Name: İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Keşfedin insan safra sıvısından ekzozom izolasyonu ve mikroRNA profilleme yöntemini. Bu sağlam teknik, karaciğer hastalıkları ve kolanjiokarsinomlar için biyobelirteç keşfine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NIH; to F.M.S.) K08 Ödülü (DK090154-01) ile desteklenmiştir.

endoskopik retrograd kolanjiopankreatografi ile hastaların safra elde edilmesi (ERCP) Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından bir insan denekler çalışma protokolünün onaylanması gerekiyor. Burada sunulan tüm çalışmalar Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylandı. Bile 1. Exosome İzolasyon <ol><li> endoskopik retrograd kolanjiyopankreatografi (ERCP) gerçekleştirin. yatar pozisyonda hastayı ve entübe. <ol><li> Hastanın ağız yoluyla bir duodenoskop Pass ve duodenum ikinci bölümü takın ve büyük papilla belirlemek. </li><li> Seçici bir üçlü lümen 0.035 inç (0.9 mm) hidrofil kılavuz tel ile önceden yüklenmiş sfinkterotom takarak koledok cannulate. </li><li> vesileyle sağ hepatik kanalından kistik kanal ayırt etmek zor olabilir çünkü sol hepatik kanala floroskopi altında kılavuz teli ilerletmek, daha sonra ilerlemekistikrarlı bir pozisyon elde etmek için safra kanalına 5 cm sfinkterotom. </li><li> Luer kilidi sayesinde kılavuz tel bağlantı noktasına 10 ml şırınga takmak, kılavuz teli çıkarın ve negatif basınç 10 ml kullanılarak safra aspire. </li><li> Kılavuz teli reinserting ve safra yolları opaklaşmaz için enjeksiyon portu üzerinden kontrast madde enjekte edilerek ERCP ile devam etmek safra içeren şırınga çıkarın. </li><li> buz üzerinde 15 ml tüp içine toplanmış safra aktarın ve santrifüj adımla devam hazır olana kadar buz üzerinde tutmak. Dikkat: Kendinizi ve örnekleri korumak için eldiven giyin! o Hepatit A virüs partikülleri içerebilir olarak potansiyel infeksiyon kaynağı olarak safra davranın! </li><li> buz üzerinde örnek (ler) tutun. Her iki durumda da, 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 500 x g&#39;de adım 1.2 veya santrifüj ile devam etmek ve daha sonra kullanılana kadar -80 ° C&#39;de dondurun. Not: birkaç yıl bu şekilde depolanmış numuneler rutin iyi sonuçlar 19 kullanılmıştır. </li></ol&gt; </li><li> mikrosantrifüj tüpü içine transferi safra 400 ul ve 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler ve hücre artıkları toplar. </li><li> , Pipetleme süpernatantı taze mikrosantrifüj tüpüne transfer ve daha fazla kalıntı yüzey maddesi temizlemek için 4 ° C&#39;de 20 dakika daha 16,500 x g hızında örnek (ler) santrifüj. biohazard atık tüpleri atın. Alternatif olarak, yerine ultrasantrifüjdeki örnekleri dönerler. </li><li> Süpernatant toplayın ve sol nm 200 daha büyük herhangi bir parçacıkları çıkarmak için bağlayıcı iyi akış hızı ve düşük protein olan 0.2 mikron polyethersulfone (PES) membran filtreden bir şırınga ile bir biyogüvenlik kabini filtre. </li><li> Pipet süzülmüş süpernatant tüpleri ultrasantrifüjdeki ve tüpler fazla 2/3 tam böylece PBS ekleyin. Tüpler daha az likit içeriyorsa, tüpler santrifüj sırasında çökecek! Tüpler, yıkandı, otoklavlanmış ve birkaç kez tekrar edilebilir. </li><li> pellve 4 ° C&#39;de 70 dakika boyunca 120,000 x g&#39;de ultrasantrifugasyon ile eksozomlar. bazen küçük sarı topaklar görmek için ultrasantrifüjdeki tüpün dibinde santrifüj bakmak sonra; Bu eksozomlar bulunmaktadır. </li><li> dikkatli bir şekilde boşaltma yoluyla süpernatan atılır ve% 10 v / v nihai bir konsantrasyona kadar ağartıcı ekleyerek atık dezenfekte ve 20 dakika boyunca bekletildi. </li><li> Alt deneyler için, ya da uygun bir çözelti küçük bir hacme pelet (lar) işleme (örneğin, radyoimmunopresipitasyon analizi (RIPA) Protein izolasyonu, mıR izolasyonu için RNA liziz tamponu için tampon A) ya da fosfat 50-150 ul içinde tekrar süspansiyon tamponlu ya TEM veya nanopartikül optik analizle eksozom hazırlama karakterizasyonu için -80 ileride kullanmak üzere ° C (kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ya da protein çıkarımı vs.) depolanabilir veya kullanılabilir tuz (PBS) . </li></ol> tarafından 2. Exosome KimlikTransmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) ya da cryoEM <ol><li> pipetleme PBS 100 ul dışı kesecikler süspanse. İlk kez izole performans özellikle İdeal olarak, -20 ° C&#39;de saklandı veya edilmemiş -80 ° C eksozomlar kullanımı. </li><li> 2 dakika boyunca 400 meş karbon kaplı Parlodion bakır ızgaralar için 20 ul bir kısım (yaklaşık olarak 2 ug) adsorbe oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> kurutuldu hazırlanması dikkatle damla yerleştirerek oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 1 (h / h), glutaraldehid (EM dereceli) &#39;de eksozom düzeltildi. </li><li> 5 dakika boyunca iki kez su ile ızgaralar yıkayın ve daha sonra 30 saniye boyunca% 1 fosfotungstik asit (PTA) boyanan EVs kontrast. </li><li> 80 kilovolt bir ivme gerilimi 20,000X büyütmelerde başlayan ve parçacıkların boyutu belirlenirken 100,000X için artan bir elektron mikroskobu ile görüntü kazanır. Not: Diğer preparatlarıyla Formvar karbon kaplı 200 örgü bakır veya nikel ızgaraları ve kontrast boyama li üzerine katman gibi10-15 dakika ke% 1 veya% 2 uranil asetat da mümkündür. </li><li> (: 3 oranında 1) cryoEM için, 60 ul protein G altın 10 nm ile 20 | il bir kısım (yaklaşık olarak 2 ug) karıştırılır. Bu exosome çapını belirlemek için yardımcı olacaktır. </li><li> Glow-deşarj C-düz holey karbon ızgaraları üzerine örnekleri aktarın ve blot fazla sıvıyı çıkarın. sıvı etan içine hemen onları batırarak ızgaraları dondurun. </li><li> Sıvı azot içinde cryoholder ızgaraları monte edin. </li><li> 20,000X ve 100,000X büyütmelerde 200 kV görüntü kazanır. </li></ol> Çok parametreli Nanoparçacık Optik analizi ile 3. Exosome Kimlik <ol><li> pipetleme PBS 100 ul izole eksozomlar süspanse. </li><li> çeşitli oranlarda 600 ul PBS içinde eksozomlar sulandırınız (benzeri 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 ile 1: 1,200). </li><li> üreticilerinin göre, gerçek zamanlı olarak uygun bir araç ve yazılım ile lazer ışını tarama ile eksozomlar görselleştirmeRER protokol 20. </li><li> parçacıklar görünür hale gelene kadar sonra parçacıklar düzgün görünmesi için odağı ayarlamak, çekim modunda kameranın düzeyini artırmak. </li><li> standart modda, parçacıklar hala görülebilmektedir en düşük seviyesine kamerayı azaltmak iken gerekli kamera deklanşörü ve kazanç ayarlamak durumunda, bunu başarmak için. </li><li> Görme üniteyi temizlemek ve PBS seyreltme ayarlamak değilse, 20-100 parçacıklar ekranda görünür olduğundan emin olmak için kontrol edin. </li><li> Ardından 30-60 arası sn yakalama süresini ayarlayın. Video çekildikten sonra, tüm partiküller ekranda tanımlanır kadar işleme parametrelerini ayarlamak ve video dosyasını işlemek. </li></ol> Western Blot tarafından 4. Exosome Karakterizasyonu <ol><li> buz soğukluğunda Radyoimmunopresipitasyon tahlilinde 100 ul safra 2-5 mi den Lyse eksozom peletleri (RIPA) pipetleme bir proteaz inhibitörü ile tampon ve aşağı doğru tamamen ve 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırın lizatlarıBir girdap üzerinde etkili bir proteinleri çözünür. </li><li> çoğu zaman gerekli olmasa da, tam parçalama sağlamak için 10 saniye, her 2 darbeleri ile buz üzerinde numunelerin darbe sonikasyon kullanın. </li><li> 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 15,000 x g&#39;de santrifüj ile çözünmeyen malzemenin pelet ve temiz bir tüp süpernatantı aktarın. </li><li> Tercih edilen bir yöntem, üreticinin protokolüne uygun olarak (yani, bisinkoninik asit (BCA) Coomassie, modifiye edilmiş Lowry, 660 nm Protein Deneyi, vs.) protein konsantrasyonunu belirleyin. aynı yöntem kullanılır deneyde mukayese edilebilir sonuçlar elde etmek için sürekli olarak kullanıldığı gibi bir yöntem sürece önemli değildir. </li><li> elektroforezi (PAGE) bir poliakrilamit jel kuyuya 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de örnek ısıtılmasından sonra yükleme Laemmli tamponu içinde örnek başına proteinin 50 ug. </li><li> 1.5 saat PAGE jelleri üzerinde örnekleri Electrophorese bir naylon zara ayrılmıştır proteinleri aktarın. </li><li> Bdaha sonra bir seyreltmede anti-CD63 ve anti-TSG-101 gibi bir eksozom özgü antikorlar ile inkübe 1 saat süre ile% 0.1 Tween 20 (TBS-T) Tris-tamponlu tuzlu su içinde% 5 yağsız süt ile membran (lar) kilidi 1: 500, tercihen O / N 4 ° C&#39;de. </li><li> TBS-T 3 x 10 dk membranları yıkamak, sonra oda sıcaklığında 1-2 saat TBS-T içinde% 5 yağsız süt içinde HRP-konjüge edilmiş ikincil antikor eşleşen uygun olan inkübe edin. </li><li> membran (lar) TBS-T ile 3 x 5 dk yıkayın ve üreticinin protokolüne uygun olarak kemilüminesans reaktifleri ile spesifik proteinlerin algılar. </li><li> Resim film veya üreticinin protokolüne göre bir dijital görüntüleme sistemi ile membranlar. </li></ol> İzole eksozomlar 5. mikroRNA İzolasyon Not: Safra eksozom gelen miRNA&#39;nın izolasyonu piyasada mevcut olan kit göre bir tadil edilmiş MiRNA izolasyon kullanılarak gerçekleştirilir, ancak herhangi bir başka RNA izolasyon yöntemi kullanılabilir veya adapte edilebilir. <ol><li> Ekle 300# 181; l lizis / (400 ul safra izole) exosome pelet, girdap, pipet veya tamamen homojen bir lizat elde etmek eksozomlar lyse bir iğne / şırınga geçmek bina tampon. </li><li> miRNA Homojenat Katkılı 1/10 (30 ul) hacim ekleyin ve karıştırın veya tüp birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın. </li><li> Buz üzerinde 10 dakika süre ile bir karışım inkübe edin. </li><li> asit fenol hacmi ekleyin: Initial Homojenat (300 ul) ile eşit kloroform. </li><li> 30-60 saniye için 5 5 fmol / ul Cel-miR 39 ul ve vorteks ekleyin. </li><li> 10.000 RT, sulu (üst) ayırmak için en xg ve organik (alt) fazlar, 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> transfer hacmi belirterek ederken dikkatli yeni bir tüp pipetle ve transferi ile üst faz aspire. uygun bir organik çöp bidonuna organik faz atın. </li><li> küçük RNA iyice TU vorteks veya çevrilmesi ile geri kazanılan sulu faza 1/3 hacim% 100 etanol eklenir ve karıştırılır zenginleştirmek içinbirkaç kez. </li><li> Pipetleyin bir seferde 700 ul filtre kartuşunun üzerine lizat / etanol karışımı. </li><li> 10,000 x maksimum 15 saniye kartuşları santrifüj veya filtre ile karışımı geçmek vakum uygulayın. </li><li> süzüntü toplamak ve lizat / etanol karışımı 700 ul aşarsa, yeni bir tüp akış yoluyla aktarmak ve tüm süzüntüler toplamak için işlemi tekrarlayın. Bu filtre, küçük RNA&#39;ların yoksun RNA fraksiyonları içeren ve bu büyük RNA&#39;ların kurtarmak için kullanılabilir. </li><li> Toplam süzüntüye RT% 100 etanol 2/3 hacim ekleyin ve vorteks ile iyice karıştırın. </li><li> Pipet ikinci bir filtre kartuşu üzerine filtre ürünü / etanol karışımı. seferde uygulanabilecek maksimum hacim 700 ul gibi önce. </li><li> 10.000 x g&#39;de 15 saniye santrifüj veya adım 5.10 açıklandığı gibi vakum uygulamak. </li><li> akış oranı atın ve filtrelendi süzülen madde / etanol karışımı tüm kadar yineleyin. </li><li> 700 uygula81; filtre kartuşu l miRNA Yıkama Çözeltisi 1, 5-10 sn veya vakum uygulanır ve flow-through atmak için santrifüj. </li><li> Adım 5.16 yapıldığı gibi 500 ul yıkama solüsyonu 2/3 ile filtre yıkayın. </li><li> Adım 5.16 gibi yıkama yıkama solüsyonu 2/3 500 ul ile ikinci kez tekrarlayın flow-through atın ve geri toplama tüpünün filtreyi yerleştirin. </li><li> Filtreden kalan tüm sıvıyı almak için 10,000 x g&#39;de 1 dakika için filtre kartuşunu dönerler. </li><li> taze toplama tüpünün içine filtre kartuşunu aktarın ve filtrenin merkezine sıcak (95 ° C) nükleaz serbest su 100 ul geçerlidir. </li><li> RNA kurtarmak için maksimum hızda 20-30 saniye derlemeler Spin. </li><li> eluat toplayın ve hemen kullanın veya -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol>

<ol><li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+with+immune+modulatory+features+are+present+in+human+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk.</a> J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).</li>
<li>Aushev, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+microRNA+patterns+in+plasma+before+and+after+tumor+removal+reveal+new+biomarkers+of+lung+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma.</a> PLoS One. 8 (10), e78649(2013).</li>
<li>Ben-Dov, I. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+microRNA+as+potential+biomarkers+of+autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease+progression%3A+description+of+miRNA+profiles+at+baseline%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline.</a> PLoS One. 9 (1), e86856(2014).</li>
<li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+current+knowledge+of+their+composition%2C+biological+functions%2C+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li>
<li>Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+mechanisms+and+intercellular+transfer+of+microRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells.</a> J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li>
<li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nat. Commun. 2, 282(2011).</li>
<li>Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+miRNAs+exploiting+the+endosomal-exosomal+pathway+for+intercellular+cross-talk+and+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).</li>
<li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+exosomes+educate+bone+marrow+progenitor+cells+toward+a+pro-metastatic+phenotype+through+MET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET.</a> Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Bessho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+candidate+microRNAs+for+pathogenesis+of+experimental+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia.</a> BMC Syst. Biol. 7, (2013).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).</li>
<li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+microRNA+profile+distinguishes+cholangiocarcinoma+from+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A microRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).</li>
<li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li>
<li>Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+microRNA%3A+a+diagnostic+marker+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer.</a> Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li>
<li>Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+recognition+assay+reveals+prostasomes+as+promising+plasma+biomarkers+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Anticancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer.</a> Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bile+contains+microRNA-laden+extracellular+vesicles+that+can+be+used+for+cholangiocarcinoma+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis.</a> Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).</li>
<li>Gabriel, D. A., Giordano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticle+sizing+and+counting+using+light+scattering+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">Microparticle sizing and counting using light scattering methods.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
</ol>

Yazarların hiçbirinin birbiriyle çatışan mali çıkarları yoktur.

güvenilir safra izole eksozomlar yararlanmak için, karşılığında yüksek kaliteli örnekleri elde etmek için tutarlı, yüksek kaliteli izolasyon yöntemleri kullanılması önemlidir. Bu yazıda tanımlanan metodoloji, insan safra gelen eksozomlar ve miRNA izole etmek köklü bir yoldur. Bu en azından elektron mikroskobu ya da nanoparçacık optik analiz ve Western lekeleri içermelidir izole Eksozomlann karakterizasyonu birkaç önemli adımlar vurgulamaktadır. o miRNA istikrar geldiğinde Eksozomlann izolasy...

Diğer biyolojik yani sıvıların, anne sütü, plazma veya idrar gibi, safra ekzozomlar, lipit zengin veziküller 1-4 içerir. Eksozomlar neden veya alıcı hücreler 5, 6, normal fonksiyon 4, 7-9 bir parçası olabilir, hücre-hücre iletişiminin bir biçimde biyolojik fonksiyonları değiştirebilir. Eksozomlar tanı 10 biyomarkerların değerli bir kaynak sağlayabilir miRNA türlerini içerebilir. miRNA&#39;lar profilleri hastalıkların 11-14 çeşitli tanısal ve prognostik belirteç olarak son yıllarda önemli önem kazanmıştır. miRNA kendisi biyolojik sıvılarda, muhtemelen ölü hücrelerden salınan ve döken hücrelerin miktarı büyük ölçüde altta yatan hastalığa etkilemiş olabilir bulunabilir. Eksozom miRNA profili mutlaka kaynak hücresine 6, 10, 15-17 miRNA profili yansıtmaz, henüz ekzozomlar ebeveyn ce için karakteristik olabilir miRNA imzaları taşıyabilirBir tümör hücresi gibi olacağım. Tümör kaynaklı eksozomlar, akciğer adenokarsinom, prostat kanseri ve diğer tümörlerin 8, 16, 18 olan hastaların plazmasında belirlenmiştir. Bu yöntemin amacı, onların önceki kullanım prosedürleri büyük ölçüde bağımsız insan safra örneklerinden gelen eksozomlann güvenilir ve sağlam izolasyon olduğunu. Böyle kolanjiokarsinomlar 19 olarak safra kanalının hastalıkların potansiyel tanısı için miRNA güvenilir bir kaynak olarak safra kullanmak için geliştirilmiştir. Bu eksozomlar izole etmek hızları artan santrifüj birkaç aşamadan oluşmaktadır ve diğer biyolojik sıvılarda uygulanabilir olabilir.

<table><tbody><tr><td>0.2 ve mikro; m Polietersülfon (PES) membran filtre</td><td>Corning</td><td>431229</td><td></td></tr><tr><td>ince duvarlı poliallomer ultrasantrifüj tüpleri&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>SW40Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LM10-HS&nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanopartikül İzleme Analizi (NTA) yazılımı&nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVANA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Komple Proteaz İnhibitörü</td><td>Roche, Sigma-Aldrich</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon PSQ</td><td>Millipore, Bedford MA</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD63 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tsg101</td><td>Abcam</td><td>ab30871</td><td></td> tarafından dağıtıldı</tr></tbody></table>

İzolasyon ve profil microrna içeren İnsan bile dan ekzozomlar

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

son üç yılda exosome araştırma büyük ölçüde biyomarkerların ve bunların terapötik kullanımları tanımlanması ve karakterizasyonu doğru kapsamını genişletmiştir. Eksozomlar en son microRNA (MIRS) içerdiği gösterilmiştir. MIRS kendileri tanısal amaçlı değerli biyomarkerların olarak ortaya çıkmıştır. klinik ve hastanelerde numune toplama oldukça değişken olduğundan, tüm safra gelen miRNA izolasyon önemli ölçüde değişir. basit bir şekilde toplanan safra örnekleri, sağlam, güvenilir ve tekrar MiRNA profilleri elde etmek için izole etmek ve safradan eksozomlar karakterize etmek için yüksek kaliteli bir protokolünün geliştirilmesi gerekmektedir. yöntem, birkaç santrüfüj ve izole eksozomlar pelet nihai ultrasantrifügasyon adım bir filtre etme adımı gerektirir. Elektron mikroskobu, Western blot, flow sitometri ve çok parametreli nanoparçacık optik analiz, mevcut, e kalitesini doğrulamak için çok önemli karakterizasyon adımlardırxosomes. Örneğin Caenorhabditis elegans gibi bir türden gelen bir spesifik olmayan sentetik miRNA&#39;nın ile lisat spike bu eksozom Mirna izolasyonu için, Cel-miR-39, RNA ekstraksiyon verimi normalleştirilmesi için önemlidir. Bu yöntem aşağıdaki safra sıvısından eksozom izolasyonu başarılı MiRNA -80 ° C&#39;de birkaç yıl boyunca saklanabilir safra örnekleri profil sağlar.

eksozomlar normal mikroskobu ile tespit ya da akış sitometrisi için çok küçük olduğu için, elektron mikroskopisi ya da optik nanopartikül analizi gerçekleştirilmelidir. nanoparçacık optik analizi, aynı zamanda niceliksel ve boyutu dağılımına ve konsantrasyonu sağlar elektron mikroskobu üzerinde bir avantaja sahiptir. alet numune içine cam prizmadan ince odaklanmış lazer ışını tanıttı. İzole veziküllerin Brown hareketi bir EMCCD yüksek hassasiyet kamera ile çekilen ve bir kare-kare bazınd...

Safra sıvısı, potansiyel olarak önemli biyobelirteçler içeren hücre dışı veziküller/eksozomlar için değerli bir kaynaktır. Bu protokol, miRNA profillemesi de dahil olmak üzere daha ileri analizler için eksozomları insan safrasından izole etmek için sağlam bir yöntemi temsil eder.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Bu yöntemin genel amacı, mikroRNA profilleme dahil olmak üzere daha ileri analizler için insan safrasından eksozomları izole etmektir. Bu yöntem, kolanjiyokarsinomlar veya diğer biliyer hastalıklar için belirli bir safra belirtecinin saptanması gibi karaciğer hastalığı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sağlam ve tekrarlanabilir olmasıdır.Endoskopik retrograd kolanjiyopankreatografi veya ERCP gerçekleştirmek için, işleme hastayı sırtüstü pozisyona getirerek başlayın. Entübasyon yapılıp duodenoskop hastanın ağzından geçirildikten sonra, cihazı duodenumun ikinci kısmına yerleştirin ve major papillayı tanımlayın. 0.35 inç veya 0.9 mm'lik hidrofilik bir kılavuz telle önceden yüklenmiş üç lümenli bir sfinkterotom yerleştirerek ortak safra kanalını seçici olarak kanüle edin.Floroskopik rehberlik altında, kılavuz teli sol hepatik kanala ilerletin ve ardından stabil bir pozisyon elde etmek için sfinkterotomu safra kanalının beş santimetre içine ilerletin. Kılavuz teli çıkardıktan sonra, alt kilitleme mekanizması üzerinden kılavuz tel portuna 10 mililitrelik bir şırınga takın ve safrayı aspire etmek için 10 mililitre negatif basınç uygulayın. Safra içeren şırıngayı çıkarın ve kılavuz teli tekrar yerleştirdikten sonra, biliyer ağacı opasifiye etmek için enjeksiyon portundan kontrast madde enjekte edin.Ardından, toplanan safrayı buz üzerinde 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve daha sonra saklayacaksanız, örneği minus 80 degrees Celsius'ta dondurmadan önce 500 times g ve four degrees Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ekzozom izolasyonuna hemen devam etmek için, 400 microliters safrayı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri ve hücre artıklarını toplamak için 300 times g ve four degrees Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı daha fazla temizlemek için, çözeltiyi yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve örnekleri 16, 500 times g ve four degrees Celsius'ta 20 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, bir biyogüvenlik kabininde süpernatantı bir şırınga ile toplayın ve 200 nanometreden büyük kalan tüm partikülleri uzaklaştırmak için 0,2-mikrometrelik bir polietersülfon membran filtreden süzün. Filtrelenmiş süpernatantı ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve santrifüj sırasında tüplerin çökmesini önlemek için PBS kullanarak tüpleri en az üçte iki oranında doldurun. Eksozomları 120.000 ×g ve 4 °C'de 70 dakika boyunca ultrasantrifüjle çöktürün.Eksozomlar küçük, sarı bir pelet içerisinde yer alacaktır. Süpernatantı dikkatlice dekante ederek atın ve atıkları, hacimce %10'luk nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde çamaşır suyu ekleyerek dezenfekte edin. Ardından 20 dakika boyunca bekletin.Sonraki deneyler için, peletleri uygun çözeltinin küçük bir hacminde işleyin veya 50 ila 100 µL PBS içinde yeniden süspanse ederek ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın. Metin protokolüne göre kontrast boyamalı hücre dışı vezikül (EV) ızgaraları hazırladıktan sonra, partiküllerin boyutunu belirlerken 20.000 X büyütme ile başlayıp 100.000 X'e kadar artırarak, 80 kV hızlandırma voltajı kullanan bir elektron mikroskobu ile görüntüler elde edin. Eksozomlar, standart mikroskopi veya akış sitometrisi ile tespit edilemeyecek kadar küçüktür; ancak bu şekil, izole edilmiş bu insan safra örneğinde ortalaması 97 nm olan konsantrasyon ve boyut dağılımını ölçen tipik bir nanoparçacık izleme analizi (NTA) sonuçlarını göstermektedir.Elektron mikroskobu, insan safrasından izole edilen partiküllerin boyutunu doğrulamak için de kullanılabilir ve bu şekil tipik bir transmisyon EM sonucunu göstermektedir. Bu western blotlar, tetraspanin CD63 ve Tsg101 gibi eksozomlarda zenginleşmiş proteinler için analiz edilmiştir. Bu gerçek zamanlı amplifikasyon grafiği, insan safrası eksozomlarından ekstrakte edilen çeşitli mikroRNA türlerini göstermektedir.Eksozomlar 18S veya 28S ribozomal RNA veya housekeeping genler gibi güvenilir standartlardan yoksun olduğu için, normalizasyon için sentetik bir mikroRNA eklenmesi önemlidir. Ekzoz izolasyon tekniği, düzgün şekilde uygulandığında üç saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre dışı vezikülleri izole etmek ve analiz etmek amacıyla hasta veya hayvanlardan safra örneğinin nasıl elde edileceği ve işleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedürü tekrarlarken, ultrasantrifüj işlemini gerçekleştiremiyorsanız, örneği -80 derecede dondurmadan önce 500 G'de ve dört derecede santrifüj etmeyi hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, mikroRNA profilleri gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla mikroRNA çalışmaları gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Safra ile çalışmanın, hepatit içerebileceği için son derece riskli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven ve koruyucu gözlük takmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, kolanjiyokarsinom araştırmaları alanında, PSA obstrüksiyonu gibi biliyer sorunları olan hastalardan alınan safra içerisinde potansiyel biyobelirteç olarak hücre dışı veziküllerin araştırılmasının önünü açmıştır.

isolation-profiling-microrna-containing-exosomes-from-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu kağıt, izolasyon, saflaştırma ve exosomes tespiti, moleküler içerik analizi teknikleri gibi yöntemleri gösteriyor. Bu yöntemler, hücre kültürü medya ve biyolojik sıvılarda exosome izolasyonu için uyarlanabilir ve moleküler içerik analizi ötesinde işlevsel çalışmalarda da yararlı olabilir.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes istikrarlı microRNA (miRNA'lar) varlığı biyolojik olarak ve terapötik müdahale için bir yol olarak potansiyel programı için, hücreler arası iletişim yeni bir mod olarak büyük ilgi üretti. Burada taşınmaları miRNAs tespit etmek kantitatif PCR tarafından takip edilir ve kan kültür ortamından saflaştırılması exosome göstermektedir.

Kan ve Kültür Medya türetilen Exosomes saflaştırılması ve microRNA Profil

Bu protokol, insan serumundan küçük RNA'ların ekstre edilmesi için bir yöntem tarif eder. Biz DNA dizileri kullanmak için kanser serumdan microRNA izole ve aynı zamanda singleplex kantitatif PCR için bu yöntemi kullandık. Protokol yüksek kalitede RNA elde edildi modifikasyonlarla fenol ve guanidinyum tiosiyanat reaktifler kullanır.

Insan serumundan küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar izolasyonu

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) partiküllerinden eksozomları ayırmak için bir gradyan prosedürünü tanımlayan teknikler açıklanmıştır. Bu prosedür, HIV ile enfekte olmuş bireylerden insan plazmasındaki HIV partiküllerinden eksozomları izole etmek için kullanıldı. İzole edilen eksozomlar sitokin / kemokin içeriği açısından analiz edildi.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Bu protokol, dolaşımdaki miRNA'ların kontaminasyonunu önlemek ve NSCLC'deki biyobelirteç özelliklerini değerlendirmek için NSCLC hastalarının plazmasında salınan eksozomlarda miRNA profillemesinin Proteinaz K ve RNAse tedavileri ile ticari bir eksozom izolasyon kiti aracılığıyla gerçekleştirilmesinin fizibilitesini açıklar.

qPCR sayesinde küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK) Hasta Plazma içinde Exosomal miRNA Analizi: Bir Uygulanabilir Sıvı Biyopsi Aracı

MikroRNA'lar önemli bir düzenleyici rol oynar ve çeşitli insan hastalıkları için yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmaktadır. MiRNA'ların yüksek yoğunluklu lipoprotein taşınmaktadır gösterilmiştir. Hızla insan plazmasından MiRNA analizi için uygun, saflaştırılmış HDL izole edilmesi için basit bir yöntem geliştirdik.

Yüksek Saf Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein gelen miRNA Yüksek koymak Through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş Yöntemi

Bu protokol, yüksek yoğunluklu lipoprotein küçük RNA'ların izolasyonunu ve miktar tayinini açıklar.

Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

Kanda bulunan hücre dışı veziküller çeşitli hastalıklar için yeni biyobelirteçler olarak önerilmiştir. Burada, periferik kan örneklerinden büyük plazma zarından türetilmiş mikroparçacıkların izolasyonu ve bunların konvansiyonel akış sitometrisi ve Western Blot ile müteakip analizleri için bir protokol sunuyoruz.

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

Burada, exosomes plazma ve serum exosomal kan proteinleri azaltılmış ortak arıtma ile arındırmak için bir protokol mevcut. En iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı Ultrafiltrasyon, proteaz tedavi ve boyutu dışlama Kromatografi içerir. Exosomes yararları aşağı akım analizleri veziküller ve proteomik karakterizasyonu daha doğru miktar dahil olmak üzere, geliştirilmiş arıtma.

Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Bu iletişim kuralı, hücre kültür ortamından küçük RNA Kütüphane inşaat ve sonraki nesil sıralama ekstraselüler mikroRNA'lar arındırmak gösterilmiştir. Çeşitli kalite kontrol denetim noktaları ne exRNAs gibi düşük giriş örnekleri ile çalışırken olacağını anlamak okuyucuların izin açıklanmıştır.

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

Bir eksozom ilaç teslim taşıyıcıları yeni nesil olduğunu. Bir eksozom yalıtım protokolü ile yüksek verim ve saflık siRNA teslimat için kurduk. Biz de fluorescently etiketli non-spesifik siRNA exosomes kapsüllenir ve siRNA yüklü exosomes kanser hücreleri hücresel alımını araştırıldı.

SiRNA kanser hücrelerinin teslim için Exosomes hazırlanması

Keşfedin insan safra sıvısından ekzozom izolasyonu ve mikroRNA profilleme yöntemini. Bu sağlam teknik, karaciğer hastalıkları ve kolanjiokarsinomlar için biyobelirteç keşfine olanak tanır.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Daha fazla video keşfet