Tek adımlı olumsuz Kromatografik arıtma

Bu saflaştırmanın genel amacı, di-etil amino-etil iyon değişim reçinesi ile negatif mod toplu kromatografisi kullanarak, Helicobacter pylori Nötrofil aktive edici protein veya HP-NAP'yi doğal formunda, yüksek saflıkta ve yüksek verimle elde etmektir. Bu tekniğin temel avantajı, HP-NAP'nin tek adımda, doğal formunda, yüksek saflıkta ve yüksek verimle saflaştırılabilmesidir. HP-NAP'nin negatif saflaştırması, bakteriyel lizatlardan elde edilen çözünür protein fraksiyonunun DEAE reçinesine eklendiği bir toplu bağlama prosedürü ile başlar.

Toplam proteinlerin reçineye bağlanmasını sağlamak için karışım inkübe edilir. Ardından, bağlanmamış fraksiyonda bulunan HP-NAP, yerçekimi akışlı santrifüjasyon yoluyla elde edilir. Bu tekniğin etkileri, Helicobacter pylori ile ilişkili hastalıkların 10:1 oranındaki önleyici tedavisi ve prognozu ile kanser tedavisi üzerinedir.

HP-NAP'ın immünojenik ve immünomodülatör özellikleri nedeniyle, bu yöntemi ilk kez uygulayan kişiler genellikle zorluk yaşayacaktır. Çünkü HP-NAP, sterilizasyon sırasında kolayca kümelenir.

Prosedürü, laboratuvarımızdan lisansüstü öğrencisi Zhi-Wei Hong gerçekleştirecek. Dört derece Celsius'ta çalışarak, metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlanan 50 mililitre hücre peletini, proteaz inhibitör karışımı içeren pH 9,0'da 20 mililitre düşük tuzlu tris-tamponu içinde süspanse ediyoruz. Protein agregasyonunu önlemek için numuneyi dört derece Celsius'ta tutmak kritik önem taşır.

Bakteriyel süspansiyonu, dört santigrat derecede, 15.000 ile 20.000 PSI aralığında çalışan yüksek basınçlı bir homojenizatörden yedi kez geçirerek bakteriyel hücreleri parçalayın. Lizatlar oluştuktan sonra, hemen santrifüjlenmelidir. Homojenize edilmiş örnekleri bir santrifüj tüpüne aktarın.

Suda çözünür ve çözünmeyen protein fraksiyonlarını ayırmak için hücre lizatını bir ultra-santrifüj kullanarak 4 °C'de, 30.000 ×g hızda bir saat boyunca hemen santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, süpernatanı çözünür protein fraksiyonu olarak bir behere aktarın. Çözünür protein fraksiyonunun protein konsantrasyonunu, üretici talimatlarına uygun olarak, standart olarak sığır serum albümini içeren ticari bir kit ile Bradford yöntemiyle ölçün.

Ardından, pH değerini pH 9.0'dan pH 8.0'a ayarlamak için 20 mL çözünür protein fraksiyonuna 177.6 µL 1N HCl ekleyin. Nihai protein konsantrasyonu 0.5 mg/mL olacak şekilde protein çözeltisine 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 50 mM sodyum klorür ekleyin. 15 mL DEAE reçinesi hazırlamak için, 0.6 g DEAE reçinesi kuru tozunu 30 mL Tris-HCl tamponu içinde oda sıcaklığında en az bir gün boyunca süspande edin.

Reçineyi 4 °C'de 10,000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından süpernatantı uzaklaştırıp atın. Daha sonra 15 mL Tris-HCl tamponu ekleyin. Santrifüjleme ve yeniden süspansiyon adımlarını dört kez daha tekrarladıktan sonra, çökelmiş 15 mL reçineyi sonraki kullanımlar için 4 °C'de saklayın.

Dört derece santigrat sıcaklıkta çalışarak, hazırlanan çözünür proteinlerin 45 mililitresini reçinenin mililitrelerine ekleyin ve manyetik karıştırıcılı 100 mililitrelik bir behere aktarın. Protein reçine süspansiyonunu, bir karıştırıcı plaka kullanarak dört derece santigrat sıcaklıkta bir saat boyunca karıştırın. Ardından, protein reçine süspansiyonunu musluklu plastik veya cam bir kolona boşaltın ve reçinenin yerçekimi altında çökmesini bekleyin.

Sıvı seviyesi kolonda reçinenin hemen üzerine gelene kadar, protein çözeltisinin yerçekimi akışıyla kolondan geçmesini sağlamak için musluğu açın. Saflaştırılmış nötrofil aktive edici protein içeren bağlanmamış fraksiyon olarak akış çıktısını toplayın. Kolona 15 mililitre buz gibi soğuk Tris-HCl tamponu ekleyin.

Yıkama tamponunun, kolondaki sıvı seviyesi reçinenin hemen üzerine düşene kadar yerçekimi akışıyla kolondan geçmesine izin vermek için musluğu tekrar açın. Akış ürününü yıkama fraksiyonu olarak toplayın. Ek yıkama fraksiyonlarını toplamak için buz gibi soğuk tamponla yıkama işlemini dört kez daha tekrarlayın.

Ardından kolona 15 mililitre buz gibi soğuk 20 milimolar Tris-HCl pH 8.0, bir molar sodyum klorür ekleyin. Geçiş sıvısını, daha önce olduğu gibi elüsyon fraksiyonları olarak toplayın. Ek elüsyon fraksiyonlarını toplamak için elüsyon adımlarını dört kez daha tekrarlayın.

pH'in E.coli lizatında HP-NAP çözünürlüğü üzerindeki etkisi burada gösterilmiştir. Bu çözünür fraksiyonda saptanan HP-NAP miktarı, pH 7,5 ile 9,5 arasında belirgin şekilde artmıştır. Hücre lizisinden sonra, pH 9,0'da rekombinant HP-NAP'nin neredeyse tamamı çözünür fraksiyonda geri kazanılmıştır.

Burada, E.coli'de eksprese edilen rekombinant HP-NAP'ın batch modda DEAE reçineleri ile negatif saflaştırılması üzerinde pH'ın etkisi gösterilmiştir. pH 8.0'da, elüsyon fraksiyonunda sadece az miktarda HP-NAP mevcuttu. Bağlanmamış fraksiyonlarda bulunan HP-NAP miktarı pH 8.0'da en yüksek seviyedeydi.

E.coli'den gelen safsızlıkları absorbe etmek için reçinenin maksimum kapasitesine ulaşmak amacıyla, DEAE reçinesine yüklenen optimize edilmiş protein miktarı, mililitre reçine başına 1,5 miligram proteindir. pH 8.0'de, kesikli modda (batch mode) DEAE reçineleri kullanıldığında, bağlanmamış fraksiyonda doğal formundaki HP-NAP dışında çok az protein geri kazanılmıştır. HP-NAP'ın saflığı yüzde 95'ten daha yüksekti.

Jel filtrasyonu kromatogramı ve uzak UV dairesel dikroizm spektrumu ile ortaya konulduğu üzere, saflaştırılmış HP-NAP, alfa-heliks ikincil yapısına sahip bir multimer şeklinde katlanmaktadır. Lümen bağımlı bir kemilüminesans analizi, saflaştırılmış HP-NAP'ın nötrofiller tarafından reaktif oksijen türlerinin üretimini tetikleyebildiğini göstermektedir. Bu teknikler kavrandıktan sonra, uygun şekilde yürütüldükleri takdirde beş saat içinde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, DEAE ve değişim reçinesi ile negatif mod toplu kromatografi kullanarak, fonksiyonel HP-NAP'ı doğal formunda yüksek verim ve saflıkla nasıl saflaştıracağınız konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, toplu kromatografideki sterilizasyon adımında uygun pH değerindeki tamponların kullanıldığını hatırlamak önemlidir. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, doğal formdaki HP-NAP'ı saflaştırmak için filtrasyon yerine diğer kromatografik yaklaşımları uygulamaya çalıştığımızda geliştirdik.

Bu yöntem, E.coli tarafından eksprese edilen rekombinant HP-NAP ile çalışacak şekilde tasarlanmış olsa da, per-sida sep-tidaslar gibi diğer bakteriyel ekspresyon sistemlerine de uygulanabilir. Bu işlemin görsel gösterimi hızlı kod ile yapılmıştır.

Ayrıca, sterilizasyon ve grup kromatografisi adımlarını öğrenmek zordur. Çünkü bu adımların, herhangi bir zaman kaybı olmaksızın 4 °C'de gerçekleştirilmesi gerekir. Saflaştırma için tasarlanan bir protein, negatif modda iyon değişim kromatografimize uygunsa, bu prosedür saflaştırma sürecinin geliştirilmesi için bir başlangıç noktası olarak da uyarlanabilir.

Bu tekniğin geliştirilmesinin ardından, klinik araştırma alanındaki araştırmacıların, Helicobacter pylori ile ilişkili hastalıklar için tanı yöntemlerinin, ilaçların ve aşıların geliştirilmesinin yanı sıra kanser tedavisinde HP-NAP kullanma olasılığını araştirmasının önü açılmıştır.