Meme Kanseri Metastatik Davran Organ spesifik Etkiler incelenmesi için Organ klimalı Medya ve Uygulamaları Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, organ kaynaklı çözünür faktörleri ve bunların kanser hücrelerinin metastatik davranışı üzerindeki etkilerini tanımlamak ve incelemek için fare lenf düğümleri, kemikler, akciğerler ve beyinler kullanarak şartlandırılmış ortam oluşturmaktır. Bu yöntem, organa özgü faktörler kanser hücresi büyümesini, göçünü ve gen ekspresyonunu nasıl etkilediği gibi metastaz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, kanser hücrelerinin fenotipini ve davranışını etkileyen organa özgü in vivo çözünür faktörleri temsil eden basit bir ex vivo platform sağlar.

Lenf düğümlerini izole etmek için, altı ila on iki haftalık bir fareyi steril bir doku kültürü başlığındaki polistiren köpük ped üzerine yerleştirerek başlayın ve uzuvları uzanmış bir pozisyonda sabitleyin. Daha sonra, karın derisinde cinsel organdan ağza kadar orta hat kesisi yapmak için forseps ve makas kullanın. Ardından, cildi karın kaslarından nazikçe çekin ve diseksiyon pedine sabitleyin.

Makas kullanarak, lenf düğümlerini deriden, yağdan ve damarlardan dikkatlice çıkarın ve düğümleri hasat edilirken 30 mililitre buz gibi soğuk PBS'ye yerleştirin. Tüm lenf düğümleri toplandığında, göğüs boşluğunu açığa çıkararak sternum boyunca yukarı doğru bir hareketle açıkta kalan karın duvarını dikkatlice kesmek için forseps ve makas kullanın. Diyaframı kesin.

Akciğerleri alttan kaldırın ve alttaki dokuyu trakeaya doğru kesin. Ardından, akciğerleri yeni bir buz gibi soğuk PBS kabına aktarın. Kalp, bu adım sırasında veya organ tartılmasından önce akciğerlerden çıkarılabilir.

Bacak kemiklerini toplamak için, fareyi yüzüstü pozisyona getirin ve cildi alt sırt boyunca yandan yana kesin. Ardından, gövdeyi ve cildi bacakların ve ayakların üzerinden kavramak için steril bir gazlı bez parçası kullanın. Aynı gazlı bez parçasını kullanarak, bir ayağın ayak bileği eklemini dikkatlice kırarken alt bacağınızı tutun ve eklemin üzerindeki cildi proksimal olarak dize doğru soyun.

Daha sonra makas kullanarak kaval kemiğini diz ekleminden çıkarın ve bacak kemiğini buz gibi soğuk PBS'ye yerleştirin. İkinci kaval kemiğini çıkardıktan sonra, uyluk kemiğini forseps ile yerinde tutun ve çevredeki kas dokusunu kesmek için makas kullanın. Ardından bacak kemiğini buz gibi soğuk PBS'ye yerleştirin.

Beyni toplamak için, kafayı kavramak için yeni bir steril gazlı bez parçası kullanın ve kafatasını ortaya çıkarmak için cildi makas ve forseps ile nazikçe çıkarın. Daha sonra, arka beyni ortaya çıkarmak için kafatasının üst merkezinden oksipital kemiği düz ve aşağı doğru bir çizgide dikkatlice temizlemek için makas kullanın. Daha sonra, dokunun altından kafatasının ön kısmına doğru kepçe ile tüm beyni buz gibi soğuk PBS'ye aktarın.

Akciğere şartlandırılmış ortamı oluşturmak için, organlardan kalan kanı çıkarmak için akciğer dokusu tüplerini üç kez ters çevirin. Ardından, yıkamayı taze soğuk PBS ile değiştirin ve salin kansız olana kadar tekrarlayın. Daha sonra, akciğerleri fare başına 60 milimetre karelik bir cam Petri kabına aktarın ve tekrarlanan ileri geri dilimleme ile dokuları kıymak için iki steril neşter bıçağı kullanın.

Doku parçaları yaklaşık bir milimetre küp büyüklüğünde olduğunda, parçaları antibiyotiklerle takviye edilmiş uygun hacimde DMEM: F12 ortamında yeniden süspanse edin ve dokuları fare başına altı oyuklu bir plakanın bir oyuğunda 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2'de inkübe edin. 24 saat sonra, her bir kuyucuğun tüm içeriğini ayrı ayrı 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve şartlandırılmış ortamı tüp başına üç eşdeğer hacimde taze DMEM: F12 ortamı ile seyreltin. Büyük doku kalıntılarını gidermek için tüpleri santrifüjleyin.

Ardından, şartlandırılmış ortamı 0.22 mikronluk bir şırınga süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik tek bir konik tüpe koyun. Kemik iliği şartlandırılmış ortam oluşturmak için, kemikleri steril bir doku kültürü başlığı altına aktarın ve kemikten fazla dokuyu kesin. Epifizleri çıkarmak için makas kullanın.

Ardından, bir mililitre PBS'yi her kemiğin medüller boşluğundan bir taze PBS tüpüne akıtmak için 27 buçuk gauge bir iğne kullanın. Tüm kemik iliği stromal hücreleri toplandığında, hücreleri PBS'de üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, peleti% 10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 20 mililter kemik stromal hücre büyüme ortamında yeniden askıya alın ve T75 şişesi başına 10 mililitre hücre tohumlayın.

Hücreler yaklaşık% 70 birleşmeye ulaştığında, kültürleri üç mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, tripsinin tüm şişe yüzeyini kaplamasına dikkat ederek hücreleri üç mililitre% 0.025 tripsin / EDTA çözeltisi ile ayırın. İki ila üç dakika sonra, enzimatik reaksiyonu üç mililitre kemik stromal hücre büyüme ortamı ile durdurun ve hücreleri 50 mililitrelik bir tüpte toplayın.

Hücreleri aşağı doğru döndürün. Sonra, peleti 10 mililitre taze ortamda tekrar askıya alın. Şimdi, kültürlere bire beş oranında, %70 birleşme oranına ulaşana kadar üç yeni T75 şişesine geçin.

Daha sonra, hücreleri az önce gösterildiği gibi PBS ile üç kez yıkayın ve kültürleri 72 saat boyunca mitojen ve antibiyotiklerle takviye edilmiş serum serbest kemik stromal hücre toplama ortamı ile besleyin. Kültürün üçüncü gününden sonra, medyayı 0.22 mikronluk bir süzgeçten geçirin. Lenf nodu stromal hücre kültürlerinde gözlenen uzamış ve fibroblastik bir morfoloji ve kemik iliği stromal hücre kültürleri tarafından sergilenen daha küçük ve daha yuvarlak bir morfoloji ile stromal hücreler kültürde yapışık olmalıdır.

Flow sitometrik analiz, lenf nodu stromal hücrelerinin büyük ölçüde CD45 negatif ve gp38 pozitif olduğunu doğrular. Kemik iliği stromal hücreleri CD-44 ve CD-29 için pozitif, CD-105 ve Sca-1 için zayıf pozitif ve CD-73 için negatif olmalıdır. Farklı genetik geçmişlere sahip insan meme kanseri hücreleri, belirli organ koşullarına doğru farklı göç ve büyüme modelleri sergiler.

Örneğin, bu temsili deneyde, kemik arayan 231-BoM varyantı, tercihen beyin ve akciğer şartlandırılmış ortam üzerinde kemik iliği şartlandırılmış ortama göç eder. Benzer şekilde, akciğer arayan 231-LM2 varyantı, tercihen kemik iliği ve beyin şartlandırılmış ortam üzerinde akciğer şartlandırılmış ortama göç eder. Ayrıca, RT qPCR analizi, ebeveyn MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin kemik veya akciğer şartlandırılmış ortama maruz kalmasının, in vivo olarak meme kanseri hücrelerinin kemik veya akciğere özgü metastazları ile ilişkili genlerin yukarı regülasyonunu indüklediğini göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, doku toplama ve şartlandırılmış ortam kurulumları, uygun şekilde yapılırsa iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Sonraki günlerde alt kültür adımları günde 15 ila 30 dakika sürer. Bu prosedürleri denerken, her şeyi steril tutmayı unutmamak önemlidir.

Şartlandırılmış besiyeri üretimini takiben, organa özgü faktörlerin kanser hücresi davranışı üzerindeki etkisi hakkında ek soruları yanıtlamak için protein dizileri, hücre büyümesi ve göç deneyleri, tümör küresi oluşumu ve RT-PCR gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, meme kanseri araştırmaları alanındaki araştırmacıların organa özgü metastatik davranışı ex vivo model bir sistemde keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, farelerin kemiklerini, akciğerlerini ve beyinlerini kullanarak koşullu ortamın nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.

Keskin diseksiyon aletleriyle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman kesin ve dikkatli diseksiyon tekniği kullanmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.