Name: Tek adımlı olumsuz Kromatografik arıtma Helicobacter pylori Nötrofil-aktive protein aşın Escherichia coli Toplu Modunda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Öğrenin, Helicobacter pylori nötrofil-aktive proteinini tek adımda yüksek saflıkta saflaştırma yöntemini. DEAE reçinesi kullanılan bu teknik, aşı ve ilaç geliştirme için önemli uygulamalar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Tayvan Ulusal Tsing Hua Üniversitesi'nden Dr. Chao-Sheng Cheng'e dairesel dikroizm ölçümünü gerçekleştirdiği için teşekkür ederiz. Ayrıca ABD'deki Mayo Clinic'ten Dr. Evanthia Galanis ve Dr. Ianko D. Iankov'a anti-HP-NAP monoklonal antikoru sağladıkları için teşekkür ederiz. Hsinchu, Tayvan'daki Mackay Memorial Hastanesi'nden Dr. Han-Wen Chang ve Chung-Chu Chen'e IRB uygulaması için tavsiyelerde bulundukları için, Hsinchu, Tayvan'daki Mackay Memorial Hastanesi'nden Bay Te-Lung Tsai'ye izole nötrofillerin analizini denetlediği için ve Tayvan Ulusal Tsing Hua Üniversitesi'nden Bayan Ju-Chen Weng'e teknik yardımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007-007 ve NSC98-2311-B-007-006-MY3), Ulusal Tsing Hua Üniversitesi ve Mackay Memorial Hastanesi Ortak Araştırma Programı (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1) ve Ulusal Tsing Hua Üniversitesi araştırma programı (104N2052E1) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

İnsan kanı Ulusal Tsing Hua Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu, Hsinchu, Tayvan önceden yazılı aydınlatılmış onam ve onayı ile sağlıklı gönüllülerden alındı. E. Rekombinant HP NAP 1. İfade E. coli <ol><li> H. HP NAP-DNA dizisini içeren plazmid pET42a NAP-hazırlama pylori 26695 suşu olarak daha önce 16 nitelendirdi. tarif edildiği gibi arzu edilen nokta mutasyonu olan HP NAP DNA dizisini ihtiva eden plasmidler hazırlama (Protokolü, adım 8). </li><li> E. yukarıdaki DNA plazmid, 10 ng Dönüşümü E. coli BL21 (DE3) 42 ° C&#39;de 45 saniye için ısı şok kompetan hücreler, çizgi 50 ug / ml kanamisin ve 16 saat 37 ° C&#39;de plakalar inkübe ihtiva eden agar plakaları lizojeni bulamacında hücreleri (LB). </li><li> 50 ug / ml kanamisin ile LB suyu 5 ml ihtiva eden tek tek tüpler içinde tek koloniler inoküle ve 3 ön kültür olarak büyür170 rpm&#39;de çalkalanarak 16 saat, 7 ° C. </li><li> 1 L&#39;lik bir şişede 50 ug / ml kanamisin içeren LB suyu 200 ml, yukarıda ön-kültür hücreleri 2 ml ile inoküle. Yaklaşık bir UV / VIS spektrofotometre ile tespit 0.4-0.5 ulaşır 600 nm&#39;de absorbans ve 170 rpm&#39;de çalkalanarak, 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de aşılandı kültür şişesi inkübe edin. </li><li> HP NAP ekspresyonunu indüklemek için 0.4 mM nihai bir konsantrasyona kadar yukarıdaki kültüre 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) 80 ul ekle. Yaklaşık 1.6-1.7 ulaştığı 600 nm&#39;de absorbans kadar 3 saat boyunca kültür inkübe. </li><li> Santrifüj 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 6,000 x g&#39;de hücre süpernatan. saflaştırılmadan kadar -70 ° C &#39;de hücre pelletini saklayın. </li></ol> HP NAP içeren çözünür protein fraksiyonu 2. Hazırlık Not: Aşağıdaki adımların hepsi 4 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilmektedir. <ol><li> Hücre p yeniden süspanse 50 miProtokol adım 1.6 hazırlanan ellet 20 20 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM NaCI ihtiva eden 0.13 mM fenilmetilsülfonil florid (PMSF), 0.03 mM N-alfa-tosil-L-lizinil-klorometilketon (TLCK) ve 0.03 mi 4 ° C&#39;de mM N-tosil-L-fenilalanin-klorometilketon (TPCK) daha önce olduğu gibi 16 tarif. </li><li> 4 ° C &#39;de 7 kez 15,000 psi ile 20,000 arasında bir dizi çalışan yüksek basınçlı homojenleştirici ile bakteriyel bir süspansiyon geçirilmesiyle bakteri hücreleri bozabilir. </li><li> Santrifüj 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de 30.000 x g&#39;da hücre lisatı, bir ultra santrifüj ile çözünen ve çözünmeyen protein fraksiyonları ayırmak için. Bir behere çözünür protein fraksiyonu olarak supernatant aktarın. </li><li> üreticinin talimatlarına göre standart olarak sığır serum albümini (BSA) ile ticari bir kit kullanılarak Bradford metodu ile çözünür protein fraksiyonu Protein konsantrasyonu ölçümü. </li><li> th 20 ml 1 N HCI 177.6 ul eklepH 8.0, pH 9.0 olan pH değerini ayarlamak için Protokol adım 2.3 elde edilen E çözünür protein fraksiyonu. </li><li> Nihai protein konsantrasyonu 0.5 mg / ml olması için yukarıda protein çözeltisine, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCI ekleyin. </li></ol> E. itibaren Rekombinant HP NAP 3. saflaştırılması DEAE iyon-değişim reçineleri ile Negatif Mod Toplu Kromatografisi coli <ol><li> DEAE reçine 15 ml hazırlayın. <ol><li> DEAE reçine üzerinden 0,6 gr kuru toz tartılır ve en az 1 gün süre ile oda sıcaklığında, 20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 50 mM NaCI, 30 ml içinde askıya. </li><li> 10.000 x reçine santrifüj 1 dakika boyunca 4 ° C &#39;de örn. </li><li> Süpernatantı çıkarın ve atın. </li><li> 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCI, 15 mL ekleyin. </li><li> Protokol 3.1.2 dört 3.1.4 kez daha adımları tekrarlayın. </li><li> 15 mi daha sonraki kullanım için 4 ° C&#39;de reçinesi (30 ml Tris tamponu içinde% 50 bulamaç) yerleşmiş saklayın. Not: Bir sonraki adımda tüms, 4 ° C&#39;de gerçekleştirilmektedir. </li></ol></li><li> reçine 15 ml protokolün adım 2.6 hazırlanan çözünür proteinlerin 45 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de manyetik bir karıştırıcı ile, protein / reçine cıvık çamuru ilave edin. </li><li> Bir durdurma musluğu takılmış plastik ya da cam sütuna protein / reçine cıvık çamuru dökün. Reçine yerçekimi altında yerleşmek için izin verin. </li><li> sütununda sıvı seviyesi sadece reçine üzerine kadar protein çözeltisi yerçekimi akışı ile sütun aracılığıyla çalışmasına izin vermek için musluğunu açın. akış yoluyla saflaştırılmış HP NAP içeren ilişkisiz fraksiyon olarak toplayın. </li><li> sütuna buz soğukluğunda 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCI, 15 mL ekleyin. </li><li> sütununda sıvı seviyesi sadece reçine üzerine kadar yıkama tamponu yerçekimi akışı ile sütun aracılığıyla çalışmasına izin vermek için musluğunu açın. akış yoluyla yıkama fraksiyonu olarak toplayın. </li><li> Protokol ek yıkama kesirler toplamak için 3,5 dört 3,6 kez daha adımları tekrarlayın. </li><li> bir kolona buzla soğutulmuş 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCI, 15 mL ekleyin. </li><li> sütununda sıvı seviyesi sadece reçine üzerine kadar elüsyon tamponu yerçekimi akışı ile sütun aracılığıyla çalışmasına izin vermek için musluğunu açın. akış yoluyla elüsyon fraksiyonu olarak toplayın. </li><li> Protokol ek elüsyon kesirler toplamak için 3,8 dört 3,9 kez daha adımları tekrarlayın. </li></ol> 4. Tampon Değişim ve DEAE Reçinelerle Negatif Mod Toplu Kromatografi ile saflaştırılmaktadır HP-NAP Endotoksin Kaldırma Not: Saflaştırılmış HP NAP-E&#39;de ifade E. coli değişimi ve nötrofilleri stimüle önce endotoksin kaldırma tampon maruz bırakılması gerekmektedir. <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 24 14 kDa molekül ağırlığı kesme diyaliz tüpleri kullanılarak, 4 ° C de, Dulbecco fosfat tamponlu tuz (D-PBS), pB 7.2, saflaştırılmış HP UEP tampon değiştirme diyaliz gerçekleştirin. </li><li> Bir Syring yoluyla diyaliz HP-NAP Filtreendotoksini çıkarmak için 4 ° C sıcaklıkta 2.5 ila 4 ml / dakika arasında değişen akış hızında, 20 ml&#39;lik atılabilir bir şırınga bağlı pozitif yüklü, hidrofilik membrandan e filtresi. </li></ol> Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), Western blotting, yerel-PAGE, jel filtrasyon kromatografisi ve Dairesel Dikroizm Spektroskopisi ile arıtılmış rekombinan HP UEP moleküler özellikler 5. karakterizasyonu <ol><li> Fare monoklonal antikoru Mab 16F4 25 ihtiva eden hibridom kültür süpernatanları ile SDS-PAGE ve Western blotting ile saflaştırılmış rekombinant HP NAP analiz, daha önce 24 tarif. </li><li> Daha önce 26 tarif edildiği gibi oligomerik durumunu incelemek için ana-PAGE ve jel filtrasyon kromatografisi ile arıtılmış, HP-NAP analiz edin. </li><li> Daha önce 26 açıklandığı gibi ikincil yapısını incelemek için dairesel dikroizm spektroskopi ile saflaştırılmış rekombinant HP-NAP analiz edin. </li></ol> Bir SDS-PAGE jeli gümüş rengine boyanması HP-UEP Saflık 6. Değerlendirme <ol><li> Bir gümüş boyama kiti üreticinin talimatlarına göre çözüm, gümüş çözüm, çözüm geliştirme hassaslaştırıcı, sabitleme çözeltisi hazırlayın çözüm durdurmak ve yıkama solüsyonu. </li><li> Bir gümüş boyama kiti üreticinin talimatlarına göre bir SDS-PAGE jel gümüş lekeleme gerçekleştirin. </li><li> Bir görüntüleme sistemiyle jel görüntü elde. </li></ol> HP-NAP Bağlı Nötrofiller itibaren ROS üretimi 7. ölçümü <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 24 yoğunluk gradyan santrifüjü takiben dekstran çökeltmesi ile insan heparinize kandan İnsan nötrofilleri izole edin. </li><li> nötrofillerden ROS üretiminin ölçümü luminol bağımlı kemikuminensans kullanarak HP-NAP ile uyarılır. <ol><li> Bir plaka okuyucusu üzerinde açma ve 37 ° C&#39;de sıcaklık ayarlanır. bir yerleştirinBu, 37 ° C ye ısınmasına izin plaka okuyucu bölmesi içi boş, düz tabanlı 96 oyuklu beyaz levha,. </li><li> Varlığında veya yokluğunda 0,9 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, ve 13.3 uM 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol) ihtiva eden, D-PBS, pH 7.2 içinde teşvik karışımlarını hazırlamak Protokol adım 4.2 hazırlanan 0.67 uM endotoksin kaldırıldı HP-NAP. </li><li> 5 mM glukoz ihtiva eden D-PBS, pH 7.2 içinde 7.1 6 10 ila 2 x hücre / mi, Protokol aşamasından hazırlanan insan nötrofil konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> 96 oyuklu ise plakanın her oyuğuna nötrofil süspansiyon 50 ul ekle. </li><li> oyuk başına 5 saniyelik bir zaman aralığı de ihtiva eden nötrofiller Protokol aşama 7.2.2 hazırlanabilir teşvik karışımlarından 150 ul ekle. </li><li> Bir plaka okuyucusu kullanılarak, üç saatlik bir süre boyunca göz başına 5 saniye için kemilüminesans emisyonunu ölçün. </li></ol></li></ol> 8.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile DNA Plazmidler Barınma HP-NAP Mutantlarının Şantiye doğrudan Mutagenezler tabanlı Not: &quot;sessiz&quot; restriksiyon bölgeleri bölge-yönlendirmeli mütajenez (SDM) -assist yazılımı 28 ile bir mutagenez primeri tanıtıldı hariç, daha önce tarif edildiği gibi 27, PCR tabanlı bir site doğrudan mutajenez temel oluşturulmuştur. <ol><li> PCR reaksiyonu gerçekleştirmek. <ol><li> Nihai verir plazmid pET42a NAP-10 ng, Tablo 1 &#39;de listelenen mutagenez primer çiftleri 1 uM, deoksinükleosid trifosfat (dNTP) ve iyonu giderilmiş su ihtiva eden bir PCR tüpüne yüksek güvenilirlikli PCR enzim karışımı 3 adet 200 uM ekleme 25 ul hacmi. </li><li> 95 PCR döngüleri başlatın 10 dakika boyunca ° C şablon DNA&#39;yı denatüre ve 1 dakika süre ile 95 ° C de 12 amplifikasyon döngüsü ile takip etmek, T 1 dakika süre ile -5 ° C Resim m, 6 dakika boyunca 72 o C. </li><li> PCR döngüleri bitirmek1 dakika için Tm s -5 O ° C&#39;de bir tavlama aşaması, ve 30 dakika süreyle 72 ° C&#39;de bir uzatma aşamasından oluşuyordu. </li></ol></li><li> 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de Dpn I sınırlama enzimi 0.4 ul PCR ürünü 15 ul tedavi ve daha sonra agaroz jel elektroforezi ile Dpn I ile tedavi edilen PCR ürünü 2 ul analiz eder. </li><li> Ekran mutantları. <ol><li> E. içine PCR ürünü 2 ul Transform 42 ° C&#39;de 45 saniye boyunca ısı şoku ile coli DH5α kompetan hücreler. </li><li> 50 ug / ml kanamisin içeren bir LB plakası üzerinde dönüştürülmüş hücrelerinin yayılmasını ve 16 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> imalatçının protokolüne göre, ticari bir alkalin liziz kiti kullanılarak bakteriyel kolonilerden plazmid DNA izole edin. </li><li> üreticinin protokolüne göre istenen sessiz mutasyonların varlığını doğrulamak için XhoI kısıtlama enzimi ile protokolün adım 8.3.3 izole plazmid DNA tedavi edin. </li><li> diziPlazmid DNA, üretici protokolüne göre HP NAP-mutantlarının kodlama dizilerinin düzeltme teyit etmek için T7 promoter primeri ile protokolün adım 8.3.4 tarafından doğrulanan. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CDC+Health+Information+for+International+Travel+2016%22">CDC Health Information for International Travel 2016</a>. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).</li>
<li>Bauer, B., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+gastric+pathogen+Helicobacter+pylori+its+association+with+gastric+cancer+and+ulcer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ulcers%22%5BJournal%5D)">The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease.</a> Ulcers. 2011, 340157(2011).</li>
<li>Malfertheiner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+Helicobacter+pylori+infection--the+Maastricht+IV%2F+Florence+Consensus+Report.+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut.</a> Gut. 61 (5), 646-664 (2012).</li>
<li>Evans, D. J. Jr., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).</li>
<li>Fu, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein%3A+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications.</a> World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).</li>
<li>de Bernard, M., D'Elios, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+modulating+activity+of+the+Helicobacter+pylori+HP-NAP%3A+Friend+or+foe%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe?</a> Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).</li>
<li>Malfertheiner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+an+intramuscular+Helicobacter+pylori+in+noninfected+volunteers%3A+a+phase+I+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study.</a> Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).</li>
<li>Codolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP-NAP+inhibits+the+growth+of+bladder+cancer+in+mice+by+activating+a+cytotoxic+Th1+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response.</a> Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).</li>
<li>Codolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil-activating+protein+of+Helicobacter+pylori+Th2+inflammation+in+ovalbumin-induced+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma.</a> Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).</li>
<li>Del Prete,, G,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+of+TH2+responses+in+Trichinella+spiralis+by+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).</li>
<li>Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+Helicobacter+pylori+in+expression+of+antigens+and+induction+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies.</a> World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).</li>
<li>Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+evaluation+of+antibodies+against+neutrophil-activating+protein+of+Helicobacter+pylori+in+patients+with+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer.</a> World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).</li>
<li>Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CagA-independent+cluster+of+antigens+related+to+the+risk+of+noncardia+gastric+cancer%3A+associations+between+Helicobacter+pylori+and+gastric+adenocarcinoma+explored+by+multiplex+serology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology.</a> Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).</li>
<li>Kottakis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+activates+neutrophils+by+its+C-terminal+region+even+without+dodecamer+formation%2C+which+is+a+prerequisite+for+DNA+protection--novel+approaches+against+Helicobacter+pylori+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation.</a> FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).</li>
<li>Thoreson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+surface-exposed+antigen+expression+between+Helicobacter+pylori+isolated+from+duodenal+ulcer+patients+and+from+asymptomatic+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects.</a> J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).</li>
<li>Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+promotes+myeloperoxidase+release+from+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).</li>
<li>Iyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+surface+area+chromatography+for+flow-through+purification+of+viruses+and+virus+like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles.</a> J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).</li>
<li>Wongchuphan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+rabbit+polyclonal+immunoglobulin+G+using+anion+exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers.</a> Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).</li>
<li>Lu, X., Zhao, D., Su, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hemoglobin+by+ion+exchange+chromatography+in+flow-through+mode+with+PEG+as+an+escort%5BTitle%5D)+AND+%22Artif.+Cells+Blood+Substit.+Immobil.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort.</a> Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).</li>
<li>Brooks, S. P., Storey, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+protein+phosphatase+that+dephosphorylates+pyruvate+kinase+in+an+anoxia+tolerant+animal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).</li>
<li>Gewirtz, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+translocates+flagellin+across+intestinal+epithelia%2C+inducing+a+proinflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response.</a> J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).</li>
<li>Levison, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+ion-exchange+column+chromatography+of+proteins%3A+Comparison+of+different+formats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Analyt.+Technol.+Biomed.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).</li>
<li>Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+chromatography%3A+Progress%2C+applications+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives.</a> Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).</li>
<li>Yang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+purification+of+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+overexpressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biotechnol%22%5BJournal%5D)">High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli.</a> BMC biotechnol. 15 (23), (2015).</li>
<li>Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+attenuated+measles+virus+engineered+to+express+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).</li>
<li>Shih, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+chromatographic+purification+of+Helicobacter+pylori+protein+expressed+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis.</a> PLoS One. 8 (4), e60786(2013).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biotechnol%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC biotechnol. 8 (91), (2008).</li>
<li>Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDM-assist+software+to+design+site-directed+mutagenesis+primers+introducing+%27silent%27+restriction+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites.</a> BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).</li>
</ol>

HWF ve YCY, Helicobacter pylori nötrofil aktive edici proteinin tek adımlı saflaştırma yöntemi için TW I 432579 ve US 8,673,312 patentlerinin mucitleridir. Makalede açıklanan tüm materyaller araştırma amacıyla mevcut olacaktır. Yazarlar, bunun JoVe'nin veri ve materyal paylaşımına ilişkin tüm politikalarına bağlılıklarını değiştirmediğini onaylar.

Burada sunulan DEAE anyon-değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi E coli içinde aşırı eksprese rekombinant HP NAP saflaştırılması için uygundur. Hücre lizizi ve saflaştırma aşamasında kullanılan tamponların pH değerleri E. HP-NAP çözünürlüğünü sağlamak için çok önemlidir E. coli lizatları ve sırasıyla konak hücre yabancı maddelerden rekombinant HP NAP verimli ayrılması. Bakteri hücreleri, pH 9.0 lize olmalıdır ve negatif saflaştırma yüksek bir verimle ve yüksek saflıkta, HP-hav...

Helikobakter pilori (H. pilori) gastrit ve peptik ülser bir ana sebebidir. Bu bakteri, aynı zamanda Kanser, Dünya Sağlık Örgütü adına Araştırmaları Uluslararası Ajansı tarafından insanlarda karsinojen olarak sınıflandırılmıştır, 1994 yılında tahmin edildiğini H. prevalansı pylori enfeksiyonu gelişmekte olan ülkelerde% 70 ve sanayileşmiş ülkelerde 1 30-40% &#39;dir. Olsa H. enfeksiyon oranı pylori, sanayileşmiş ülkelerde H. enfeksiyon oranını azaltmak olduğunu Gelişmekte olan ülkelerde pylori halen 2 yüksektir. Standart tedavi H. ortadan kaldırmak için pylori enfeksiyonu, bir proton pompası inhibitörü, PPI ve iki antibiyotik, klaritromisin artı amoksisilin veya metronidazol 3 uygulanmasından oluşur. H. antibiyotik direnci Ancak, yükselişi pylori ülser tedavisi o önlemek için yeni stratejilerin geliştirilmesini çağrısı lır enfeksiyonu tedavi. H. karşı önleyici ve / veya terapötik bir aşı geliştirilmesi H. pylori kontrol etmek için alternatif bir yaklaşım sağlayabilir pylori enfeksiyonunun. Helikobakter pilori nötrofil aktive edici protein (HP-NAP), H. pylori önemli bir virülans faktörü, birinci bir H. su ekstreleri tespit edilmiştir endotel hücrelerine ve reaktif oksijen türlerini (ROS) 4 üretmek için uygun nötrofillerin aktive etme kabiliyetine sahip pylori. H. bulunan mide mukozasının nötrofil infiltrasyonu pylori- aktif gastrit ile enfekte olan hastalarda mide enflamasyon ve doku hasarına yol açabilir. Bu nedenle, HP-NAP fazla ülser veya H. neden gastrik enflamasyon, indükleme nötrofillerin aktive ederek patolojik bir rol oynayabilir pylori mide hastalıkları -associated. Bununla birlikte, HP-NAP klinik uygulamalara 5,6 için potansiyel bir adaydır. Nedeniyle bağışıklık ve bağışıklık düzenleyici proHP UEP perties, bu proteinin aşılar, terapötik ajanlar ve diyagnostik araçlar geliştirmek için kullanılabilir. Bir klinik çalışma H. karşı bir protein aşı bileşenleri olarak yeniden birleştirici HP NAP kullanılarak gerçekleştirilmiştir pylori. Bu aşının, alüminyum hidroksit ile birlikte formüle rekombinant HP NAP, sitotoksin ilişkili gen A (CagA) ve vakuolasyon sitotoksin A (VacA) proteinlerden oluşur ve daha fazla güvenli ve insanlarda 7 imünojenik olduğu gösterilmiştir. Ayrıca HP NAP-kanser terapisi 8 immün yanıtları -polarized aşağı alerjik reaksiyonlar ve parazit enfeksiyonları 9,10 ile ortaya çıkarılan Th2 immün yanıtları düzenleyen (Th1) T yardımcı tip 1 tetiklemek için güçlü bir bağışıklık düzenleyici olarak işlev görür. Diagnostik olarak, yeniden birleştirici HP NAP-tabanlı ELISA H. HP-NAP karşı serum antikorları tespit etmek için uygulanmıştır pylori hasta 11 ile enfekte. Bir çalışma göstermiştir ki H. serumunda HP NAP-özgü antikorların seviyesi pylori mide kanserli hastaların kronik gastrit 12 olan hastalardan alınan göre anlamlı derecede yüksek olduğu ile enfekte. Bir başka çalışma, HP-NAP karşı serum antikorları olmayan kardiya gastrik adenokarsinoma 13 varlığı ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, yeniden birleştirici HP NAP-tabanlı ELISA H. mide kanseri prognoz için HP-NAP karşı serum antikorları tespit etmek için tatbik edilebilir pylori hastaları ile enfekte. Birlikte ele alındığında, arıtılmış, HP-NAP daha önleme, tedavi için kullanılan ve H. prognozu edilebilir pylori hastalıkları yanı sıra kanser tedavisi -associated. Rekombinant HP NAP saflaştırılması için kullanılan çeşitli yöntemler arasında doğal biçiminde Escherichia coli (E. Coli) &#39;de ifade edilen ikinci bir saflaştırma aşaması ile ilgili jel filtrasyon kromatografisi yüksek ölçüde saf, HP-NAP 14-16 elde etmek için gerekli olan şu ana kadar rapor . Burada, negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak bir yöntemdietilaminoetil (DEAE) iyon-değiştirme reçineleri E. aşırı eksprese HP NAP saflaştırılması için açıklanan yüksek verim ve yüksek saflıkta coli. Bu saflaştırma tekniği konakçı hücre proteinleri ve / veya reçine HP-NAP dışındaki yabancı maddeler bağlanmasının dayanıyordu. pH 8.0, HP-NAP dışında neredeyse başka hiçbir proteinler bağlanmamış fraksiyonu geri kazanılır. negatif modda DEAE iyon değişimi kromatografisi kullanılarak bu saflaştırma yaklaşımı basit ve zaman bağlı olmayan fraksiyon toplama yoluyla tek adımlı kromatografisi ile yeniden birleştirici HP NAP saflaştırılmasını sağlayarak kazandıran. 17, immünoglobülin G (IgG) 18 hemoglobin 19, protein fosfataz 20 ve hastalık oluşturma faktörü flagellin 21 virüsleri gibi, aynı zamanda negatif iyon değişim kromatografisi ile saflaştırılabilir bildirilmiştir HP-NAP, birçok biyomoleküllerin ek olarak, modu. yabancı maddeler küçük ise negatif mod iyon değişimli kromatografi için tercih edilirtabi numunede mevcut olan bileşenlerin 22 arıtılacak. Doğal ya da yeniden birleştirici biyomoleküllerin saflaştırma negatif kromatografi uygulanması en son 23 gözden geçirilmiştir. Bu rapor E. rekombinant HP NAP ifadesi için adım protokolü tarafından bir adım sağlar E. coli, DEAE iyon değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak HP-UEP hücrelerin parçalanması ve saflaştırılması. arıtma için arzu edilen bir protein negatif modda iyon değiştirme kromatografisi için uygun ise, açıklanan protokol, aynı zamanda bir saflaştırma işleminin geliştirilmesi için bir başlangıç ​​noktası olarak adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Malzeme</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET42a-NAP&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A,</td><td>Referans 15&nbsp'nin Ek verilerinde açıklandığı gibi hazırlanmıştır; </tr> <tr><td>> http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 E. coli BL21 (DE3)</td> <td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>C6000-03</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Amresco</td><td>25389-94-0</td><td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td></tr><tr><td>İzopropil ve beta;-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)</td><td>MD Biyomedikal A.Ş</td>. <td>101-367-93-1</td><td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20</td></tr><tr><td>fenilmetilsülfonil florür (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td>proteaz inhibitörü http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>N-alfa-tosil-L-lizinil-klorometilketon (TLCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7254</td><td>proteaz inhibitörü http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>N-tosil-L-fenilalaninil-klorometilketon (TPCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4376</td><td>proteaz inhibitörü http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Protein standardı (sığır serum albümini)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5619&nbsp;</td><td>Bio-Rad Protein Testi http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW için standart bir protein</td></tr><tr><td>DEAE&ndash; Sephadex &nbsp; A-25 klorür formu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Spektrum / Por diyaliz tüpü</td><td>Spektrum Laboratuvarları</td><td>132720</td>, <td>14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720 moleküler ağırlık kesme ile;</td></tr><tr><td>Acrodisc&reg; Mustang&reg ile birimler; </td><td>Endotoksin giderimi için E membran Pall MSTG25E3; 1 ila 4 ml / dak arasında değişen akış hızlarında çalıştırıldı http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fare monoklonal antikoru MAb 16F4</td><td>N/A</td><td>N/A,</td><td>H. pylori suşu NCTC 11637'nin saflaştırılmış HP-NAP'ına karşı yükseltildi, Referans 23'te tarif edildiği gibi; &nbsp; Mayo Clinic, ABD'den Dr. Evanthia Galanis ve Ianko D. Iankov'dan bir hediye http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>jel</td><td>filtrasyon kromatografisi için 28989335 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td></tr><tr><td>PlusOne gümüş boyama kiti, protein</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>17-1150-01</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1440-02</td>, <td>insan nötrofillerini saflaştırmak için yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002</td></tr><tr><td>Düz tabanlı 96 kuyulu beyaz plaka</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>236108</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>ışıktan korumalı http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Genişlet &nbsp; uzun şablon PCR sistemi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td>Yüksek Sadakatli PCR enzim karışımının kaynağı http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Dpn I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td></tr><tr><td>E. coli DH5 ve alfa;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>18265-017</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Ürün Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>U-2800 çift ışınlı UV/VIS spektrofotometre</td><td>Hitachi&nbsp;</td><td>Yok</td><td>piyasadan çıktı ve yeni bir modele yükseltildi http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3 yüksek basınçlı homojenizatör</td><td>Avestin Inc</td><td>C315320</td><td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td></tr><tr><td>Hitachi Koki himac CP80WX genel ultrasantrifüj</td><td>Hitachi Koki Co</td><td>90106401</td><td>çözünür ve çözünmez protein fraksiyonlarının E. coli lizatlar http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td></tr><tr><td>&Auml'den ayrılması için; Jel</td><td>filtrasyon kromatografisi için</td>KTA FPLC <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18<> http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 1900-26</td></tr><tr><td>Aviv model 62ADS CD spektrofotometre</td><td>Aviv Biomedical</td><td>N/A</td><td>piyasadan çıktı ve LAS-3000 görüntüleme sistemi http://www.avivbiomedical.com/circular.php yeni bir modele yükseltildi</td></tr><tr><td></td><td>Fujifilm</td><td>N/A</td><td>üretimi durduruldu ve değiştirildi http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td></tr><tr><td>Wallac 1420 (Victor2)</td><td>kemilüminesans tespiti için</td> çok etiketli sayaç <td>Perkin-Elmer</td><td>1420-018</td> http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</tr></tbody></table>

tek adımlı olumsuz kromatografik arıtma<em&gt; helicobacter pylori</em&gt; nötrofil-aktive protein aşın<em&gt; escherichia coli</em&gt; toplu modunda

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helikobakter pilori nötrofil aktive edici protein (HP-NAP) Helicobacter pylori (H. pylori) önemli bir virülans faktörü olduğu. Bu H. kritik bir rol oynar pylori nötrofiller, monositler ve mast hücreleri dahil olmak üzere birçok doğuştan lökositlerin aktive ederek mide iltihabı indüklenen. HP-NAP bağışıklık ve bağışıklık düzenleyici özellikleri onu H. için potansiyel bir tanı ve aşı adayı yapmak pylori ve kanser tedavisi için yeni bir ilaç adayı. klinik uygulamalarda kullanılan arıtılmış, HP-NAP önemli miktarlarda elde etmek için, etkili bir yöntem, yüksek verim ve saflıkta bu proteinin oluşturulmasına ihtiyaç saflaştırmak için. Bu protokol, dietilaminoetil (DEAE), iyon değiştirme reçineleri kullanılarak, Escherichia coli (E. Coli) &#39;de rekombinant aşırı eksprese HP UEP tek adımlı negatif kromatografik arıtma için bir yöntem tanımlanmıştır (örn., Sephadex i)n toplu modunda. Rekombinant HP-NAP E. toplam proteinin yaklaşık% 70 oluşturmaktadır E. coli ve hemen hemen tam olarak pH 9.0 hücre lizizi sonrasında çözünebilir fraksiyondan elde edilir. PH 8.0&#39;da iyi şartlar altında, HP-NAP çoğunluğu bağlanmamış fraksiyon geri kazanılır ise E. endojen proteinler E. coli etkin reçinesi ile giderilirler. DEAE iyon değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak bu saflaştırma yöntemi E fonksiyonel HP NAP verir yüksek verim ve saflıkta doğal biçiminde coli. Saflaştınldı HP NAP daha önleme, tedavi için kullanılan ve H. prognozu edilebilir pylori hastalıkları yanı sıra kanser tedavisi -associated.

Rekombinant HP-NAP negatif arınma deneysel işlemin şematik E. ifade Toplu modunda DEAE iyon değişim reçineleri kullanılarak E. coli, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Bu saflaştırma tekniği konakçı hücre proteinleri ve / veya reçine HP-NAP dışındaki yabancı maddeler bağlanmasının dayanmaktadır. PH 8.0 &#39;de, kendi doğal formunda HP NAP dışında hemen hemen hiçbir proteinler, bağlanmamış fraksiyon (Şekil 2A ve B)...

Rekombinant Helicobacter tek-aşamalı negatif saflaştırılması için yüksek verimli bir yöntem tarif edilmektedir küme modunda dietilaminoetil reçineleri kullanılarak Escherichia coli içinde aşırı eksprese nötrofil aktive edici protein (HP-NAP) pylori. Bu yöntem ile arıtılmış, HP-NAP H. aşı, ilaç veya teşhis maddelerinin geliştirilmesi için faydalıdır pylori hastalıkları -associated.

Tek adımlı olumsuz Kromatografik arıtma<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Nötrofil-aktive protein aşın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Toplu Modunda

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Bu saflaştırmanın genel amacı, di-etil amino-etil iyon değişim reçinesi ile negatif mod toplu kromatografisi kullanarak, Helicobacter pylori Nötrofil aktive edici protein veya HP-NAP'yi doğal formunda, yüksek saflıkta ve yüksek verimle elde etmektir. Bu tekniğin temel avantajı, HP-NAP'nin tek adımda, doğal formunda, yüksek saflıkta ve yüksek verimle saflaştırılabilmesidir. HP-NAP'nin negatif saflaştırması, bakteriyel lizatlardan elde edilen çözünür protein fraksiyonunun DEAE reçinesine eklendiği bir toplu bağlama prosedürü ile başlar.Toplam proteinlerin reçineye bağlanmasını sağlamak için karışım inkübe edilir. Ardından, bağlanmamış fraksiyonda bulunan HP-NAP, yerçekimi akışlı santrifüjasyon yoluyla elde edilir. Bu tekniğin etkileri, Helicobacter pylori ile ilişkili hastalıkların 10:1 oranındaki önleyici tedavisi ve prognozu ile kanser tedavisi üzerinedir.HP-NAP'ın immünojenik ve immünomodülatör özellikleri nedeniyle, bu yöntemi ilk kez uygulayan kişiler genellikle zorluk yaşayacaktır. Çünkü HP-NAP, sterilizasyon sırasında kolayca kümelenir.Prosedürü, laboratuvarımızdan lisansüstü öğrencisi Zhi-Wei Hong gerçekleştirecek. Dört derece Celsius'ta çalışarak, metin protokolünde açıkland

one-step-negative-chromatographic-purification-helicobacter-pylori

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mama magnetosome aktivasyonu dahil olmak gösterildi eşsiz bir Magnetosome ilişkili protein. Burada Mama silme mutant arıtma protokolü (MamAΔ41)...

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Kaynak: Kuo, T., ve diğerleri. Helicobacter pylori Nötrofil Aktive Edici Proteinin Toplu Modda Escherichia coli'de Aşırı Eksprese Edilmesinin Tek Adımlı Negatif Kromatografik Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2016)Video, virülansla ilişkili bir proteini bir bakteri lizatından saflaştırmak için bir negatif kromatografi tekniğini göstermektedir. Tamponlu bir çözeltide pozitif yüklü bir reçine kullanılarak, konakçı hücre proteinleri seçici olarak tutulurken, nötre yakın hedef protein bağlanmadan...

Negatif İyon Değişim Kromatografisi ile Bir Bakteriyel Proteinin Seçici Saflaştırılması

Kaynak: Becker, B. ve diğerleri. Mayada Risin Toksin A Zinciri (RTA) kaçakçılığı için gerekli hücresel bileşenleri belirlemek için basit bir floresans tabanlı raporlayıcı testi. J. Vis. Exp. (2017).Bu video, polihistidin etiketli bir rekombinant proteinin nikel bazlı affinite kromatografisi kullanılarak arıtılmasını göstermektedir. Anahtar adımları belirtir; bunlar arasında sonikasyon yoluyla bakteriyel lizizi, lizatın aydınlaştırılması ve filtrasyonu ile imidazol kullanılarak hedef proteinin...

 Rekombinant Bakteriyel Proteinin Arındırılması için Afinite Kromatografi Tekniği

Bu video, afinite sıvı kromatografisi kullanılarak histidin etiketli kendi kendine monte edilmiş protein nanopartiküllerinin veya SAPS'lerin saflaştırılmasını gösterir. Elde edilen saflaştırılmış SAPN fraksiyonları, aşı geliştirme için uygundur ve potansiyel immünoterapötik uygulamalar için umut vaat etmektedir.

Afinite Kromatografisi Kullanılarak Kendi Kendine Birleşen Protein Nanopartiküllerinin Saflaştırılması

Elastin benzeri polipeptitler, yeniden birleştirici protein arıtma için ilaç teslim çeşitli uygulamalar ile uyarıcı yanıt biyo-polimerler vardır. Bu protokol, kromatografi için basit bir alternatif olarak bunların düşük kritik çözelti, sıcaklık faz geçiş davranışları kullanılarak Escherichia coli'den elastin gibi polipeptidler ve bunların peptid veya protein füzyonlarının saflaştırılmasına ve karakterizasyonunu tarif etmektedir.

Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma<em&gt; Escherichia coli</em

Aşı geliştirmede kullanılmak üzere kendi kendine biraraya gelen protein nano taneciklerinin (SAPN' ler) saflaştırılmasını, yeniden katlanması ve karakterizasyonu nun tanımlanmasını açıklayan ayrıntılı bir yöntem burada verilmiştir.

Trimerik Epitop Sunumu Gerektiren Aşılar için E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nano tanecikleri Üretimi

Çok sütunlu plaka adaptörü, kromatografi sütunlarının paralel benzeşim veya iyon değişimi saflaştırması için çok kuyulu toplama plakalarıyla arayüzlenmesini sağlayarak ekonomik yüksek verimli protein saflaştırma yöntemi sağlar. Uygun fiyatlı enstrümantasyon yoluyla miligram protein miktarı sağlayan yerçekimi veya vakum altında kullanılabilir.

Çok Sütunlu Plaka Adaptörü Kullanan Ekonomik ve Çok Yönlü Yüksek Verimli Protein Arıtma Sistemi

Bu çalışmada, Helicobacter pylori ile enfekte fekal antijenlerin hızlı tespiti için çift antikorlara dayalı bir sandviç tespit tekniği geliştirilmiştir.

Helicobacter pylori Enfeksiyonunun Fekal Antijeninin Çift Antikor Sandviç Tespit Teknolojisine Dayalı Hızlı Tespiti

Bu makale, bir C41 (DE3) ekspresyon sisteminde toksik bir nükleaz olan rekombinant Nsp15'in aşırı eksprese edilmesi için bir metodolojiyi ve ardından afinite ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak etiketli proteinin saflaştırılmasını açıklamaktadır. Bu protokoller diğer zorlu toksik proteinler için uyarlanabilir.

Escherichia coli'den Toksik Bir Nükleazın Aşırı İfade Edilmesi ve Saflaştırılması

Bu protokol, Escherichia coli'den elastin benzeri polipeptit (ELP) arındırılması için hızlı, tekrarlanabilir organik çözücü bazlı ekstraksiyon ve çökeltme yöntemini tanımlar; bu yöntem, geleneksel ELP arıtma yöntemlerine potansiyel olarak ölçeklenebilir bir alternatif sunar.

E. coli'den Elastin Benzeri Polipeptitlerin (ELP) Organik Çözücü Bazlı Ekstraksiyon ve Çökeltme Yöntemi Kullanılarak Verimli Arındırılması

Öğrenin, Helicobacter pylori nötrofil-aktive proteinini tek adımda yüksek saflıkta saflaştırma yöntemini. DEAE reçinesi kullanılan bu teknik, aşı ve ilaç geliştirme için önemli uygulamalar sunar.

Tek adımlı olumsuz Kromatografik arıtma

Daha fazla video keşfet