İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Bu yöntemin genel amacı, mikroRNA profilleme dahil olmak üzere daha ileri analizler için insan safrasından eksozomları izole etmektir. Bu yöntem, kolanjiyokarsinomlar veya diğer biliyer hastalıklar için belirli bir safra belirtecinin saptanması gibi karaciğer hastalığı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sağlam ve tekrarlanabilir olmasıdır.

Endoskopik retrograd kolanjiyopankreatografi veya ERCP gerçekleştirmek için, işleme hastayı sırtüstü pozisyona getirerek başlayın. Entübasyon yapılıp duodenoskop hastanın ağzından geçirildikten sonra, cihazı duodenumun ikinci kısmına yerleştirin ve major papillayı tanımlayın. 0.35 inç veya 0.9 mm'lik hidrofilik bir kılavuz telle önceden yüklenmiş üç lümenli bir sfinkterotom yerleştirerek ortak safra kanalını seçici olarak kanüle edin.

Floroskopik rehberlik altında, kılavuz teli sol hepatik kanala ilerletin ve ardından stabil bir pozisyon elde etmek için sfinkterotomu safra kanalının beş santimetre içine ilerletin. Kılavuz teli çıkardıktan sonra, alt kilitleme mekanizması üzerinden kılavuz tel portuna 10 mililitrelik bir şırınga takın ve safrayı aspire etmek için 10 mililitre negatif basınç uygulayın. Safra içeren şırıngayı çıkarın ve kılavuz teli tekrar yerleştirdikten sonra, biliyer ağacı opasifiye etmek için enjeksiyon portundan kontrast madde enjekte edin.

Ardından, toplanan safrayı buz üzerinde 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve daha sonra saklayacaksanız, örneği minus 80 degrees Celsius'ta dondurmadan önce 500 times g ve four degrees Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ekzozom izolasyonuna hemen devam etmek için, 400 microliters safrayı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri ve hücre artıklarını toplamak için 300 times g ve four degrees Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı daha fazla temizlemek için, çözeltiyi yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve örnekleri 16, 500 times g ve four degrees Celsius'ta 20 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, bir biyogüvenlik kabininde süpernatantı bir şırınga ile toplayın ve 200 nanometreden büyük kalan tüm partikülleri uzaklaştırmak için 0,2-mikrometrelik bir polietersülfon membran filtreden süzün. Filtrelenmiş süpernatantı ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve santrifüj sırasında tüplerin çökmesini önlemek için PBS kullanarak tüpleri en az üçte iki oranında doldurun. Eksozomları 120.000 ×g ve 4 °C'de 70 dakika boyunca ultrasantrifüjle çöktürün.

Eksozomlar küçük, sarı bir pelet içerisinde yer alacaktır. Süpernatantı dikkatlice dekante ederek atın ve atıkları, hacimce %10'luk nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde çamaşır suyu ekleyerek dezenfekte edin. Ardından 20 dakika boyunca bekletin.

Sonraki deneyler için, peletleri uygun çözeltinin küçük bir hacminde işleyin veya 50 ila 100 µL PBS içinde yeniden süspanse ederek ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın. Metin protokolüne göre kontrast boyamalı hücre dışı vezikül (EV) ızgaraları hazırladıktan sonra, partiküllerin boyutunu belirlerken 20.000 X büyütme ile başlayıp 100.000 X'e kadar artırarak, 80 kV hızlandırma voltajı kullanan bir elektron mikroskobu ile görüntüler elde edin. Eksozomlar, standart mikroskopi veya akış sitometrisi ile tespit edilemeyecek kadar küçüktür; ancak bu şekil, izole edilmiş bu insan safra örneğinde ortalaması 97 nm olan konsantrasyon ve boyut dağılımını ölçen tipik bir nanoparçacık izleme analizi (NTA) sonuçlarını göstermektedir.

Elektron mikroskobu, insan safrasından izole edilen partiküllerin boyutunu doğrulamak için de kullanılabilir ve bu şekil tipik bir transmisyon EM sonucunu göstermektedir. Bu western blotlar, tetraspanin CD63 ve Tsg101 gibi eksozomlarda zenginleşmiş proteinler için analiz edilmiştir. Bu gerçek zamanlı amplifikasyon grafiği, insan safrası eksozomlarından ekstrakte edilen çeşitli mikroRNA türlerini göstermektedir.

Eksozomlar 18S veya 28S ribozomal RNA veya housekeeping genler gibi güvenilir standartlardan yoksun olduğu için, normalizasyon için sentetik bir mikroRNA eklenmesi önemlidir. Ekzoz izolasyon tekniği, düzgün şekilde uygulandığında üç saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre dışı vezikülleri izole etmek ve analiz etmek amacıyla hasta veya hayvanlardan safra örneğinin nasıl elde edileceği ve işleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu prosedürü tekrarlarken, ultrasantrifüj işlemini gerçekleştiremiyorsanız, örneği -80 derecede dondurmadan önce 500 G'de ve dört derecede santrifüj etmeyi hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, mikroRNA profilleri gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla mikroRNA çalışmaları gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Safra ile çalışmanın, hepatit içerebileceği için son derece riskli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven ve koruyucu gözlük takmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, kolanjiyokarsinom araştırmaları alanında, PSA obstrüksiyonu gibi biliyer sorunları olan hastalardan alınan safra içerisinde potansiyel biyobelirteç olarak hücre dışı veziküllerin araştırılmasının önünü açmıştır.