İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Bu yöntemin genel amacı, mikroRNA profillemesi de dahil olmak üzere daha ileri analizler için eksozomları insan safrasından izole etmektir. Bu yöntem, kolanjiokarsinomlar veya diğer safra hastalıkları için belirli bir safra belirtecinin tespiti gibi karaciğer hastalığı alanındaki önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bunun sağlam ve tekrarlanabilir olmasıdır.

Endoskopik retrograd kolanjiyopankreatografi veya ERCP yapmak için hastayı sırtüstü pozisyona getirerek başlayın. Hastanın ağzından bir duodenoskopu entübe ettikten ve geçirdikten sonra, duodenumun ikinci kısmına yerleştirin ve majör papillayı tanımlayın. 0,35 inç veya 0,9 milimetre hidrofilik kılavuz tel ile önceden yüklenmiş üç lümenli bir sfinkterotom yerleştirerek ortak safra kanalını seçici olarak kanüle edin.

Floroskopik rehberliğinde, kılavuz teli sol hepatik kanala ilerletin, ardından stabil bir pozisyon elde etmek için sfinkterotomu safra kanalına beş santimetre ilerletin. Kılavuz teli çıkardıktan sonra, alt kilitten kılavuz tel portuna 10 milimetrelik bir şırınga takın ve safrayı aspire etmek için 10 mililitre negatif basınç kullanın. Safrayı içeren şırıngayı çıkarın ve kılavuz teli yeniden yerleştirdikten sonra, safra ağacını opaklaştırmak için enjeksiyon portundan kontrast madde enjekte edin.

Daha sonra, toplanan safrayı buz üzerinde 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve daha sonra saklanacaksa, eksi 80 santigrat derecede donmadan önce numuneyi 500 kez g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Eksozom izolasyonuna hemen devam etmek için, 400 mikrolitre safrayı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri ve hücre kalıntılarını toplamak için 300 kez g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı daha da temizlemek için, çözeltiyi taze mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve numuneleri 20 dakika boyunca 16, 500 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Daha sonra bir biyogüvenlik kabininde, süpernatanı bir şırıngaya toplayın ve 200 nanometreden daha büyük kalan parçacıkları çıkarmak için 0,2 mikrometrelik bir polietersülfon membran filtresinden süzün. Filtrelenmiş süpernatanı ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve santrifüjleme sırasında tüplerin çökmesini önlemek için tüpleri en az üçte ikisine kadar dolu hale getirmek için PBS kullanın. Eksozomları 70 dakika boyunca 120.000 kez g ve dört santigrat derecede ultrasantrifüjleme yoluyla peletleyin.

Küçük, sarı bir pelet eksozomları içerecektir. Süpernatanı dikkatlice boşaltarak atın ve hacim başına %10'luk bir nihai konsantrasyona kadar ağartıcı ekleyerek atığı dezenfekte edin. Sonra 20 dakika bekletin.

Aşağı akış deneyleri için, peletleri ya küçük bir hacimde uygun çözelti içinde işleyin ya da 50 ila 100 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve ileride kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın. Metin protokolüne göre kontrast lekeli hücre dışı veziküllerin veya EV'lerin ızgaralarını hazırladıktan sonra, parçacıkların boyutunu belirlerken 20.000 X büyütme ile başlayan ve 100.000 X'e kadar artan 80 kilovoltluk bir hızlanma voltajı kullanarak bir elektron mikroskobu ile görüntüler elde edin. Eksozomlar, düzenli mikroskopi veya akış sitometrisi ile tespit edilemeyecek kadar küçüktür; bununla birlikte, bu şekil, bu izole insan safra örneğinde ortalama 97 nanometre olan konsantrasyon ve boyut dağılımını ölçen eksozomların tipik bir nanopartikül izleme analizinin veya NTA'nın sonuçlarını göstermektedir.

Elektron mikroskobu, insan safrasındaki izole parçacıkların boyutunu doğrulamak için de kullanılabilir ve bu şekil tipik bir iletim EM sonucunu gösterir. Bu western lekeleri, tetraspanin CD63 ve Tsg101 gibi eksozomlarda zenginleştirilmiş proteinler için araştırıldı. Bu gerçek zamanlı amplifikasyon grafiği, insan safrasının eksozomlarından ekstrakte edilen çeşitli mikroRNA türlerini gösterir.

Eksozomlar, 18S veya 28S ribozomal RNA veya temizlik genleri gibi güvenilir standartlardan yoksun olduğundan, sentetik bir mikroRNA'nın sivrilmesi normalizasyon için önemlidir. Exos izolasyon tekniği, uygun şekilde yapılırsa üç saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre dışı vezikülleri izole etmek ve analiz etmek için hastalardan veya hayvanlardan safranın nasıl elde edileceğini ve işleneceğini iyi anlamalısınız.

Bu prosedürü geri alırken, ultrasantrifüjlemeye devam edemiyorsanız, eksi 80'de dondurmadan önce numuneyi 500 G'de ve dört derecede santrifüjlemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, mikroRNA profilleri gibi ek soruları yanıtlamak için mikroRNA çalışmaları gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Safra ile çalışmanın hepatit içerebileceğinden son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven ve koruyucu gözlük takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

Geliştirildikten sonra teknik, PSA'nın tıkanması gibi safra problemleri olan hastalardan safrada potansiyel biyobelirteç olarak hücre dışı vezikülleri araştırmak için kolanjiokarsinom araştırmaları alanındaki araştırmaların önünü açtı.