinde buz kovasında 45 dakika bekletin. İnkübasyon sonunda, doku şeritlerinin tüpün dibine çökmesine izin verin ve PBS-EDTA'yı %10 FBS ile desteklenmiş 10 mL PBS ile değiştirin. Tüpü elle on kez kuvvetlice çalkalayın. Ardından, dokunun tüpün dibine çökmesini bekleyin ve süpernatantı Fraksiyon 1 olarak etiketlenmiş 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Dokuları PBS-FBS içinde beş kez daha çalkalayın. Her seferinde süpernatantı yeni bir fraksiyon tüpüne aktarın. Son çalkalamadan sonra, tüm örnekleri santrifüjleyin ve peletleri, eklenmiş büyüme faktörü içermeyen önceden ısıtılmış 5 mL DMEM/F12 içinde yeniden süspanse edin. Şimdi, örnekleri tekrar santrifüjleyin ve her tüpten 4 mL süpernatant aspire edin. Peletleri kalan son 1 mL besiyerinde yeniden süspanse edin ve kriptleri ve döküntüleri lamlar üzerinde görüntülemek için her fraksiyondan 20 µL'lik alikotlar kullanın. En yüksek kript/döküntü oranını elde etmek için uygun fraksiyonları birleştirdikten sonra, birleştirilmiş fraksiyonları santrifüjleyin ve süpernatantların son 50-100 µL'si hariç tamamını aspire edin. Tüpleri buz üzerinde tutarak, birleştirilmiş fraksiyonlara 1 mL protein matrisi ekleyin ve hava kabarcığı oluşumunu önlemek için yavaşça pipetleyin. Ardından, 50 µL protein matrisi/kript süspansiyonunu 37
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, fare ince bağırsak organoidlerinin hasadı, sürdürülmesi ve patojen ilişkili moleküler kalıplar (PAMP'ler) ile Listeria monocytogenes ile tedavisine yönelik bir protokolü açıklamaktadır. Protein analizi için gen ifadesi ve uygun normalizasyon teknikleri üzerinde durulmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Mikrobiyoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Fare ince bağırsak organoidleri, bağırsak biyolojisinin incelenmesi açısından değerlidir.
- Patojenle ilişkili moleküler modeller (PAMP'lar), bağışıklık yanıtlarında rol oynar.
- Gen ekspresyonunun anlaşılması, deneysel sonuçların yorumlanması için kritik öneme sahiptir.
- Normalizasyon teknikleri, doğru protein analizi için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Fare ince bağırsak organoidleri ile çalışma konusunda ayrıntılı bir protokol sunmak.
- PAMP'lerin ve Listeria monocytogenes'in bu organoidler üzerindeki etkilerini incelemek.
- Gen ekspresyon analizinin ve normalizasyonun önemini vurgulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Fare ince bağırsak organoidlerinin hasat edilmesi.
- Organoid kültürlerinin spesifik koşullar altında sürdürülmesi.
- Organoidlerin PAMP'ler ve Listeria monocytogenes ilele tedavi edilmesi.
- Gen ekspresyonu ve protein normalizasyon tekniklerinin analiz edilmesi.
Ana Sonuçlar
- Organoidlerin başarılı bir şekilde bakımı ve tedavisi gerçekleştirildi.
- Tedavi sonrası gen ekspresyonunda değişiklikler gözlemlendi.
- Normalizasyon teknikleri, protein analizinin doğruluğunu artırdı.
- Protokol, bağırsak biyolojisini içeren çeşitli çalışmalara uygulanabilir.
Sonuçlar
- Tanımlanan protokol, intestinal organoidlerin incelenmesi için etkilidir.
- PAMP'ler ve Listeria monocytogenes gen ekspresyonunu önemli ölçüde etkiler.
- Güvenilir sonuçlar için uygun normalizasyon teknikleri kritik öneme sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Alaka
Ex vivo fare bağırsak organoidleri, mukoza dokularındaki konak-patojen etkileşimlerini ve doğal bağışıklık sinyalizasyonunu incelemek için fizyolojik olarak uygun bir sistem sunar. Protokolün toplam hücre sayısına göre normalizasyon üzerindeki vurgusu, heterojen organoid kültürlerinden tekrarlanabilir ve kantitatif veriler elde etmedeki kritik bir zorluğu çözmektedir. Bu yetenek, immünoloji ve mikrobiyom odaklı terapötik programlar için erken keşif ve hedef doğrulamada öngörüsel güvenilirliği desteklemektedir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Primer epitelyal bağlamlarda örüntü tanıma reseptörü yollarının mekanistik sorgulamasını sağlar.
- Kompleks konakçı-patojen etkileşimlerini ex vivo modelleyerek biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Doğuştan gelen bağışıklık modülatörleri için fonksiyonel hedef doğrulamasını kolaylaştırır.
- İmmünoloji varlıklarının geliştirilmesinde öngörü güvenilirliğini artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- İmmünomodülatör bileşiklerin alt akış taramaları için valide edilmiş organoid sistemleri hazırlar.
- Sıkı normalizasyon teknikleri aracılığıyla analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Salgılanan proteinlerin kantitatif ölçümüne olanak tanıyarak güvenilir bileşik değerlendirmesini destekler.
- Platform ölçeklenebilirliğini ve keşif programları genelinde yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel biyobelirteç araştırmaları için hastalıkla ilgili mukozal biyoloji ile uyumludur.
- İmmün ve bariyer fonksiyonu çalışmalarında, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Fizyolojik olarak ilgili epitelyal yanıtları modelleyerek ilerleme kararındaki riskleri azaltır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu protokol, mukoza immünolojisi ve konakçı-mikrop etkileşimi programları için erken hipotez testlerinden öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar olan keşif sürekliliğine entegre edilmiştir.
- Keşif Biyolojisi: Doğuştan gelen bağışıklık sinyalleşmesi ve konakçı-patojen mekanizmalarının hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Organoid analizlerinde salgılanan protein analizleri için tekrarlanabilir, kantitatif okumalar sağlar.
- Analizler: Toplam hücre sayısına göre normalizasyona olanak tanıyarak deneysel koşullar arasındaki karşılaştırılabilirliği artırır.
- Translasyonel Araştırma: Biyobelirteç uyumu için in vitro bulguları in vivo mukozal biyolojiyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: İmmünoloji ve mikrobiyom Ar-Ge portföyleri için yeniden kullanılabilir, organoid tabanlı bir iş akışı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamada öngörücü güveni artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Kompleks organoid sistemlerinde normalizasyon ve kantifikasyonu standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Bilgiye dayalı devam/dur kararlarına ve sermaye açısından verimli portföy ilerlemesine olanak tanır.
- Portföy Etkisi: İmmünoloji ve mikrobiyom varlıklarının riskle uyumlu önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Organoid kültürü ve epitel biyolojisi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Özel doku kültürü ve protein miktar belirleme cihazlarına erişim gerektirir.
- Normalizasyon ve analitik protokollerin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Farklı organoid türleri veya hastalık modelleri için adaptasyon gerektirebilir.
- Organoid büyümesindeki ve matriks bileşimindeki heterojenlik, analiz tekrarlanabilirliğini etkileyebilir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Mus musculus Small Intestinal Crypt Harvest
3:57
Organoid Plating for Pathogen Associated Molecular Patters (PAMP) and L. monocytogenes Challenge
6:58
Results: Representative Mouse Intestinal Organoid Culture and Stimulation
8:29
Conclusion
