Name: Meme Kanseri Metastatik Davran Organ spesifik Etkiler incelenmesi için Organ klimalı Medya ve Uygulamaları Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Keşfedin fare lenf nodu, kemik, akciğer ve beyin dokularından organ koşullandırılmış medya üretimini. Bu ex vivo yöntem meme kanseri metastaz davranışını ve organ spesifik faktörleri incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Meme Kanseri Vakfı-Ontario Bölgesi, Kanada İnovasyon Vakfı (No. 13199) tarafından sağlanan hibeler ve Londra Sağlık Bilimleri Vakfı (A.L.A.) aracılığıyla John ve Donna Bristol'den bağışçı desteği ile desteklenmiştir. Ontario Yüksek Lisans Burs programı (Ontario Eyaleti, GMP ve JEC'ye), Kanada Yüksek Lisans Bursu-Yüksek Lisans programı (M.M.P.'ye), Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR)-Stratejik Eğitim Programı (M.M.P., G.M.P ve JEC'ye) ve Londra Bölgesel Kanser Programı'ndaki Pamela Greenaway-Kohlmeier Translasyonel Meme Kanseri Araştırma Birimi (M.M.P.'ye, G.M.P., J.E.C. ve Y.X.). A.L.A., CIHR Yeni Araştırmacı Ödülü ve Ontario Araştırma ve Yenilik Bakanlığı'ndan Erken Araştırmacı Ödülü ile desteklenmektedir.

Tüm hayvan çalışmaları Western University Hayvan Kullanımı Alt Komitesi tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde, Hayvan Bakımı Kanada Konseyi tavsiyeleri doğrultusunda yapılmıştır. 1. Organ izolasyonu (Akciğer, beyin, kemik, lenf nodu) <ol><li> Dört steril 50 ml konik tüp hazırlanması steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) içinde yaklaşık 30 ml ihtiva eden (Her organ için bir izole edilebilir). bir elektronik terazi kullanılarak PBS her tüp önceden tartın. </li><li> CO 2 inhalasyon yoluyla 6-12 haftalık fare Euthanize. 2 dakika veya fare hareket ve nefes durana kadar - Fareler yaklaşık 1 CO 2 odasında bırakılmalıdır. bir parmak ile el kontrol edildiğinde Başarılı ötenazi ayrıca kalp atışı eksikliği ile teyit edilebilir. Bu yöntem koltuk altı lenf düğümleri kaldırarak zorluk giden boyun kan damarları yırtılabilir olarak servikal dislokasyon kaçının. Not: Önceki iş özel kullandısağlıklı kadın çıplak fareler, Hsd: Atimik Nude- Foxn1 nu 13. </li><li> Steril doku kültürü kaputu, bir polistren köpük pedi üzerinde sırtında fare koyun uzuvları yaymak ve yerinde tutmak için işaretçilerine kullanın. </li><li> Steril forseps ve makas kullanılarak, genital de orta hatta karın cildi kesip ağzına doğru yukarı kesti. Yavaşça karın kasları gelen karın cildi geri çekin ve polistren köpük yastığı yerinde pin. </li><li> aksiller, brakial ve kasık lenf düğümleri bulun. Not: Lenf düğümleri genellikle yağ dokusu ile çevrilidir. kasık lenf nodları geri çekti karın cilt üzerinde iki kan damarlarının kavşakta yüzeysel buldum gibi bulmak için en kolay olanıdır. Aksiller ve brakiyal lenf düğümleri doku içinde derin bulunduğu ve doku yumuşak manevra gerektirir. <ol><li> Eğer lenf nodları bulduktan sonra, yavaşça ve dikkatle lenf hiçbir kesmek için makas kullanındes uzakta deri, yağ ve damarlardan ve fare çıkarın. Uygun diseksiyon onaylamak kaldırılan doku üzerinde forseps rulo. doku üzerinde forseps haddeleme zaman sert yumru varsa, o zaman bir lenf nodu olasılıkla başarıyla kaldırıldı. </li><li> buz gibi soğuk PBS çıkarıldı lenf nodları yerleştirin. </li></ol></li><li> forseps ve makas kullanılarak, göğse doğru bir yukarı yönlü hareket maruz karın duvarından keserek karın boşluğuna açın. Dikkatle göğüs boşluğu açığa sternum kesti. </li><li> akciğerlerin altındaki diyafram bulun ve diyaframı kesti. Nedeniyle gerginlik kaburgaların doğru çekmek gerekir. </li><li> alttan akciğerlere kaldırın ve trakea karşı yatan doku kesti. Bu akciğerler göğüs boşluğundan serbestçe çıkarılmasını sağlar. Buz gibi soğuk PBS blokla en place kalp ve akciğerler çıkarın. Kalp akciğerlerde burada ya da sadece 2. Adımda ağırlığında önce kaldırılabilir. </li><li> Kaldırpim, polistiren köpük yastığı yerinde fare tutmak. fareyi ters çevirin ve yan kanadına karşısında alt sırt tüm yol cilt kesti. </li><li> gazlı bez steril bir parçası kullanarak, fare gövdesini tutun fare bacak ve ayakları üzerinde farenin arka cilt soyma. </li><li> steril gazlı bez aynı parça kullanılarak, dikkatli bir şekilde, yerinde alt bacak tutun fare ayak bileği eklemini kırmak ve diz ekleminin doğru proksimal eklem üzerindeki deriyi soyma. </li><li> makas kullanarak, buz gibi soğuk PBS diz eklemi ve yerden serbest tibia çıkarın. </li><li> Tekrarlayın ters ekstremite ile) 1.12) 1.11 yineleyin. </li><li> forseps kullanarak, yerinde femur tutmak makas kullanarak kas dokusu etrafındaki kesip ve buzla soğutulmuş PBS içinde yerleştirerek, femur çıkarın. </li><li> ters bacak ile adımı yineleyin 1.14). </li><li> steril gazlı bez yeni bir parça kullanarak, yerinde farenin kafasını tutun. forseps ve makas kullanarak, yavaşça s maruz cilt kaldırmakKull. makas kullanarak, dikkatle arka beyin ortaya çıkarmak için bir düz ve aşağı çizgide üst merkezden oksipital kafatası kesti. </li><li> forseps kullanarak, öne doğru beynin altında kepçe ve tüm beyin kaldırmak. buz gibi soğuk PBS beyin yerleştirin. </li><li> en az dört fareler adımlarını 1.1) 1.17) tekrarlayın. </li></ol> Tartım 2. Organ <ol><li> Organ izolasyon ardından, elektronik terazi kullanılarak akciğer ve beyin dokusunu içeren her PBS tüpü tartın. </li><li> PBS tüp + organların (akciğer ve beyin) ağırlığı öncesi izolasyon ağırlığını (PBS yalnızca) çıkarılarak ağırlık farkını hesaplayın. </li><li> hesaplanan ağırlık farkı doku parçaları tekrar süspansiyon için gerekli ortamın miktarını belirler. Not: Akciğer ve beyin dokusu, 4 tabanda ise ağırlığı normalize şunlardır: 1: medya dokusu oranı (hacim / ağırlık). </li></ol> Içimize ve BEYNİ koşullu ortamın 3. Nesil <ol><li> steril tSorun kültür davlumbaz, kan içeren organ ve aspirat PBS kalıntı kanı çıkarmak için akciğer ve beyin üç kez içeren PBS tüpler ters. Çözelti kan bulgusu net görünene kadar taze soğuk PBS ile tekrarlayın. </li><li> Ayrı 60 mm 2 cam petri kaplarına akciğerleri ve beyinleri yerleştirin. Doku parçaları boyutu yaklaşık ~ 1 mm 3 kadar tekrar tekrar ileri geri dilimleme iki steril neşter bıçak, kıyma akciğerler veya beyin kullanma. </li><li> Yeniden süspanse doku parçaları uygun hacimde Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) içinde (adım 2.3 önceden belirlenmiş): 1x ile desteklenmiş F12 ortamı mitojen ek ve penisilin (50 ug / ml) / streptomisin (50 ug / mi) konsantre edildi. </li><li> 6 oyuklu plakanın bir oyuğuna yeniden süspanse akciğer veya beyin dokusu parçaları ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 24 saat% 5 CO2 medyada doku parçaları inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir doku ve F ortamla toplamakurther 50 ml konik tüp içinde taze medya üç eşdeğer hacimleri ekleyerek sulandırmak. </li><li> 15 dakika boyunca 4 ° C &#39;de Her organ için seyreltilmiş şartlandınlmış ortam içindeki 1,000 x g&#39;de santrifüjleyin büyük doku çöküntüsü ortadan kaldırılmaktadır. Medya süpernatant toplayın ve 0.22 mikron şırınga filtre ile filtre. </li><li> Havuz her organ medya klimalı (yani., Beyin ile akciğer ve beyin ile akciğer) birden fazla farelerden alınan fare to-fare değişkenliği hesaba. Kısım ve mağaza kullanılana kadar -80 ° C &#39;de ortamla. </li></ol> Kemik İliği klimalı Medya 4. Nesil <ol><li> Steril doku kültürü kaputu, kemik aşırı doku Döşeme ve makasla kemiklerinden epifizine (uç parçaları) çıkarın. </li><li> Her kemiğin merkezi aracılığıyla PBS 1 ml iterek kemiklerin bir 27 ½ G iğne, floş medüller kanalı kullanma. Bu PBS içeren yeni bir tüp içine kemik iliği stromal hücreleri (BMSC) toplamak için izin verecektir. </li><li> 1,00 santrifüj0, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca xg ve iki kez PBS ile BMSC yıkayın. Kemik stromal hücre büyüme ortamı, 20 ml içinde süspanse kemik iliği stromal hücreleri (DMEM: 1X ile desteklenmiş F12 ortamı mitojen ek, penisilin (50 ug / ml) / streptomisin (50 ug / ml) ve% 10 cenin Boven serumu (FBS) konsantre edildi ). </li><li> Plaka, bir T75 şişesi içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş, kemik iliği stromal hücreleri, 10 ml. Not: Her T75 şişesi içinde her 2 farelerinin birleştirin ve plaka hücreleri; dört fareden, iki T75 şişesi (yaklaşık olarak 1 x 10 7 hücre / şişe) ihtiyaç vardır. </li><li> 37 ° C&#39;de 24 saat süre ile, kemik stromal hücre büyüme ortamı içinde kemik iliği stromal hücreleri inkübe ve% 5 CO2. inkübasyonu takiben, her iki T75 şişeler medya kaldırmak ve yeni T75 şişeye koymak, &quot;Floater Flask&quot; olarak bu şişeyi etiketlemek. Önceki 2 matara taze kemik stromal hücre büyüme ortamı ekleyin ve CO 2 37 ° C&#39;de 3 şişeler inkübe ve% 5. </li><li> 7 - Hücreler yaklaşık% 70 confluency (yaklaşık 5 ulaştıktan sonragün) geçiş hücreleri. Bunu yapmak için, orta kaldırmak ve PBS (3 mi, her yıkama) ile iki kez yıkama hücreleri. bu tripsin sağlanması şişenin tüm yüzeyini kaplamaktadır, PBS çıkarın ve tripsin / EDTA solüsyonu 3 ilave edin. Hücreler balon kaldırın sonra (~ 2 - 3 dk),) 3 ml kemik stromal hücre büyüme ortamı ekleyerek trypsinization reaksiyonu durdurun. Santrifüj 900 xg 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca, taze kemik stromal hücre büyüme ortamı, 10 ml ortam ve tekrar süspansiyon hücreleri atın. </li><li> Bütün şişeler ve geçiş 1 Havuz hücreleri: 5 üç yeni T75 şişeleri içine ve 37 ° C &#39;de inkübe etmek ve% 5 CO2. Hücreler bir kez daha% 70 ulaştıktan sonra, adım 4.6 ve havuz ve pasaj tüm yapışık hücreleri ikinci kez tekrarlayın. Yeniden plaka dört T75 balonlarına hücre ve 37 ° C ve% 5 CO2 inkübe edin. Kemik stromal hücre büyüme ortamı tüm adımlar için kullanılmalıdır. </li><li> hücreler kemik stromal hücre toplama medya, izdiham ulaşmak PBS ile hücreler üç kez yıkayın ve eklemek için izin (DMEM: F12 medya + 1x konsantre mitojen supplement + penisilin (50 ug / ml) / streptomisin (ug / ml 50 ug); Bu medya FBS serbest olduğundan emin olduktan 10 ml / T75). 72 saat sonra, kemik iliğinden koşullu ortam toplama, kullanılana kadar -80 ° C de 0.22 mikron filtre, havuz, kısım ve mağaza üzerinden filtre edin. </li><li> İstenirse, daha önce 13 açıklandığı gibi tekniklerle sitometri standart akışını kullanarak fare Sca-1, CD105, CD29 ve CD73, CD44, karşı antikorlar kullanılarak izole kemik iliği stromal hücreleri (BMSC) fenotip onaylayın. </li></ol> Lenf nodu durumunu Medya 5. Nesil <ol><li> Steril doku kültürü kaputu, lenf düğümleri ve aspirat kanlı PBS kalıntı kanı çıkarmak için lenf düğümleri üç kez içeren PBS tüp ters. Çözelti kan bulgusu net görünene kadar taze soğuk PBS ile tekrarlayın. </li><li> 60 mm2 cam Petri kapları içinde lenf düğümleri yerleştirin. art arda Tissu&#39;nun kadar ileri geri dilimleme iki steril neşter bıçak, kıyma lenf düğümleri kullanarakE fragmanları büyüklüğü yaklaşık olarak 1 mm3 bulunmaktadır. </li><li> Konik bir tüp içinde, Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640), penisilin (50 ug / ml) ile takviye edilmiş ortam / streptomisin (50 ug / ml), 5 x 10 5 M, steril β-merkaptoetanol, 10 ml içinde süspanse doku parçaları ( 1.75 ul / 500 mi ortam) ve% 10 FBS. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 900 x g&#39;de santrifüj ve 30 ml ortam tüm hücreleri tekrar süspansiyon. 5 mi ortam / oyuk, 6 oyuklu plaka ekleyin ve 37 ° C&#39;de 7 gün% 5 CO2 inkübe edilir. </li><li> 7 gün kuluçkadan sonra, ortam iptal 5 ml ılık PBS ile yapışmayan hücreler yıkayın ve her bir oyuğa, 5 ml taze ortam ilave edin. Aşama 4.6 de tarif edildiği gibi, tüm hücreleri, - (7 gün, yaklaşık 5) tripsinize havuz, ve geçiş hücreleri konfluansa kadar büyümeye olanak sağlar. 6-iyi levhaya yeniden plaka hücreleri. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> Üç geçiş sonrası, PBS ile üç kez yıkanır ve ekleme, hücreler birleşecek şekilde büyümesine izin 2 ml / yuva DMEM: F12 + 1 xBu ortam FBS serbest sağlamak konsantre mitojen takviyesi ve penisilin (50 ug / ml) / streptomisin (50 ug / ml). kullanılıncaya kadar -80 ° C&#39;de 72 saat, havuz, kısım, ve mağaza sonrası lenf nodu klimalı ortamları toplayın. </li><li> İstenirse, daha önce 13 açıklandığı gibi tekniklerle sitometri standart akışını kullanarak fare CD45 ve gp38, karşı antikorlar kullanılarak izole lenf nodu stromal hücreleri (LNSC) fenotip onaylayın. </li></ol> Kanser Hücreleri Davranış İle İlgili Alt Tahliller için Organ durumunu Medya 6. <ol><li> 5, kanser hücrelerinin metastaz davranışına çözünebilir organa türetilen faktörlerin etkisini belirlemek amacıyla, farklı alt-hücre ve moleküler biyoloji deneyleri gerçekleştirmek için kullanmak - organa koşullu ortam sonra adım 1 &#39;de tarif edildiği gibi oluşturulmuştur. Literatürde (başka bir yerde tarif edilmiştir), standart analizlere örnekler, protein dizileri 13, hücre büyümesi tahlilleridir &lt;sup&gt; 13, hücresel yayılmaya tumorsphere oluşumu 14, 13 deneyleri ve RT-PCR ile 15. Orijinal baz ortamı (organa koşullu ortam üretmek için kullanılır, yani, koşulsuz DMEM. 1x ile takviye F12 ortamı) mitojen ek ve penisilin (50 ug / ml) / streptomisin (50 ug / ml konsantre bir negatif kontrol olarak kullanılmalıdır . </li></ol>

<ol><li>Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2015.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organ+microenvironment+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The organ microenvironment and cancer metastasis.</a> Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).</li>
<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li>
<li>Kennecke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+behavior+of+breast+cancer+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Metastatic behavior of breast cancer subtypes.</a> J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Ewing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+Diseases%3A+A+Treatise+on+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors.</a> Am J Med Sci. 176 (2), 278(1928).</li>
<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast.+1889%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889.</a> Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).</li>
<li>Weiss, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comments+on+hematogenous+metastatic+patterns+in+humans+as+revealed+by+autopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy.</a> Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).</li>
<li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).</li>
<li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Chu, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-Derived+Factors+Mediate+Breast+Cancer+Cell+Migration+through+CD44+Receptor-Ligand+Interactions+in+a+Novel+Ex+Vivo+System+for+Analysis+of+Organ-Specific+Soluble+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins.</a> Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).</li>
<li>Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).</li>
<li>Deepak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+PCR%3A+Revolutionizing+Detection+and+Expression+Analysis+of+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes.</a> Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).</li>
<li>Hammerschmidt, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+mesenteric+lymph+node+cells+are+essential+for+the+generation+of+gut-homing+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo.</a> J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Baddoo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+murine+bone+marrow+by+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection.</a> J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).</li>
<li>Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFurger%2C+KA+%22Curr+Mol+Med%22">Curr Mol Med</a>. 1 (5), 621-632 (2001).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+as+breast+cancer+drivers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+induction+of+breast+cancer%3A+inflammation+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Endocr+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion.</a> Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).</li>
<li>Kakinuma, T., Hwang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines%2C+chemokine+receptors%2C+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis.</a> J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).</li>
<li>Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemokines and cancer.</a> Int J Cancer. 119 (9), 2026-2029 (2006).</li>
<li>Schlesinger, M., Bendas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+cell+adhesion+molecule-1+%28VCAM-1%29--an+increasing+insight+into+its+role+in+tumorigenicity+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis.</a> Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).</li>
<li>Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+endocrine+resistance+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anticancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Autophagy and endocrine resistance in breast cancer.</a> Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).</li>
<li>Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+%28IR%29+and+insulin-like+growth+factor+receptor+1+%28IGF-1R%29+signaling+systems%3A+novel+treatment+strategies+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer.</a> Med Oncol. 31 (1), 805(2014).</li>
<li>Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+role+of+vascular+endothelial+growth+factor+pathway+in+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis.</a> Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).</li>
<li>Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+functional+TSLP+receptors+mitigates+Th2+polarization+and+the+establishment+and+growth+of+4T1+primary+breast+tumours+but+has+different+effects+on+tumour+quantities+in+the+lung+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain.</a> Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).</li>
<li>Chambers, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+in+tumor+metastasis%3A+new+concepts+from+intravital+videomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy.</a> Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).</li>
<li>Chiang, A. C., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of metastasis.</a> N Engl J Med. 359 (26), 2814-2823 (2008).</li>
<li>Gupta, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+site-specific+metastasis+genes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying site-specific metastasis genes and functions.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).</li>
<li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).</li>
<li>Psaila, B., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metastatic+niche%3A+adapting+the+foreign+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The metastatic niche: adapting the foreign soil.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).</li>
<li>Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+factors+secreted+by+mesenchymal+stromal+cells+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair.</a> J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Metastaz hücresel bir dizi etkinlik doku invazyonu ve uzak tümör kurulması 4,30,31 sonuçta sorumlu olduğu bir karmaşık bir süreçtir. Bu organın belirli bir organ ( &quot;getting there&quot;) ve büyüme ( &quot;Orada büyüyen&quot;) kanser hücresi güdümlü ya da göç: Burada sunulan ex vivo model sistem metastatik ilerlemesi iki önemli yönlerini incelemek için kullanılabilir. Birçok çalışma, daha önce metastaz sürecine katkıda kanser hücrelerinin kendileri ile ilgili anahtar moleküler özelliklerinin belir...

Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanserdir ve kansere bağlı ölümlerin 1 ikinci önde gelen nedenidir. Meme kanserinin yüksek ölüm oranı azaltmak ve metastatik hastalığı ortadan kaldırmak için konvansiyonel tedavinin başarısızlığı kaynaklanmaktadır; kansere bağlı ölümlerin yaklaşık% 90 metastazı 2 kaynaklanmaktadır. Metastatik kaskad altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması erken ve geç evre meme kanserinde hem de etkili tedavilerin gelişmesine için her şeyden önemlidir. Geçmiş araştırmalar meme kanseri metastazı çok adımlı doğasını aydınlatmak yardımcı oldu ve hem kanser progresyonu ve metastaz sonucu kanser hücreleri ve ana bilgisayar ortamında 3 arasındaki etkileşim üzerine büyük ölçüde bağımlı olduğu varsayılmaktadır. Klinik gözlemler, birçok kanser yani organ tropizmini görüntüler olduğunu göstermektedir., Eğilim tercihli cas organs.In özel metastazMeme kanseri, e, hastanın hastalığı genellikle yayılır ya da kemik, akciğer, lenf bezi, karaciğer ve beyinde 4-6 olmak üzere 5 ana sitelerine, metastaz. Birçok teori bu süreci açıklamak için geliştirilmiştir, ama sadece birkaç zaman test dayanmış. 1920&#39;lerde önerilen metastaz Ewing teorisi, metastaz thatthe dağılımı mekanik faktörler kesinlikle nedeniyle hipotezi; Tümör hücrelerinin normal tanımlanan fizyolojik kan akışı desenleri ile vücuda taşınır ve sadece birinci kılcal yatakta tutuklama sayede onlar 7 karşılaşıyoruz. Buna karşılık, Stephen Paget 1889 &quot;tohum ve toprak&quot; hipotezi ek moleküler etkileşimler hayatta kalma ve metastaz büyümesi, kanser hücreleri ( &quot;tohum&quot;) Sadece kendilerini kurmak sayede uygun moleküler faktörler üretmek proliferatein organı mikroçevrelerde ( &quot;toprak sorumlu olduğunu öne &quot;) 8. Neredeyse bir yüzyıl sonra, Leonard Weiss altındaDaha önce yayınlanmış otopsi verileri bir meta-analiz aldı ve otopsi sırasında tespit edilen birçok metastatik tümörler metastatik bir organ tropizm yalnız kan akımı desenleri ile belirlenmiştir eğer beklenen beklenen oranlarda bulunduğunu Ewing tahminini doğruladı. Ancak, manyinstances sonra Ewing önerdiği mekanik faktörler 9 tarafından beklenen bazı sitelere oluşan az veya daha fazla metastaz vardı. Bu hesaplar ve teoriler spesifik organ microenvironments yaygınlaştırma desen ve meme kanseri gibi birçok kanser, sonraki büyüme ve hayatta kalma kritik bir rol oynadığını düşündürmektedir. Geçmiş araştırma çabaları çoğunlukla tümör hücresi kaynaklı faktörlere odaklanmış ve meme kanseri metastazı 10-12 gözlenen Organ tropizm katkıları, organ mikroçevresinin türetilmiş ancak az araştırma araştırdı faktörler kurulması için elverişli bir niş sağlayabileceğinigöğüs kanseri metastazlarının. Bu in vitro organ mikroçevresinin bileşenlerini okuyan teknik sorunlar büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Mevcut madde, insan meme kanseri hücrelerinin, metastatik davranışına lenf nodülü, kemik, akciğer, beyin çözünür bileşenlerin etkisini incelemek için geniş kapsamlı bir ex vivo model sistemi tarif edilir. Daha önce yapılan çalışmalar, farklı meme kanseri hücre çizgileri in vivo metastatik potansiyelin 13 tekabül organa koşullanmış ortama karşılık olarak hücre hattı spesifik ve organ spesifik malign davranış gösteren göstererek, bu model sistem onaylamıştır. Bu model sistemi, tanımlamak ve meme ve büyümesi, göçü ile ilgili etkiler de dahil olmak üzere, kanser hücrelerinin diğer türlerine, metastatik davranışında önemli bir rol oynayabilir spesifik organ türetilen çözünür faktörleri değerlendirmek, davranış ve gen ekspresyonu gibi kök için kullanılabilir yanı tespiti olarakkanseri için potansiyel yeni tedavi hedefleri. Bu ayrıntılı olarak organ-spesifik metastatik davranışlarını incelemek için ve kanser metastazı sürecini sürüş organ kaynaklı çözünür faktörlerin rolünü değerlendirmek için kullanılabilecek ilk ex vivo model sistemidir.

<table><tbody><tr><td>50 ml konik tüpler</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>339652</td><td>Steril tutun</td></tr><tr><td>1x Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Çıplak fareleri</td> saklayın <td>Harlan Laboratories</td><td>Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu</td><td>6 - 12 haftalık yaşta kullanın</td></tr><tr><td>Polistiren köpük ped</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Bir polistiren köpük nakliye konteynerinin atılan kapağı (~ 4 x 8 inç veya daha büyük) bu amaç için kullanılabilir. Etanol ile silerek sterilize edin.</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11050-10</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Tutun Makas</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td>14058-11</td> Gazlı bezleri <td>steril tutun</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td>Steril tutun</td></tr><tr><td>60 mm 2 cam petri kapları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7016560</td><td>Steril tutun</td></tr><tr><td>Neşter bıçakları</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95937A</td><td>Steril</td></tr><tr><td>DMEM: F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21331-020</td><td>37 ° C'de Sıcak Tutun; Kullanmadan önce C su banyosu, steril tutun ve nbsp;</td></tr><tr><td>1x Mito + Serum Genişletici</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td>Makalede "konsantre mitojen takviyesi" olarak anılacaktır. Steril tutun</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td>Steril tutun</td></tr><tr><td>Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11875-093</td><td>37 °C &°C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu, steril tutun ve nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051-500ML</td><td>Steril Tripsin</td></tr><tr><td>/EDTA solüsyonunu</td> koruyun <td>ThermoFisher Scientific</td><td>R-001-100</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu, steril tutun ve nbsp;</td></tr><tr><td>6 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>140675</td><td>Steril tutun</td></tr><tr><td>0.22 & mu; m şırınga filtreleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359904</td><td>Steril</td></tr><tr><td>T75 doku kültürü şişelerini</td> saklayın <td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>178905</td><td></td></tr><tr><td>Transwells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3464</td> steril <td>tutun, migrasyon tahlilleri için kullanın</td></tr><tr><td>Anti-fare Sca-1</td><td>R& D Sistemleri</td><td>FAB1226P</td><td>10 & l / 10 6 hücreleri</td></tr><tr><td>Anti-fare CD105</td><td>R & D Sistemleri</td><td>FAB1320P</td><td>10 & mikroda kullanım; l / 10 6 hücreleri</td></tr><tr><td>Anti-fare CD29</td><td>R& D Sistemleri</td><td>FAB2405P-025</td><td>10 & mikroda kullanın; l / 10 < > 6 hücreleri</td></tr><tr><td>Anti-fare CD73</td><td>R & D Sistemleri</td><td>FAB4488P</td><td>10 & mikro; l/106 hücreleri</td></tr><tr><td>Anti-fare CD44</td><td>R & D Sistemleri</td><td>MAB6127-SP</td><td>0.25 & mikro'da kullanılır; g / 10 6 hücreleri</td></tr><tr><td>Anti-fare CD45</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>5 & mikro'da kullanım; L / 10 6 hücreleri</td></tr><tr><td>Anti-fare gp38</td><td>eBioscience</td><td>12-5381-80</td><td>10 & mikro'da kullanım; L / 10 < > 6 Hücreler</td></tr> <tr><td>ve beta; -Merkaptoetanol & nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&nbsp;</td><td>Steril tutun</td></tr><tr><td>Protein dizileri</td><td>RayBiotech Inc.</td><td>AAM-BLM-1-2</td><td>Ortam koşulu başına (negatif kontrol dahil) üç nüsha halinde 1 dizi kullanın</td></tr></tbody></table>

meme kanseri metastatik davran organ spesifik etkiler incelenmesi için organ klimalı medya ve uygulamaları Üretimi

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

Meme kanseri, meme kanseri hastalarında tercihen lenf bezi, kemik, akciğer, beyin ve karaciğere metastaz yapar. Önceki araştırma çabaları, gözlemlenen bu metastatik paternden (organ tropizmi olarak adlandırılır) sorumlu olan meme kanseri hücrelerine özgü faktörleri belirlemeye odaklanmıştır, ancak bu sürece katkıda bulunan belirli organlarda bulunan faktörler hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Bu kısmen, organ mikro çevresini doğru bir şekilde özetleyen in vitro model sistemlerinin eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Bunu ele almak için, farklı organ mikro ortamlarında bulunan çözünür faktörlerin incelenmesine izin veren bir ex vivo model sistemi kurulmuştur. Bu model, normal atimik çıplak farelerden izole edilen organlardan (lenf nodu, kemik, akciğer ve beyin) şartlandırılmış ortam üretmekten oluşur. Model sistemi, farklı meme kanseri hücre hatlarının, in vivo metastatik potansiyellerine karşılık gelen organ şartlandırılmış ortamlara yanıt olarak hücre hattına özgü ve organa özgü malign davranış sergilediğini göstererek doğrulanmıştır. Bu model sistem, meme ve diğer kanser hücrelerinin metastatik davranışında rol oynayabilecek, büyüme, göç, kök benzeri davranış ve gen ekspresyonu üzerindeki etkiler dahil olmak üzere spesifik organ kaynaklı çözünür faktörleri tanımlamak ve değerlendirmek için kullanılabilir. Bu, organa özgü metastatik davranışı ayrıntılı olarak incelemek ve kanser metastazı sürecini yönlendirmede organdan türetilmiş çözünür faktörlerin rolünü değerlendirmek için kullanılabilecek ilk ex vivo model sistemidir.

Organ koşullu ortamın oluşturulması Organ izolasyonu ve koşullu ortam üretmede bir genel şema / şeması, Şekil 2&#39;de gösterilen prosedür Örnek fotoğraf görüntüleri, Şekil 1 &#39;de sunulmuştur. Protokol önce gelişme altında olan, karaciğer dahil olduğu not edilmelidir bizim analizde meme kanseri metastazı ortak bir sitedir çünkü. Bununla birlikte, üretilen ve karaciğer taraf...

Bu el yazması, farelerin lenf nodu, kemik, akciğer ve beyninden türetilen organ koşullu ortamlardan oluşan bir ex vivo model sistemi tanımlar. Bu model sistem, organ kaynaklı çözünür faktörleri ve bunların organ tropizmi ve kanser hücrelerinin metastatik davranışı üzerindeki etkilerini belirlemek ve incelemek için kullanılabilir.

Meme Kanseri Metastatik Davran Organ spesifik Etkiler incelenmesi için Organ klimalı Medya ve Uygulamaları Üretimi

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

Bu prosedürün genel amacı, organ kaynaklı çözünür faktörleri ve bunların kanser hücrelerinin metastatik davranışı üzerindeki etkilerini tanımlamak ve incelemek için fare lenf düğümleri, kemikleri, akciğerleri ve beyinleri kullanılarak kondisyonlu ortamlar oluşturmaktır. Bu yöntem, organa özgü faktörlerin kanser hücresi büyümesini, migrasyonunu ve gen ekspresyonunu nasıl etkilediği gibi metastaz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, kanser hücrelerinin fenotipini ve davranışını etkileyen organa özgü in vivo çözünür faktörleri temsil eden, basit bir ex vivo platform sağlar.Lenf düğümlerini izole etmek için, altı ila on iki haftalık bir fareyi steril bir doku kültürü kabinindeki polistiren köpük pedin üzerine yerleştirerek başlayın ve uzuvları açık bir pozisyonda sabitleyin. Ardından, genital bölgeden ağza kadar abdominal deride orta hat boyunca bir insizyon yapmak için pens ve makas kullanın. Sonrasında, deriyi abdominal kaslardan nazikçe ayırın ve diseksiyon pedine iğneleyin.Makas kullanarak lenf düğümlerini deri, yağ ve damarlardan dikkatlice ayırın ve hasat ettikçe düğümleri 30 mililitre buz soğukluğundaki PBS içine yerleştirin. Tüm lenf düğümleri toplandığında, pens ve makas yardımıyla açığa çıkan karın duvarını sternum boyunca yukarı doğru hareketle dikkatlice kesin ve torasik boşluğu açığa çıkarın. Diyaframı kesin.Akciğerleri alttan kaldırın ve trakeaya doğru alttaki dokuyu kesin. Ardından akciğerleri buz soğukluğunda PBS içeren yeni bir kaba aktarın. Kalp, bu adım sırasında veya organ tartımı öncesinde akciğerlerden çıkarılabilir.Bacak kemiklerini toplamak için fareyi yüzüstü pozisyona getirin ve alt sırt kısmındaki deriyi bir yan taraftan diğer yan tarafa kadar kesin. Ardından, gövdeyi, bacakların ve ayakların üzerindeki deriyi tutmak için steril bir gazlı bez parçası kullanın. Aynı gazlı bez parçasını kullanarak, bir ayağın ayak bileği eklemini dikkatlice kırarken alt bacağı tutun ve eklem üzerindeki deriyi dize doğru proksimal olarak soyun.Ardından, makas kullanarak tibia'yı diz ekleminden çıkarın ve bacak kemiğini buz gibi soğuk PBS içerisine yerleştirin. İkinci tibia hasat edildikten sonra, femur'u forseps ile sabit tutun ve çevre kas dokusunu kesmek için makas kullanın. Daha sonra bacak kemiğini buz gibi soğuk PBS içerisine yerleştirin.Beyni hasat etmek için, başı kavramak üzere yeni bir steril gazlı bez parçası kullanın ve kafatası açığa çıkana kadar deriyi makas ve pens yardımıyla nazikçe kaldırın. Ardından, posterior beyni açığa çıkarmak için makas kullanarak oksipital kemiği kafatasının üst orta kısmından düz ve aşağı doğru bir hat şeklinde dikkatlice kesin. Daha sonra, dokunun altından kafatasının anterior kısmına doğru sıyırarak tüm beyni buz gibi soğuk PBS içine aktarın.Akciğer kondisyonlu besiyerini hazırlamak için, organlardaki kalıntı kanı uzaklaştırmak amacıyla akciğer dokusunun bulunduğu tüpleri üç kez altüst edin. Ardından, yıkama çözeltisini taze soğuk PBS ile değiştirin vetuzel solüsyon kandan tamamen arınana kadar işlemi tekrarlayın. Sonrasında, her bir fare için akciğerleri 60 mm²'lik bir cam Petri kabına aktarın ve dokuları ileri geri tekrarlanan dilimleme hareketleriyle kıymak için iki adet steril bistüri ucu kullanın.Doku parçaları yaklaşık bir milimetreküp boyutuna geldiğinde, parçaları antibiyotiklerle desteklenmiş uygun hacimdeki DMEM:F12 medyumunda yeniden süspanse edin ve dokuları, fare başına altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğunda 37 °C ve yüzde beş CO2 altında inkübe edin. 24 saat sonra, her kuyucuğun tüm içeriğini ayrı 50 mL konik tüplere aktarın ve kondisyonlanmış medyumu tüp başına üç eş hacim taze DMEM:F12 medyumu ile seyreltin. Büyük doku kalıntılarını uzaklaştırmak için tüpleri santrifüj edin.Ardından, kondisyonlu ortamı 0.22 mikronluk bir şırınga süzgeci aracılığıyla tek bir 50 milliliter konik tüpe toplayın. Kemik iliği kondisyonlu ortamı oluşturmak için kemikleri steril bir doku kültürü kabinine aktarın ve kemikteki fazla dokuları kesin. Epifizleri çıkarmak için makas kullanın.Ardından, her bir kemiğin medüller boşluğundan bir tüp taze PBS'ye 1 mL PBS geçirmek için 27,5 gauge iğne kullanın. Tüm kemik iliği stromal hücreleri toplandığında, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, peleti %10 fetal bovine serum ile desteklenmiş 20 mL kemik stromal hücre büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve her bir T75 flask başına 10 mL hücre ekimi yapın.Hücreler yaklaşık %70 konfluense ulaştığında, kültürleri üç mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, tripsinin tüm flask yüzeyini kapladığından emin olarak, hücreleri üç mililitre %0,025 trypsin/EDTA çözeltisi ile ayırın. İki ila üç dakika sonra, enzimatik reaksiyonu üç mililitre kemik stromal hücre büyüme ortamı ile durdurun ve hücreleri 50 mililitrelik bir tüpte toplayın.Hücreleri çöktürün. Ardından, pelletini 10 mililitre taze besiyerinde yeniden süspanse edin. Şimdi, %70 konfluense ulaşana kadar hücreleri bir ila beş oranında üç yeni T75 flaskına aktarın.Ardından, hücreleri az önce gösterildiği gibi üç kez PBS ile yıkayın ve kültürleri mitojen ve antibiyotiklerle desteklenmiş serumsuz kemik stromal hücre toplama ortamı ile 72 saat boyunca besleyin. Kültürün üçüncü gününden sonra, ortamları 0,22 mikronluk bir süzgeçten geçirerek birleştirin. Stromal hücreler kültürde adherent olmalıdır; lenf nodu stromal hücre kültürlerinde uzamış ve fibroblastik bir morfoloji, kemik iliği stromal hücre kültürlerinde ise daha küçük ve daha yuvarlak bir morfoloji gözlemlenmelidir.Akış sitometrik analiz, lenf düğümü stromal hücrelerinin büyük ölçüde CD45 negatif ve gp38 pozitif olduğunu doğrulamaktadır. Kemik iliği stromal hücreleri CD-44 ve CD-29 için pozitif, CD-105 ve Sca-1 için zayıf pozitif ve CD-73 için negatif olmalıdır. Farklı genetik arka planlara sahip insan meme kanseri hücreleri, spesifik organ koşullarına doğru farklı göç ve büyüme paternleri sergilemektedir.Örneğin, bu temsili deneyde, kemik arayan 231-BoM varyantı, beyin ve akciğer kondisyonlu ortamlarına kıyasla tercihen kemik iliği kondisyonlu ortamına göç etmektedir. Benzer şekilde, akciğer arayan 231-LM2 varyantı, kemik iliği ve beyin kondisyonlu ortamlarına kıyasla tercihen akciğer kondisyonlu ortamına göç etmektedir. Ayrıca, RT qPCR analizi, parental MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin kemik veya akciğer kondisyonlu ortama maruz kalmasının, meme kanseri hücrelerinin in vivo kemik veya akciğer spesifik metastazları ile ilişkili genlerin yukarı regülasyonunu indüklediğini göstermektedir.Bir kez ustalaşıldığında, doku toplama ve kondisyonlu ortam kurulumları, uygun şekilde gerçekleştirilirse iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Sonraki günlerdeki alt kültürleme adımları günde 15 ila 30 dakika sürer. Bu prosedürler uygulanırken, her şeyin steril tutulmasının önemli olduğunu unutmamak gerekir.Koşullandırılmış besiyeri üretimi sonrası, organa özgü faktörlerin kanser hücresi davranışı üzerindeki etkisine dair ek soruları yanıtlamak için protein dizileri, hücre büyüme ve göç analizleri, tümörsfer oluşumu ve RT-PCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik geliştirildikten sonra, meme kanseri araştırmaları alanındaki araştırmacıların organa özgü metastatik davranışı ex vivo bir model sisteminde incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, farelerin kemik, akciğer ve beyinlerini kullanarak koşullandırılmış besiyerlerinin nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Keskin diseksiyon araçlarıyla çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlem gerçekleştirilirken hassas ve dikkatli diseksiyon teknikleri kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

generation-organ-conditioned-media-applications-for-studying-organ

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, fare karaciğerinden türetilen organ koşullu bir besiyeri üretme yöntemi açıklanmaktadır. Bu model sistem, organ kaynaklı çözünür faktörleri ve bunların organ tropizmi ve kanser hücrelerinin metastatik davranışı üzerindeki etkilerini belirlemek ve incelemek için kullanılabilir.

Organ Şartlandırılmış Ortam: Metastatik Kanser Çalışmaları için Hasat Edilen Organ Hücrelerinden Ortam Üretme

Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids&gt; 6 ay için geçerli kalır.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Protokoller, insan kemik doku eksplantı model sisteminde göğüs kanseri hücre hareketi, çoğalması ve kolonizasyonu çalışmak için tarif edilmiştir.

Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için

Fare meme bezlerinden geliştirilen organoidler ışınlanmış ve epitelyal özellikleri ve immün hücrelerle etkileşimleri değerlendirmek için karakterize edilmiştir. Işınlanmış organoids daha iyi radyal normal dokuda tümör hücre işe neden olabilir hücre hücre etkileşimleri değerlendirmek için kullanılabilir.

Mammary bezlerinden ışınlanmış Organoidlerin büyüme ve karakterizasyonu

Biz prostat tümörü diseksiyon odaklanmak, fare prostat kanseri modellerinin otopsi ve diseksiyon için bir yöntem göstermektedir. Fare prostat tümörü organoidlerin oluşturulması için adım adım bir protokol de sunulmaktadır.

Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi

Epitel ve stromal hücrelerden oluşan ve yerli endometrial dokunun özelliklerini koruyan insan primer endometriyal organoidler oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, rahim dokusu alımından endometrial organoidlerin histolojik işleme yöntemlerini açıklamaktadır.

Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi

Meme bezi, dış miyoepitelyal ve iç luminal epitel hücrelerinden oluşan çift katmanlı bir yapıdır. Sunulan diferansiyel trippsinizasyon kullanarak organoidler hazırlamak için bir protokoldür. Bu verimli yöntem araştırmacılar ayrı ayrı meme bezi formu ve fonksiyonu rollerini ile ilgili soruları keşfetmek için bu iki hücre türleri işlemek için izin verir.

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

El yazması, ortotopik olarak enjekte edilen meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının kurulması ve uzunlamasına büyüme izlemesi için metastatik kaskadının tüm aşamalarında müdahaleye uygun bir metodolojiyi açıklamaktadır.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Bu protokol, diferansiyel santrifüjleme yoluyla primer normal ve tümör meme dokusundan epitel organoidleri üretmek için bir yaklaşımı tartışmaktadır. Ayrıca, gömülü organoidlerin immünofloresan görüntülenmesinin yanı sıra üç boyutlu kültürleme için talimatlar da dahil edilmiştir.

Normal ve tümörlü meme dokusundan fare ve insan epitel organoidlerinin passiz olmadan üretilmesi ve görüntülenmesi

Burada, hasta kaynaklı meme tümörü rezeksiyonlarından veya normal meme dokusundan insan meme organoidlerinin oluşturulması için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Protokol, insan hasta kaynaklı meme organoidlerinin kültürlenmesi, dondurulması ve çözülmesi için kapsamlı adım adım talimatlar sağlar.

Hasta kaynaklı meme organoidlerinin kurulması ve kültürü

Keşfedin fare lenf nodu, kemik, akciğer ve beyin dokularından organ koşullandırılmış medya üretimini. Bu ex vivo yöntem meme kanseri metastaz davranışını ve organ spesifik faktörleri incelemek için kullanılır.

Meme Kanseri Metastatik Davran Organ spesifik Etkiler incelenmesi için Organ klimalı Medya ve Uygulamaları Üretimi

Daha fazla video keşfet