Singenik Fare Melanom Hücreleri Enjeksiyon Akciğerler Onların Metastatik Potansiyeli belirleme

Bu prosedürün genel amacı, siyah altı farede metastatik tümörlerin üretimi için bir yöntem göstermektir. Bu yöntem, araştırma ajanlarının akciğerlerdeki bağışıklık tepkisini nasıl etkilediği gibi immünoterapi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, deney metastazı olmasıdır.

Bu nedenle sonuçlar güvenilir ve nispeten tutarlıdır. Başlamak için, yaklaşık% 70 birleşme noktasında olması gereken B16-BL6 melanom hücrelerinin kültürlerini steril bir başlığa yerleştirin. Daha sonra, her yemeğe bir mililitre% 05 tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri bir dakika bekletin.

Bu çözeltiyi aspire ettikten sonra, her plakaya bir mililitre tripsin eklemeye devam edin ve ardından hücreleri inkübatöre geri koyun. 10 dakika sonra, hücreleri steril bir başlığa taşıyın ve her plakaya dört mililitre serum içermeyen RPMI ortamı ekleyin. Daha sonra hücreleri steril bir motorlu pipetle toplayın.

Ejeksiyon iğnesini potansiyel olarak tıkayabilecek kümeleri parçalamak için, pipetin ucunu plakanın altına bastırın ve hücreleri dışarı atın. Bu işlemi birkaç kez tekrarladıktan sonra, hücreleri tekrar toplayın ve bunları 15 militer konik bir tüpe aktarın. Daha sonra hücre süspansiyonunun bir örneğini çıkarın, bir hemositometreye yerleştirin ve hücre yoğunluğunu belirleyin.

Hücre süspansiyonunu dört adet 15 mililitrelik tüpe eşit olarak tahsis edin. Daha sonra tüpleri santrifüjleyin ve ardından süpernatanı boşaltın. Tüplerin her birini farklı hücre yoğunluğu ile etiketlemeye devam edin-0, 0.063, 0.125, 0.25 veya mililitre başına 0.5 milyon hücre.

Daha sonra, bu son konsantrasyonları üretmek için her bir koniye uygun hacimde serum serbest RPMI ekleyin. Bir hemositometre kullanarak istenen hücre yoğunluklarını onaylayın. Daha sonra, her bir süspansiyonun 500 mikrolitresini buz üzerine yerleştirilmiş etiketli 1.8 mililitrelik tüplere ayırın.

Tüm B16-BL6 hücre süspansiyonları hazırlandıktan sonra bir fare seçin. Kuyruğundan tutarak, hayvanı önce arkaya doğru bir sınırlayıcıya yönlendirin. Farenin gövdesi ana haznede ve kuyruğu aparatın dışındayken, hayvanı tutucunun ucuna doğru çekmeye devam edin.

Ardından, tutucu pistonu takın ve fare sabitlenene kadar pistonu itmeye devam edin. Hayvan yerine oturduktan sonra, fareyi yanal kuyruk damarlarından biri yukarı bakacak şekilde 90 derece döndürün. Ardından, farenin kuyruğunun damarın en görünür olduğu tarafını kuvvetlice temizlemek için bir alkollü ped kullanın.

Enjeksiyona hazırlanmak için, önce mililitre süspansiyon başına 0,5 milyon hücrenin 300 mikrolitresini bir şırıngaya toplayın. Daha sonra, şırıngayı ters çevirerek, yan tarafına hafifçe vurarak ve pistonu iterek kabarcıkları çıkarın. Kabarcıklar çıkarıldıktan sonra, şırıngada 250 mikrolitrelik bir son hacim elde etmek için hücre kültürünü çıkarın.

Baskın olmayan el ile fare kuyruğunu uzatmaya devam edin. İşaret parmağı kuyruğun proksimal ucunu yükseltecek ve başparmak distal kısmı bastıracak şekilde tutun. Baskın el ile, iğneyi kuyruğun distal ucuna doğru bir dakika aşağı doğru açıyla damar içine sokun.

Ardından iğneyi daha fazla sokun ve kuyruk damarının açısına uyacak şekilde ayarlayın. İğne kuyruk damarına yaklaşık bir santimetre sokulduktan sonra, şırıngayı sabit tutarken pistonu itmeye başlayın. Gazlı bezi giriş bölgesine doğru tutarak herhangi bir kanamayı durdurun.

Hücre süspansiyonu çıkarıldıktan sonra, iğneyi damardan çıkarın ve atın. Ardından, pistonu sınırlayıcıdan çıkarın ve fareyi bir alıcı kafesine yerleştirin. Bu protokol, yararlı bir metastatik melanom modeli oluşturmak için enjekte edilecek optimal B16-BL6 hücresi sayısını tanımlamayı amaçladı.

Burada, beş farklı hücre yoğunluğunun enjeksiyonundan iki ila üç hafta sonra akciğerlerde oluşan oklarla gösterilen deneysel odaklar gösterilmiştir. Mililitrede 500.000 hücre enjekte edildiğinde, odaklar akciğerleri tamamen kapladı. Burada gösterilen örnekte 102 odak sayılmıştır.

Buna karşılık, akciğerler mililitrede 62.500 hücre veya mililitrede 125.000 hücre enjekte edildiğinde odaklarla seyrek olarak kaplanmıştır. Sırasıyla, bu yoğunluklar bir ve 17 akciğer odak sayısı ile sonuçlandı. Bu yöntem kullanılarak, enjekte edilecek optimal hücre konsantrasyonunun mililitre başına 250.000 hücre olduğu belirlendi.

Bu yoğunluk, yaklaşık 65 odaklı akciğerlerle sonuçlandı, bu da organların ne tamamen örtüldüğü ne de odaklar tarafından çok seyrek olarak kaplandığı bir sayı. Grafikte gösterildiğinde bu verilerin daha fazla numaralandırılması, burada gösterildiği gibi akciğer odakları ile mililitre başına 125.000 hücrenin üzerindeki hücre kültürü yoğunluğu arasında yaklaşık olarak doğrusal bir ilişki olduğunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, fare sayısına bağlı olarak bir saatin altında gerçekleştirilebilir.

Prosedürü denerken, fare başına eşdeğer sayıda hücre enjekte etmeyi denemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, potansiyel tedavilerin ortaya çıkan bir dizi odağı nasıl etkilediği gibi soruları yanıtlamak için ilaç dağıtımı gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kanser araştırmacılarının siyah altı farede melanomdaki metastatik kanserin bileşenlerini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, B16-BL6 hücrelerinin nasıl toplanacağını ve hazırlanacağını, fareleri nasıl dizginleyeceğinizi, iğneleri nasıl hazırlayacağınızı ve her bir kuyruk damarına eşdeğer sayıda hücre enjekte edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Memeli kültürü ve iğneleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve iğne batmalarından kaçınmak ve koruyucu giysiler giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.