Name: İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Öğrenin, memeli veya böcek hücre sistemlerinde ifade edilen virüs benzeri parçacıkları ultrasantrifüjasyonla saflaştırma yöntemini. Bu teknik, aşı hedefleri için viral antijenleri güvenli ve esnek şekilde tanımlamayı kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz maksimum verimlilik ve verim için protokol optimize yardımcı olmuştur Ross laboratuar öncesinde üyelerini kabul etmek istiyoruz.

Grip H3N2 VLP Üretimi 1. Memeli İfade Sistemi <ol><li> Alt klon, daha önce tarif edildiği pTR600 ökaryotik ekspresyon vektörleri, viral yapı glikoproteinlerin hemaglutinin (HA), nöraminidaz (NA) ve insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV) Gag P55. 7 </li><li> Kimyasal yetkili Escherichia coli (örneğin, DH5α) DNA yükseltmek ve üreticinin talimatlarına göre bir plazmid saflaştırma kiti kullanılarak transfeksiyon dereceli plazmid izole. DNA miktarı verim ve kullanıcının ihtiyaçlarına bağlıdır. </li><li> Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de% 10 fetal bovin serumu (FBS) içeren büyüme ortamı içinde bir memeli hücre çizgisi, 293T, koruyun. </li><li> T-150 doku kültürü şişesi şişe aşağıdaki gün tam hücre yapışmasını ve% 85-95 hücre confluency elde şekilde şişeye başına 45-75 x 10 6 hücre içerecek şekilde hücreleri büyür. İstenilen conflu için mikroskop altında hücrelerin kontrol edinEnsi. Not: Yüksek hücre yoğunluğu, tipik olarak, ancak aşırı konfluent yan ürünleri, hücresel atık birikim neden olur ve hücre canlılığı azaltabilir ticari transfeksiyon reaktifleri kullanarak minimum sitotoksik optimal protein elde etmek için önerilmektedir. </li><li> NA: 1: HA 2 transfeksiyon günde 1 DNA bileşimi DNA hücreleri, üreticinin tavsiyelerine uygun olarak lipozom ve DNA karışımı hazırlamak ve transfekte Gag T-150 şişesi başına 40 ug toplam DNA miktarı ile. Her şişe, 20-30 ml bir toplam hacme sahip olacak şekilde, antibiyotikler olmadan, serumsuz transfeksiyon ortamı DNA ve lipozom çözüm seyreltilir. Not: gen yapılarının oranı kullanım optimizasyon gerektirebilir. : 1 oranında Burada gösterilen olmasına rağmen, benzer bir transfeksiyon prosedürü 1 solunum sinsitiyal virüsü (RSV) F ve HIV gag ile işlenmiştir. DENV ve CHIKV tek ekspresyon plazmidleri, T-150 şişesi başına DNA 20 ug toplam uygun e için kullanılanXPression. DNA: transfeksiyon reaktif oranlar kullanıcı optimize edilmiş. Kullanım transfeksiyon yöntemi, temel transfeksiyon ortamı önerilen örneğin polikatyonik lipid transfeksiyon ve böylece ortam hormonlu takviye edilebilir bir azalma ve cenin sığır serumu yokluğunu tavsiye ve serum olmadan büyümesini desteklemek için eser elementler. </li><li> % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de şişeler dönün. 200 ml&#39;lik bir hacme için, 9 T-150 şişelerde. Hücreler VLP&#39;ler hasat güne kadar transfeksiyon kültür ortamında tutulur. </li><li> 72-96 saat sonrası transfeksiyon antijeni bağlı veya mikroskobik muayene ile tahmin edilen hücre canlılığı,% 70-80 düşmüştür zaman sonra hücrelerden Hasat kültür süpernatanı. Başına 50 ml konik tüp içine süpernatan ve hücre kalıntıları topak haline 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g hücreleri aşağı doğru döndürün. Not: yiel olacak yapışık hücrelere taze, önceden ısıtılmış, serumsuz transfeksiyon ortamı ile 3 günlük yüzer değiştirilmesive benzer ya da biraz azaltılmış verim ile VLP&#39;lerinin da ikinci çok kullanıcı tarafından optimize edilmelidir. </li><li> ultrasantrifüj yoluyla çökelme öncesi 0.22 um zar içinden Havuz süpernatan ve filtre. </li><li> % 0.8 hindi ya da memeli kırmızı kan hücreleri kullanılarak standart himeglütinasyon denemesi 14 HA-ifade VLP&#39;lerinin hemaglütinasyon aktivitesini test veya antijen spesifik ELISA ile devam edin. Temsilcisi sonuçları için Şekil 2&#39;ye bakınız. </li></ol> Bakulovirüs / Böcek Hücre Sisteminin Kullanılması 2. CHIK VLP İfade <ol><li> ticari bir bakulovirüs sentezleme sistemi kullanılarak S-27 suşu Chikungunya virüsü kapsidini ve zarf proteinleri (Cı-E3-E2-6K-E1) ifade eden yeniden birleştirici baculovirüs oluşturur. </li><li> 28 ° C &#39;de 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile serumsuz Sf9 büyüme ortamında kültür Spodoptera frugiperda Sf9 hücreleri. Suspens için dönücü şişesi kültürleri başlatmak için 3-5 x 10 5 c / ml kullanınİyon hücre büyümesi. Passage rutin onlar 2-4 x 10 6 c / ml (her 3-4 gün) hücre yoğunlukları ulaştığınızda. </li><li> Bir çok noktalı bir karıştırıcı plaka sistemi 130 rpm&#39;de karıştırılarak döndürücü şişelere süspansiyon kültür Sf9 hücreleri. Doğru havalandırma için, dönen şişeden hiçbir yarısından fazlasını seste kültür hacimleri korumak. </li><li> CHIK VLP&#39;ler ekspresyonu için, 1 enfeksiyon çeşitliliğinde, rekombinan bakülovirüs ile 2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir yoğunlukta Sf9 hücreleri enfekte ve 28 ° C inkübatör geri dönün. Tipik haliyle, 250 mi Sf9 hücreleri ihtiva eden bir ya da iki döndürme şişeleri enfekte etmektedir. Not: Bu yöntemi kullanmak yok iken, Sf9 hücreleri bir çalkalama platformu kullanarak 28 ° C&#39;de çalkalama şişelerinde kültüre olabilir. </li><li> hücre canlılığı,% 70-80 düşmüştür zaman hasat kültürleri 72-96 st post-enfeksiyon sonrası veya üreticinin protokolüne göre mavi Tripan çıkışı ile belirlendiği gibi. Not: Hücreler enfekte ise çoğalmaya devam var3 gün sonrası enfeksiyon (dpi) rekombinant CHIK VLP bakülovirüs ile enfekte edilmiş Sf9 kültürlerinde ~% 80 canlılığı. Bakulovirüs enfekte hücreler görünüş olarak daha büyüktür. Morfoloji da dikdörtgen için yuvarlak değişebilir. bakulovirüs enfeksiyonun geç aşamalarında, hücreler lize başladı. </li><li> şirketinden süspansiyon kültüründen 50 ml konik tüp içine, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücreleri aşağı spin Aktarım kültürleri. </li><li> süpernatantlar toplamak ve Ultrasantrifügasyon yoluyla sedimantasyon önce 0.22 mikron gözenek zarından filtre. </li></ol> VLP / SVPs 3. Çökelme / saflaştırma <ol><li> biyogüvenlik kaput içinde% 70 etanol ile 25 mm x 89 mm üstü açık ultrasantrifüjdeki tüpleri sterilize edin. Etanol kullanılmadan önce kurumadan emin olun. </li><li> Temiz bir tüpe süpernatant 32 ml yükleyin. 25 ml minimal hacim çöküşü ve yetersiz dolu ultrasantrifüjdeki tüplerin zarar görmesini önlemek için tavsiye edilir. </li><li> Dikkatle süpernatanlar zekâ altında yatanPBS h steril 3 ml% 20 gliserol (h / h). Emin tüpler dengeli olduğundan emin olun. </li><li> 4 ° C&#39;de 4 saat boyunca 135,000 x g&#39;de dönerler. </li><li> Süpernatant aspire, pelet sağlanması tüpten çıkarmak değildir. </li><li> Süspanse şiddetle yukarı ve aşağı pipetleme steril PBS ile tüplerin alt kısmında VLP&#39;lerini çöktürülür. PBS miktarı VLPler VLP toplam protein verimi ve alt uygulamalara bağlıdır tekrar süspansiyon gerekiyordu. Tipik olarak, en az 100 | il her VLP pelletini. </li><li> Mağaza örnekleri, uzun süreli depolama için kısa süreli depolama ve -80 ° C&#39;de saklama için 4 ° C. </li></ol> 4. Protein Miktarları ve Spesifik Antijen Verimini belirlenmesi <ol><li> Bu üreticinin protokolü doğrultusunda BCA deneyi olarak, ticari bir protein miktar yöntemi kullanılarak toplam protein içeriği belirlenir. </li><li> spesifik antijen içeriği değerlendirmek için standart antijen ve 2-5 seri dilüsyonları kaplama doğrudan enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) yerine1 &#39;dir; ELISA 96 gözlü düz tabanlı bir plakaya toplam protein örneğinin örn. <ol><li> plaka antijenlerinin varlığını araştırmak ve mikroplaka okuyucusu için tespit absorbans üretilmesi için geleneksel bir ELISA gelişimi alt tabakaların kullanımı, antijene spesifik antikorlar ile takip edin. VLP HA-eksprese eden bir örnek için HA ve ELISA deneyi için temsili sonuçlar için bkz Şekil 2; HA ve NA birçok kombinasyonları muhtemelen ama verimleri HA-NA uyumluluğu 15 üzerine farklı olabilir. Not: Antijen spesifik antikorlar, değişken bir ilişki içindedir ve antikor son uç seyreltme titrasyon VLP ölçümü uygulamadan önce tespit edilmesi önerilmektedir. Ticari antikorlar ELISA&#39;da kullanım için önerilen yoğunlaştırmadan veya seyreltmeden aralıkları, hem de önerilen protokoller vardır. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+virus-like+particles%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).</li>
<li>Jain, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+stabilization+of+recombinant+protein+based+virus-like+particle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2014).</li>
<li>Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+and+pH+stability+-+how+influenza+A+virus+hemagglutinin+affects+host-specific+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engerix-B+package+insert%5BTitle%5D)+AND+%22GlaxoSmithKline%2C+Research+Triangle+Park%2C+NC%22%5BJournal%5D)">Engerix-B package insert.</a> GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).</li>
<li>Giles, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computationally+optimized+hemagglutinin+virus-like+particle+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+that+protect+nonhuman+primates+from+H5N1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection.</a> J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).</li>
<li>Giles, B. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computationally+optimized+broadly+reactive+antigen+%28COBRA%29+based+H5N1+VLP+vaccine+elicits+broadly+reactive+antibodies+in+mice+and+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets.</a> Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).</li>
<li>Green, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C3d+enhancement+of+neutralizing+antibodies+to+measles+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin.</a> Vaccine. 20, 242-248 (2001).</li>
<li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-Clade+Protective+Immune+Responses+to+Influenza+Viruses+with+H5N1+HA+and+NA+Elicited+by+an+Influenza+Virus-Like+Particle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle.</a> PLoS ONE. 3, e1501(2008).</li>
<li>Yondola, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+Capability+of+the+Influenza+Virus+Neuraminidase+Can+Be+Modulated+by+Tetherin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin.</a> J Virol. 85, 2480-2491 (2011).</li>
<li>Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-like+particles+for+antigen+delivery+at+mucosal+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).</li>
<li>Murawski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus-like+particles+containing+respiratory+syncytial+virus+G+protein+induced+protection+in+BALB%2Fc+mice%2C+with+no+evidence+of+immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology.</a> J Virol. 84, 1110-1123 (2010).</li>
<li>Quan, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruslike+particle+vaccine+induces+protection+against+respiratory+syncytial+virus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice.</a> J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).</li>
<li>Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COBRA-Based+Dengue+Tetravalent+Vaccine+Elicits+Neutralizing+Antibodies+Against+All+Four+Dengue+Serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vaccine+Immunotechnology%22%5BJournal%5D)">COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes.</a> J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).</li>
<li>Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).</li>
<li>Mitnaul, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balanced+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Activities+Are+Critical+for+Efficient+Replication+of+Influenza+A+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus.</a> J Virol. 74, 6015-6020 (2000).</li>
<li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+DL+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 463, Academic Press. 191-222 (2009).</li>
<li>Pijlman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enveloped+virus-like+particles+as+vaccines+against+pathogenic+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses.</a> Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).</li>
<li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+crude+virus-like+particle+vaccine+against+HPAI+H5N1+in+chickens+and+its+application+on+DIVA+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Respir+Viruses%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy.</a> Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).</li>
<li>Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+Recommendations+for+Work+with+Influenza+Viruses+Containing+a+Hemagglutinin+from+the+A%2Fgoose%2FGuangdong%2F1%2F96+Lineage.+MMWR.+Recommendations+and+reports+%3A+Morbidity+and+mortality+weekly+report%5BTitle%5D)+AND+%22Recommendations+and+reports+%2F+Centers+for+Disease+Control%22%5BJournal%5D)">Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report.</a> Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz başarıyla SVPs ve çeşitli patojenler için birden fazla yapısal proteinlerden oluşan VLP&#39;lerini ifade ve arındırmak için yukarıda açıklanan teknikler kullandık. Genel olarak, bizim VLP&#39;lerini oluşturmak için memeli ifade sistemleri kullanırlar. Ancak, bizim elimizde, memeli hücre CHIK VLP verimleri düşük türetilmiş. Bir rekombinant bakülovirüs-böcek hücre sistemini kullanarak CHIK VLP verim daha güçlü oldu. Genel olarak, bakulovirüs, böcek hücre sistemleri, kontrol altında ve aynı zamanda bağlı yabancı genler...

Virüs benzeri partiküller (VLP&#39;ler), insan aşılama için onaylanmış bir teknolojidir. Aslında, insan papilloma virüsü (HPV) ve hepatit beta da dahil olmak üzere daha çağdaş lisanslı aşıların, bazı (HepΒ) aşılar bu yaklaşımı kullanır. VLP&#39;ler kendini montaj yapabilen yapısal proteinlerden oluşur. monte parçacıklar viral morfolojileri taklit, ancak enfekte ya da viral genomları eksikliği nedeniyle çoğaltma yapamaz. VLP&#39;ler ifade Prokaryotik ve ökaryotik sistemlerde bir dizi saflaştırılır. -% 28, maya -% 20, bitki -% 9, böcek -% 28, ve memeli -% 15 1 bakteri: literatürün gözden farklı ekspresyon sistemleri aşağıdaki oranlarda istihdam edildiği saptandı. Dikkat çekici bir şekilde, L1 kapsid proteini göre aşılar mayalar (Gardasil) &#39;de ya da bir böcek hücre sistemine (Cervarix) 2 üretilir. HepΒ aşılar Recombivax ve Engerix-Β da mayada üretilir ve HepΒ yüzey antijeninin 3 oluşmaktadır4. Bu montaj için çok sayıda yapısal proteinlerin ko-ifadesini gerektiren VLP&#39;lerini üretilmesi için, memeli ve böcek hücre ifade sistemlerini kullanır. grip virüsü, solunum sinsityal virüs (RSV), dang virüsü (DENV) ve chikungunya virüsü (CHIKV): Çalışmalarımız insan patojenlere karşı tasarımı, üretim ve arıtma VLP-bazlı aşılar üzerinde duruluyor. Bizim yöntemleri birden fazla ekspresyon plazmidleri birden fazla yapısal proteinlerin birlikte ekspresyonu ya da tek bir sentezleme plasmidi (Şekil 1) sağlamak için yeterince esnektir. Daha önce, üretilen ve saflaştırılmış H5N1 VLP&#39;ler insan embriyonik böbrek 293T hücrelerinde 5,6 influenza hemaglutinini (HA), nöraminidaz (NA) ve matris (M + -1) kodlayan plasmidin birlikte ekspresyonundan toplandı. genler, memeli hücrelerinde ekspresyon için kodon-optimize edilmiş ve pTR600, transkripsivonel başlatmak için sitomegalovirüs hemen-erken promoteri artı intron A içeren bir ökaryotik ifade vektörüne klonlanmıştırÖkaryotik ekler ription ve transkripsiyon 7 sonlandırılması için sığır büyüme hormonu poliadenilasyon sinyali. HA, NA (Şekil 1A) ve alternatif bir viral matriks proteini, HIV gag p55, üç plazmid ko-ifadesini kullanan benzer bir yaklaşım, bu çalışmada, insan mevsimsel grip alt H3N2 VLP&#39;lerin üretimi için kullanılmıştır ve elde gösterilmiştir grip parçacıklar 8 olarak benzer büyüklükteki VLP&#39;ler. Influenza aşıları baskın anti-HA antikor ortaya rağmen, grip nöraminidaz eklenmesi transfekte edilmiş hücrelerin 9 ve ayrıca mevcut olmayan ilave imünojenik hedeflerden filizlenen VLP sağlamak için siyalidaz aktivitesi aracılık eder. RSV VLP&#39;lerini üretmek için, aynı zamanda, daha önce tarif edilen ve elektron mikroskopi 6,10 ile karakterize edilen, ayrıca HIV gag ile VLP&#39;lerin oluşumu esnekliğini göstermek için özel olarak RSV yüzeyi glikoproteinleri mevcut prototip aşı tasarım HIV gag ilgisiz bir çekirdek parçası seçilebilir. DiğerleriDaha önce RSV glikoproteinleri Newcastle hastalığı virüsü (NDV), 11 ve influenza matris 12 çeşitli viral bileşenler kullanılarak monte edilebilir sunulması VLP&#39;ler göstermiştir. Tam uzunlukta yüzeyi glikoproteini sekansları, enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile işlevsel bir reseptör bağlanması ve antikor tanıma analizi için gerekli olabilir yerel konformasyonun korumak için bu çalışmada kullanılmıştır. partikülleri oluşturmak için tekli plazmid sentezleme sistemlerinin kullanımı için örnekler DENV ve CHIKV bulunmaktadır. DENV durumunda, bir prM / e yapısal gen sentezleme kasetini 13 içeren tek bir plazmidden 293T hücrelerinde hiçbir kapsid ile subviral parçacıklar (SVPs) üretebilir. vadeli SVP viral yapısal proteinlerin mecliste bir çekirdek veya kapsid proteini eksikliği belirtmek için kullanılır. CHIK VLP&#39;ler da CHIKV yapısal gen kaseti, kodlayan kapsid ve zarf proteinlerini içeren tek bir plazmid kullanılarak üretilebilir veya ibir rekombinan bakulovirüs böcek hücresi ekspresyon (- Cı Şekil 1B) için optimize aynı yapısal gen kasetinin kodlayan enfekte nsect hücreleri. Yukarıda ele alındığı yaklaşımları ifade sonuç daha sonra% 20 gliserol tampon ile ultra-santrifüj yoluyla saflaştırılabilir hücre kültür ortamına VLPler sürüm. Bu yazıda, ifade ve memeli ve böcek hücre sistemleri bu VLP&#39;lerini arındırmak için yöntemler sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Plazmid Maxi Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>L3000075</td><td>Lipofektamin 2000, Lipofektamin 3000</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Ekspresyon Sistemi Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>10359-016</td><td></td></tr><tr><td>Cimarec I 6 çok noktalı karıştırma plakası</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>Polyclear ultrasantrifüj tüpleri</td><td>Seton</td><td>7025</td><td>Ultrasantrifüj ve kova boyutu için uygun tüpleri onaylayın</td></tr><tr><td>Mikro BCA Protein Test Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat sitrat tamponu</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>o-fenilendiamin dihidroklorür ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>0.22 & mu; m vakum filtre üstü (500 ml)</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma</td><td>339741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>10902-096</td><td></td></tr></tbody></table>

İfade ve aşılama için virüs benzeri parçacıkların saflaştırılması

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Virüs benzeri partiküller (VLP&#39;ler) ve subviral parçacıkları (SVPs) canlı patojenlerin kullanımı üzerinde artmış biyo-güvenlik ve kararlılık avantajlar sağlar viral aşı tasarımı için alternatif bir yaklaşım bulunmaktadır. Bulaşıcı olmayan ve kendi kendine montaj VLP&#39;ler canlı patojenlerin veya antijen teslimat için rekombinant viral vektörler için ihtiyaç kalmaz, immünojen olarak yapısal proteinleri sunmak için kullanılır. Bu yazıda, klinik öncesi hayvan testleri gelecekteki uygulamalar için VLP tasarım ve geliştirme farklı aşamalarında göstermektedir. Prosedür, aşağıdaki aşamaları içerir: bir antijen dozu için antijenin bir seçim, seçim hücre hattı, VLPler / SVPs saflaştırılmasında antijenin ekspresyonunu ve miktar tayini. Biz antijenlerinin ifadesi için hem memeli ve böcek hücre çizgilerinin kullanımını göstermektedir ve metodolojileri verimle farklılık gösterilmektedir. sunulan yöntem patojenlerin için geçerli olabilir ve immünojenik str antijenleri değiştirilmesi ile elde edilebilirilgi kullanıcının mikroorganizma uctural proteinleri. VLP&#39;ler ve SVPs antijen karakterizasyonu ve en iyi aşı adaylarının seçimi ile yardımcı olur.

VLP verimleri viral antijen yapısı tasarımı ile değişken idi. Bu protokol, ultra-santrifüj ile yüzer SVP ya da VLPler üretimi ve saflaştırılması için, böcek ve memeli hücreleri kullanımını göstermiştir. DENV prM / e yapısal gen sentezleme kasetleri dört alt tipi, Tablo 1 &#39;de (1-4 olarak çizilmiş) DENV SVPs sürümlerini oluşturmak ve 0.6 ml hacim toplam proteinin 1,1-2,6 mg arasında bir aralığı göstermek için kullanılmıştır. HA için: 2: 1: Üç gen yapıları gerektiren VL...

Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır.

İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

Bu prosedürün genel amacı, memeli veya böcek hücresi ekspresyon sistemleri tarafından eksprese edilen ve salgılanan virüs benzeri partikülleri veya VLP'leri saflaştırmaktır. Bu yöntem, konformasyonel açıdan ilgili viral antijenlerin güvenli ve esnek bir şekilde nasıl eksprese edileceği ve saflaştırılacağı gibi vaksinoloji alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, VLP'leri konsantre etmek için polietilen glikol kullanarak protein çöktürme veya birden fazla yoğunluk katmanı hazırlama gereksinimini ortadan kaldırmasıdır.Bu yöntem, viral antijenlerin aşı hedefleri olarak belirlenmesine dair içgörü sağlayabilse de VLP'ler aynı zamanda hastalık teşhisi ve seroloji için araçlar olarak da kullanılabilir. VLP resüspansiyon adımlarındaki gliserol alt tabaka kullanımı, yeni başlayanlar uygun tekniği uygulamada zorlanabildiği için bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Transfeksiyon gününde, lipozom ve DNA çözeltilerini üreticinin önerilerine göre hazırlayın.DNA hücrelerini, HA, NA ve Gag oranları bir'e bir veya iki olacak şekilde bir DNA kompozisyonuyla ve T150 flakon başına toplam 40 mikrogram DNA miktarıyla transfekte edin. Toplam 200 mililitre hacme ulaşmak için bu adımı dokuz T150 flakon oluşturacak şekilde tekrarlayın. Ardından, her bir flakon toplam 24 mililitre hacme sahip olacak şekilde DNA ve lipozom çözeltilerini antibiyotiksiz, serumsuz transfeksiyon ortamında seyreltin.Flaskları inkübatöre geri yerleştirin ve hücreleri ve transveksiyon kültür ortamını, virüs benzeri partikül (VLP) hasat gününe kadar muhafaza edin. Transveksiyondan 72 ila 96 saat sonra, kültürü hücrelerden hasat etmek için süpernatanı 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Hücresel kalıntıları çöktürmek için hücreleri santrifüjleyin.Süpernatanları toplayın ve 0.22 mikronluk bir dökme membrandan filtreleyin. Daha önce hazırlanmış spodoptera frugiperda veya Sf9 hücrelerini, çok noktalı bir karıştırıcı plaka sistemi üzerinde 130 rpm hızında sürekli karıştırarak spinner flasklarda süspansiyon şeklinde kültüre edin. Uygun havalandırma için kültür hacimlerini, spinner flask hacminin yarısını geçmeyecek şekilde koruyun.Ardından, bir spinner flask içindeki 250 mililitre Sf9 hücresini, mililitre başına iki çarpı on üzeri altı hücre yoğunluğunda, önceden hazırlanmış rekombinant bakulovirüs ile enfekte ederek CHIK VLP'lerini eksprese edin ve hücreleri 28 °C'lik bir inkübatöre geri yerleştirin. Hücre canlılığının %70 ila %80'e düşüp düşmediğini belirlemek için trypan blue dışlama yöntemini kullanın. Onaylandığında, kültürleri doğrudan süspansiyondan 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve hücreleri çöktürün. Süpernatanları toplayın ve sedimentasyondan önce 0,22 mikronluk bir dökme membran aracılığıyla filtreleyin.Altı adet 25 milimetre x 89 milimetre açık üst ultrasantrifüj tüpünü %70 ethanol ile sterilize edin. Ardından, ethanolun tamamen kuruduğundan emin olun. Temiz tüplere 32 mililitre süpernatan yükleyin.Ardından, süpernatanların altına dikkatlice üç mililitre steril %20 gliserol ve PBS ekleyin. Gliserol ile VLP çözeltisi arasındaki ince yoğunluk tabakasının bozulmasını önlemek için gliserolü yavaşça ekleyin. Gliserolün çok hızlı eklenmesi, gliserol ve VLP çözeltilerinin karışmasına neden olarak VLP sedimentasyonunu azaltacaktır.Tüplerin dengeli olduğundan emin olun, ardından santrifüj işlemini başlatın. Dört saat sonra tüpleri santrifüjden çıkarın. Peleti tüpten ayırmamaya dikkat ederek süpernatantı aspire edin.Çöken VLP'leri, tüplerin dibinde en az 100 µL steril PBS ile nazikçe ve yavaşça pipetleyerek yeniden süspande edin. VLP peletinin yeniden süspansiyonu, bir pipet kullanılarak PBS'nin nazik, yavaş ve tekrarlı aspirasyon ve ekspülsiyonu ile gerçekleştirilmelidir. VLP kaybını sınırlamak için kabarcık oluşumundan kaçının.Son olarak, resüspande edilen VLP'leri saklayın. Çeşitli SVP ve VLP konstrüktlarından VLP hacimleri ve konvansiyonel bir BCA analizi ile toplam protein verimi elde edilmiştir. Sf9 hücrelerinden elde edilen CHIK SVP verimleri, mililitre süpernatan hacmi başına 0,008 ila 0,016 miligram toplam protein arasında değişmektedir.Memeli 293 T hücreleri aracılığıyla yapılan üretim, protein miktarında on kat azalmaya yol açarken; bu elektron mikrograf görüntüsü, HA Gag çekirdek influenza VLP'lerinin VLP'ler olarak başarıyla eksprese edildiğini, bir araya getirildiğini ve saflaştırıldığını göstermektedir. Bu prosedür uygulanırken, genel protein ekspresyon seviyelerini etkileyeceği için yalnızca sağlıklı ve canlı hücre kültürlerinin transfekte edilmesi ve enfekte edilmesinin önemli olduğu unutulmamalıdır.Bu prosedürün ardından, toplam protein içeriğini, spesifik antijen içeriğini ve fonksiyonel HA ekspresyonunu ölçmek amacıyla BCA, ELIZA ve HA assay'leri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Ultrasantrifüj ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken tüplerin dengelenmesi, yalnızca önerilen rotorların ve hızların kullanılması ve yeni laboratuvar personelinin uygun şekilde denetlenmesi gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

expression-and-purification-of-virus-like-particles-for-vaccination

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

Bu video, bir memeli sisteminde grip virüsü benzeri parçacıkların (VLP'ler) oluşumunu göstermektedir. Uygun memeli konakçı hücrelerinde farklı viral yapısal proteinleri kodlayan üç ökaryotik ekspresyon vektörünün eksprese edilmesinin ardından, eksprese edilen viral proteinler, konakçı plazma zarı üzerinde VLP'lere kendi kendine birleşir ve hücre yüzeyinden tomurcuklanma yoluyla salınır.

Bir memeli sistemi aracılığıyla influenza virüsü benzeri parçacıkların üretilmesi için bir teknik

Bu video, virüs benzeri parçacıkların, VLP'lerin, böcek hücrelerinin chikungunya virüsü gen kasetini taşıyan rekombinant bir bakulovirüs ile enfekte edilmesiyle nasıl üretildiğini gösterir. Rekombinant virüs, hücreleri enfekte ederek VLP oluşumuna, montajına ve aşı üretiminde potansiyel kullanım için kültür ortamına salınmasına yol açar.

Böcek hücrelerinde bakulovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak chikungunya virüsü benzeri parçacıkların üretilmesi

Geçici baskın seçim yöntemini kullanarak floresan etiketli proteinleri aynı anda ifade eden rekombinant vaksinia virüslerinin üretimi için hızlı ve modüler bir protokol burada açıklanmıştır.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Burada, bir proof-of-prensibi iki değerlikli adenovirüs tip 5 (Ad5) vektörü oluşturmak için bir protokol mevcut Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi kullanılarak. Bu vektör nitel uygunluk arzettiği gösterilmiştir, yetenek dahil antijenlere Ad5-pozitif in vitro sera'yı ve antijenikliği yanı sıra immünojenitesini kaçmak için.

Adenovirüs Serotipinin 5-vektörlü Aşı Yaklaşımlar Geliştirme Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi kullanmak

Vaccinia virüsü (W), yaygın olarak biyomedikal araştırmalar ve insan sağlığının iyileştirilmesi kullanılmıştır. Bu makalede, bir CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak VV genom düzenlemek için basit, yüksek verimli bir yöntem açıklanır.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

Aşı geliştirmede kullanılmak üzere kendi kendine biraraya gelen protein nano taneciklerinin (SAPN' ler) saflaştırılmasını, yeniden katlanması ve karakterizasyonu nun tanımlanmasını açıklayan ayrıntılı bir yöntem burada verilmiştir.

Trimerik Epitop Sunumu Gerektiren Aşılar için E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nano tanecikleri Üretimi

Burada, poli (beta aminoester) polimerlere dayalı mRNA nanopartikülleri üretmek için basit bir protokol sunulmaktadır, kapsüllenmiş mRNA değiştirilerek uyarlanabilir. Polimerleri, nanopartikülleri ve in vitro temel karakterizasyonlarını sentezlemek için iş akışı da açıklanmıştır. Bağışıklama ile ilgili bir kavram kanıtı da ekleniyor.

Aşı Amacıyla mRNA Yüklü Poli (Beta Aminoesterler) Nanopartiküllerinin Sentezi ve Karakterizasyonu

Burada, antijen gösteren virüs benzeri parçacıklar (VLP'ler) üzerindeki nötralizasyon epitoplarını tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan immün yetmezlik virüsünün (HIV) türevli VLP'lerin immün özürlülüğü, protein G-konjuge manyetik boncuklarla birleştirilmiş zarf glikoproteinlere özgü monoklonal antikorlar kullanılarak gerçekleştirilir. Yakalanan VLP'ler daha sonra viral çekirdek protein Gag spesifik antikorlar kullanan SDS-PAGE ve Batı blot analizine tabi tutulur.

Virüs Benzeri Parçacık (VLP) Tabanlı Aşılarda Bir Yakalama Tahlili Kullanılarak Görüntülenen Antijenlerde Nötralizasyona Duyarlı Epitopların Tespiti

Mevcut protokol, dış zar veziküllerinin biyomühendisliğini, üretim, saflaştırma, biyokonjugasyon ve karakterizasyon dahil olmak üzere bir "Tak ve Göster" aşı platformu olarak tanımlamaktadır.

SARS-CoV-2 Reseptör Bağlama Etki Alanını Gösteren Dış Membran Veziküllerine Dayalı Bir "Tak ve Görüntüle" Nanopartikül Aşı Platformu

Öğrenin, memeli veya böcek hücre sistemlerinde ifade edilen virüs benzeri parçacıkları ultrasantrifüjasyonla saflaştırma yöntemini. Bu teknik, aşı hedefleri için viral antijenleri güvenli ve esnek şekilde tanımlamayı kolaylaştırır.

İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması

Daha fazla video keşfet