Name: RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen Listeria monocytogenes Makrofaj (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Öğrenin, makrofaj içinde yetişen Listeria monocytogenes'ten bakteri RNA'sı izolasyonu yöntemini. Bu teknik, bakteri gen ekspresyonunu ve patogenez mekanizmalarını incelemek için yüksek saflıkta RNA sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Herskovits laboratuvarındaki araştırma, 335400 ERC ve R01A/109048 NIH hibeleri tarafından desteklenmektedir.

Not: tüm deney sırasında, makrofaj hücreleri,% 5 CO2 basınçlı hava kuluçka makinesi içinde 37 ° C sıcaklıkta kuluçkaya yatırılır ve yalnızca bir sınıf biyolojik güvenlik kabininde yapıldığı deneysel manipülasyonlar için kuluçka alınır. L. ile çalışma monocytogenes bakteri biyolojik güvenlik seviyesine 2 düzenlemelerine göre olduğunu. 1. Hücre Hazırlama ve bakteri kökenli enfeksiyon (Gün 1 ve 2) <ol><li> 1.gün <ol><li> 30 mi BMDM + Pen-Strep ortamı (Tablo 2) ve 145 mm tabak Tohum 2.0 x 10 7, kemik iliği kaynaklı makrofaj hücreleri (BMDM). Bakteriyel suşların her biri için tohum 3 tabak analiz edilmesi. % 5 CO2 basınçlı hava kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Vahşi tip (WT) L. bir gece boyunca bakteri kültürü Başlangıç Standart bir inkübatörde 30 ° C&#39;de, beyin kalp infüzyon (BHI) ortam 10 ml streyn monocytogenes 10403S. Yeri kültür tüpleri sallayarak olmadan eğimli. Not:Bu büyüme koşulları etkili bir şekilde enfeksiyonu teşvik flagella genlerin ekspresyonunu yukarı-regüle. </li></ol></li><li> 2. gün <ol><li> 37 ° C&#39;de ön-Sıcak BMDM (Pen-Strep antibiyotiksiz) ortamı (Tablo 2) ve fosfat tamponlu tuz (PBS). </li><li> antibiyotik kaldırmak için önceden ısıtılmış PBS, 25 ml ile iki kez makrofaj tek tabaka yıkayın. 30 ml taze BMDM orta ekleyin. </li><li> 1 dakika boyunca&gt; 14,000 xg&#39;de santrifüj bakteri süpernatant atılması ve pipetleme PBS 1.5 ml yavaşça bakteri resuspending PBS ile gece boyunca bakteri kültürü 1.5 mL yıkanır. İki kez tekrarlayın. </li><li> Vahşi tip L yıkanmış bir gece boyunca bir kültürü, 0.5 ml her makrofaj plaka Infect monocytogenes. Birden fazla plakaları kullanıyorsanız, ayrı her plaka 15 dakika bulaştırmak. Bu zaman aralığı enfeksiyonu sonunda tek tek her plaka hasat sağlayacaktır. Not: enfeksiyon (MOI) seri seyreltme kaplama ile deneye tabi tutulurBakteri kültürünün s, 37 ° C&#39;de plakalar 24 saat inkübe edildikten sonra, BHI agar plakaları ve sayma koloni oluşturan birim (CFU) ile enfeksiyonu için kullanılmıştır. WT L. 0.5 ml kullanılarak monocytogenes ~ 100 bir İçişleri Bakanlığı içinde 10403S sonuçlar (makrofaj hücre başına 100 bakteri CFU) süzün. hücre içi büyüme hatalı bakteriyel mutantlann analiz edildiğinde, daha yüksek bir MOI dikkate alınmalıdır. </li><li> 37 ° C&#39;de 0.5 saat inkübe edildikten sonra, serbest bakterileri uzaklaştırmak için PBS ile iki kez enfekte hücreleri yıkayın ve 30 ml önceden ısıtılmış BMDM ortamı ilave edin. Ekli bakteriler sonraki 0.5 saat boyunca içselleştireceklerdir. </li><li> hücre-dışı bakterileri öldürmek için: (50 ug / ml bir nihai konsantrasyon elde etmek 1000 1) 1 saat sonra enfeksiyondan, gentamisin 30 ul ekle. </li><li> Bir vakum çıkış portu ile bir toplama sıvı şişesi üzerinde bir filtre kafasını koyarak filtre aparatı monte edin. Sonra silindir bir huni tarafından izlenen bir filtre kafasına bir filtre (0.45 um), koyun ve bir metal c farklı bölümlerini sabitleyinlamba. buz soğukluğunda RNaz içermeyen su hazırlayın. </li><li> aşağıdaki şekilde enfekte olmuş hücrelerden 6 saat sonrası enfeksiyon, hasat bakterileri. tek tek her plaka davranın. Not: Genellikle, L. monocytogenes makrofaj hücrelerinin enfeksiyon 6 saat boyunca büyüme 1-log tamamlar. kısa inkübasyon süreleri önemli ölçüde daha düşük bakteri yüklerini neden olabilir ise uzun inkubasyon, bakteriyel aşırı çoğalma ve makrofajların hücre ölümüne neden olabilir. MOI, enfeksiyon süresi optimal şartlara ulaşmak için değiştirilebilir. <ol><li> bir kez PBS ile enfekte hücreleri yıkanır. makrofaj hücreleri lize etmek için buz-soğuğu RNaz içermeyen su 20 ml ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, hızlı ama dikkatli plaka kapalı hücreleri kazıyın. </li><li> 50 ml konik tüp lize hücreleri toplamak. 30 saniye vorteksleyin. 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> bir vakum sistemi kullanılarak filtre aparatı ile süpernatant geçirin. coni ml filtre rulo ve hızlı bir şekilde 15 transfer, cımbız kullanarakcal tüp. sıvı azot içinde filtreler ile tüpler Yapış-dondurma. </li><li> 1.2.7 de tarif edildiği gibi, aşağıdaki örnek için yeni bir filtre ile filtrasyon aparatı birleştirin. </li><li> Bir sonraki gün için -80 ° C&#39;de donduruldu filtreleri saklayın. Seçenek olarak ise, bir nükleik asit çıkarma, doğrudan devam edin. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Nükleik Asitler Ekstraksiyon (Gün 3) Not: Bir çeker ocak içinde, fenol ve kloroform çözümler Bütün müdahaleler gerçekleştirin. <ol><li> 1 asidifiye fenol karışımı: kloroform, her bir örnek için 400 ul 1 hazırlayın. Ayrı tüplerde karıştırın ve daha sonra aspirasyon ile ortaya çıkan sulu tabaka çekilme. % 10 SDS, 40 ul ekle. </li><li> Soğuk tutmak için buz üzerinde filtre içeren tüpler çözülme. Her bir filtre ihtiva eden bir tüpe asetat-EDTA (AE) tampon maddesi (Tablo 2) 650 ul ilave edin. </li><li> mümkün olduğunca çabuk aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> Şiddetle bu yüzden filtreyi içeren tüp vorteksFiltre tüpün çevresine whisks ve tampon tamamen filtreyi yıkar. Her zaman buz üzerinde geri koyarak tüp soğuk tutmak. Not: Tam filtre kapalı bakteri yıkamak için ters ise ayrıca tüp vorteks için gerekli olabilir. </li><li> Tüm borular için tekrarlayın. Spin-aşağı kısa bir süre süspansiyon (120 xg&#39;de 1 dakika) işlemi sonunda yararlı olabilir. </li></ol></li><li> SDS ve (2.1 hazırlandı) fenol / kloroform karışımı ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne bakteri içeren tampon aktarın. Tüm borular için tekrarlayın. Filtreden kalan tampon almak için tekrar filtre ihtiva eden tüpler (120 xg&#39;de 1 dakika) döndürmek için gerekli olabilir. </li><li> 10 dakika süre ile tam hızda her 1.5 mi, bir multi-tüp vorteks cihazı tüpler ve vorteks yerleştirin. </li><li> 10 dakika boyunca 65 ° C ısıya bloğunda inkübe edin. 5 dakika boyunca maksimum hızda (&gt; 14.000 xg) santrifüj. </li><li> Her t sulu tabakayı (yaklaşık 400 ul) aktarın3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve 1.0 ml% 100 etanol içinde 40 ul ihtiva eden yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe Ube. iyice her tüp Vortex. Not: Glikojen çöktürülmüş pelet görselleştirme artırmak için bu aşamada ilave edilebilir. </li><li> 1 saat boyunca -80 ° C&#39;de inkübe edin. Seçenek olarak ise, Cı gece boyunca -20 ° örnekleri inkübe edin. Daha sonra, en yüksek hızda (&gt; 14,000 xg), 20 dakika boyunca 4 ° C &#39;de numuneler santrifüj. </li><li> Dikkatle her tüpten etanol (üst katman) aspire. iyice her bir örnek ve vorteks 500 ul soğuk% 70 etanol ekleyin. maksimum hıza (&gt; 1 4000 xg), 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüje. </li><li> Dikkatle her tüpten etanol aspire. Resim ısı ile bir vakum buharlaştırıcı kullanılarak yaklaşık 2 dakika boyunca numune kurutun. numuneler aşırı kurutmayın. </li><li> Her bir örnek için 25 mL RNaz içermeyen su ilave edilir. 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Dikkatle girdap ve spin-aşağı. </li><li> t RNA konsantrasyonu ölçmekBir mikrohacim UV-Vis spektrofotometre kullanarak o örnekler. Plaka başına nükleik asitlerin 1 ug - yaklaşık 0.5 ayıklamak için bekliyoruz. Not: teknik çoğaltır bu aşamada birleştirilebilir. </li></ol> 3. DNaz Tedavi <ol><li> Mikrofüj tüpüne Tablo 1 &#39;e göre bir reaksiyon ayarlayın. 45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. 450 mL RNaz içermeyen su ve maksimum hızı (&gt; 14,000 xg) 2 dakika süreyle santrifüjlenerek fenol-kloroform-IAA karışımı (Tablo 2), ayrı fazlar 500 ul ekle. </li><li> Yeni bir tüpe Sulu tabaka transferi ve maksimum hızı (&gt; 14,000 xg) 2 dakika santrifüjleme ile 500 ul kloroform-IAA karışımı (Tablo 2), girdap ve ayrı fazlar ekleyin. </li><li> yeni bir tüpe Sulu tabaka transferi ve 1 mL etanol ve 3 M sodyum asetat (pH 5.2) 50 ul ekle. Vortex. Not: Glikojen çöktürülmüş pelet görselleştirme artırmak için bu aşamada ilave edilebilir. </li><li&gt; -80 ° C de 1 saat süreyle inkübe edin. Seçenek olarak ise, Cı gece boyunca -20 ° örnekleri inkübe edin. maksimum hızda 20 dakika süreyle 4 ° C&#39;de santrifüje. </li><li> Dikkatle her tüpten etanol aspire. iyice her bir örnek ve vorteks 500 ul soğuk% 70 etanol ekleyin. en yüksek hızda 20 dakika süreyle 4 ° C&#39;de santrifüje. Dikkatle her tüpten etanol aspire. </li><li> Resim ısı ile bir vakum buharlaştırıcı kullanılarak yaklaşık 2 dakika boyunca numune kurutun. numuneler aşırı kurutmayın. </li><li> Oda sıcaklığına girdap ve dönme, yavaşlama, 2 dakika boyunca inkübe RNaz içermeyen su 12 ul ekle. Numuneler, saflaştırılmış RNA içeren buz üzerinde saklayın. Seçenek olarak ise, RNA çözülür RNase içermeyen H2O 0.1 mM EDTA ve TE tamponu (10 mM Tris, 1 mM EDTA) ile. </li><li> Bir mikrohacim UV-Vis spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonları ölçün. (Teknik çoğaltır birleştirilir ise) numune başına RNA ~ 100 ng bekliyoruz. Not: RNA çıkarılan bu protokole göre fo uygundurBirden tekniklerle r gen transkripsiyonu analizi. Biz genellikle L. incelemek için RT-qPCR analizi istihdam makrofaj hücreleri 1-4 enfeksiyon sırasında gen transkripsiyonunu monocytogenes. </li></ol>

<ol><li>Lobel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+regulator+CodY+links+Listeria+monocytogenes+metabolism+to+virulence+by+directly+activating+the+virulence+regulatory+gene+prfA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA.</a> Mol Microbiol. , (2014).</li>
<li>Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+analysis+identifies+isoleucine+and+CodY+as+regulators+of+Listeria+monocytogenes+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence.</a> PLoS Genet. 8 , e1002887(2012).</li>
<li>Kaplan Zeevi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+multidrug+resistance+transporters+and+cyclic+di-AMP%2C+which+contribute+to+type+I+interferon+induction%2C+play+a+role+in+cell+wall+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress.</a> J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).</li>
<li>Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophage+excision+activates+Listeria+competence+genes+that+promote+phagosomal+escape+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence.</a> Cell. 150, 792-802 (2012).</li>
<li>World Health Organization WHO. , 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/en/">http://www.who.int/en/</a> (2005).</li>
<li>Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+human+listeriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of human listeriosis.</a> Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).</li>
<li>Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+a+multifaceted+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: a multifaceted model.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).</li>
<li>Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+listeria+monocytogenes+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence.</a> Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).</li>
<li>Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+Listeria+monocytogenes+infection%3A+the+intersection+of+bacterial+pathogenesis+and+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity.</a> J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).</li>
<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).</li>
<li>Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Mycobacterium+tuberculosis+RNAs+synthesized+in+response+to+phagocytosis+by+human+macrophages+by+selective+capture+of+transcribed+sequences+%28SCOTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).</li>
<li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+transcriptional+landscape+from+saprophytism+to+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li>
<li>Schnappinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages%3A+Insights+into+the+Phagosomal+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J Exp Med. 198, 693-704 (2003).</li>
<li>Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing-based+discovery+of+the+Chlamydia+trachomatis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).</li>
<li>La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+whole+bacterial+pathogen+transcription+within+infected+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts.</a> FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).</li>
<li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).</li>
<li>Rienksma, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+insights+into+transcriptional+adaptation+of+intracellular+mycobacteria+by+microbe-enriched+dual+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing.</a> BMC Genomics. 16, 34(2015).</li>
<li>Afonso-Grunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+3%27Seq+using+deepSuperSAGE+uncovers+transcriptomes+of+interacting+Salmonella+enterica+Typhimurium+and+human+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells.</a> BMC Genomics. 16, 323(2015).</li>
<li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).</li>
<li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD%2C+10403S%2C+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5, e00969-e900914 (2014).</li>
<li>Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+gamma-interferon+receptor+that+regulates+macrophage+tumoricidal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity.</a> J Exp Med. 160, 55-74 (1984).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada açıklanan protokol L. bakteriyel RNA izolasyonu için optimize edilmiş bir yöntemle temsil makrofaj hücrelerinde hücre büyüyen bakterilerin monocytogenes. Bu protokol, hücre ayırıcı liziz göre ve bakteriyel RNA zenginleştirilmesi için iki ana adımları içerir: santrifüj ve süzme ile bakterilerin hızlı bir koleksiyonunu kullanarak makrofaj çekirdekler çöktürülür. Bu adımlar, standart RNA ekstraksiyon prosedürü izlemektedir. Bu protokol, Lısterıal RNA saflaştırma açıklanmış olsa da, kolayca diğer ba...

Hücre içi bakteriyel patojenler ─ bulaşıcı hastalıklar ve büyüyen insan konak iç hücrelerini üretebilen neden olan bakteriler ─ dünya çapında önemli bir sağlık sorunu 5 vardır. istila ve bir memeli hücre içinde çoğaltmak için, hücre içi patojenler sofistike virülans mekanizmaları ve faktörleri edindik. bu mekanizmalar bir hastalığa neden yeteneği temel olmakla birlikte, biz onların düzenlenmesi ve dinamikleri hakkında çok az şey biliyoruz. sıvı ortamda yetişen bakteri geni ekspresyonunun konak hücreleri içinde, gerçek bir ortam yansıtamıyacağından, hücre içi niş yetiştirilen bakteri analiz transcriptome için giderek artan bir ihtiyaç vardır. Bu tür analizler ev sahibi tarafından tetiklenen spesifik bakteriyel uyarlamalar deşifre sağlayacak ve tedavi tasarımı için yeni hedefler belirlemeye yardımcı olacaktır. memeli RNA da bakteriyel RNA sayıca üstün beri hücre yetiştirilen bakterilerin Transcriptome analizi son derece zorluen az on kat. Bu yazıda, fare makrofaj hücreleri içinde büyüyen Listeria monocytogenes bakterilerden bakteriyel RNA izole etmek için deneysel bir yöntem açıklanmaktadır. ekstre RNA, hücre içi uyarlama ve RT-PCR, RNA-DİZ, mikrodizi ve diğer melezleştirme tabanlı teknolojiler gibi transkripsiyon analizleri çeşitli tekniklerle, patojenik bakterilerin hastalık oluşturma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. L. monocytogenes insanlarda listeriosis etkeni öncelikle immün sistemi baskılanmış bireyler, yaşlılar ve hamile kadınlar 6 hedefleyen klinik bulgularla seyreden bir hastalıktır. O 7 çalışma evsahibi-patojen etkileşimlerinin bir model olarak yıllardır kullanılmaktadır memeli hücrelerinin geniş bir dizi işgal bir Gram-pozitif fakültatif hücre içi patojendir. istila etmesine, bu t kaçmasına gereken bir vakuol ya da (fagositik hücreler durumunda), bir fagozomun, başlangıçta bulunduğuo çoğaltmak için hücre sitoplazmada ev sahipliği. Muhtelif virülans faktörlerinin çıkış işlemi, temel olarak, gözenek-oluşturucu hemolisin, listeriolisin O (LLO) ve iki ek fosfolipazları 8 aracılık ettiği gösterilmiştir. Sitoplazmada bakteriler (Şekil 1) hücre içindeki aktin filamentler kendilerini itmek için ve hücreden hücreye yayılan konak aktin polimerizasyonu makineleri kullanıyoruz. L. Bütün büyük virulans faktörleri işgali, hücre içi yaşam ve çoğaltmaya katılan monocytogenes, ana virülans transkripsiyon regülatör PrfA. 8-10 aktive edilir. Son on yılda, çeşitli çalışmalar bize tarafından yürütülen ve diğerleri başarıyla konakçı hücrelere 2,11-15 içinde hücre yetiştirilen bakterilerin transcriptome analizi için yöntemler uyguladınız. sorumluluk yönün bakteriyel RNA 1) seçici zenginleştirme ve 2) RNA izolasyonu: İki temel yaklaşım dayanmaktadır konak-RNA bakteriyel RNA ayırmak için kullanılırrential hücre parçalama. Birinci yaklaşım (ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak, örneğin), memeli RNA moleküllerinin toplam RNA özleri eksiltici hibridizasyon ve bakteriyel transkribe dizileri (SCOTS) 11 seçmeli tutma dayanır. İkinci yaklaşım, bakteriyel hücreler gibi kalır, ev sahibi hücrelerin lize olan bakteri ve konakçı hücreler, ayırıcı liziz dayanır. Bakteriyel hücreler daha sonra, genellikle santrifüjleme ile konakçı hücre lizatından ayrılır ve RNA, standart teknikler kullanılarak ekstre edilir. Bu yaklaşımı kullanarak, ana problem, sağlam bakteri konakçı hücreler çekirdekleri de izole ile birlikte, bu şekilde RNA preparatları de memeli RNA içeren bir. Bu sorunun üstesinden gelmenin bir yolu, bu prosedür genellikle çıkarma sırasında gen tanımlama profili değişikliklerin endişesini zaman alır ancak diferansiyel santrifüj kullanılarak konakçı hücreler çekirdeklerden sağlam bakteri ayırmaktır. Bu yazıda gelişmiş ve hızlı ba sunmakHücre diferansiyel parçalama yaklaşıma dayanmaktadır cteria RNA ekstraksiyon protokolü. İlk olarak, L. makrofaj hücreleri enfekte monocytogenes soğuk su ile lize edilmiştir. Daha sonra, makrofaj çekirdekler kısa bir santrifüjleme ile ayrılmış ve sağlam bakteri hızlı, RNA bakteriyel nükleik asitlerin sıcak fenol-SDS ekstraksiyonu kullanılarak izole edilir, filtre üzerinde toplanır.

<table><tbody><tr><td>Listeria monocytogenes 10403S</td><td></td><td></td><td>20</td></tr><tr><td>C57B/6 dişi fareden hazırlanan kemik iliği türevi makrofajlar</td><td></td><td></td><td>21</td></tr><tr><td>H2O, RNAsesesız</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td>DEPC ile arıtılmış su DMEM</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin kullanılabilir</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Gibco</td><td>11360-088</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin-PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Beyin kalp infüzyonu (BHI)</td> <td>Merckmillipore</td><td>1104930500</td><td></td></tr><tr><td>Fenol doymuş pH 4.3</td><td>Fisher</td><td>BP1751I-400</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>İzo-amil alkol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>W302406</tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>SDS %10</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>Merck Millipore</td><td>1070174000</td><td></td></tr><tr><td>37 & derece; C,% 5 CO2 cebri hava inkübatörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model 3111</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcılar</td><td>Nunc</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>45 mm filtreler için Kontes cam tutucu</td><td>Fisher</td><td>K953755-0045</td><td></td></tr><tr><td>MF-Millipore filtreler 45&nbsp; mm, 0.45&nbsp; &mikro; m</td><td>Merck Millipore HAWP04700</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac sistemi</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>Model G560E</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>145 mm hücre kültürü kapları</td><td>Greiner</td><td>639 160</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml tüpler, RNaz içermeyen</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>30 derece ve derece; C inkübatör</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>65 & derece; C ısı bloğu</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 & derece; C tabla santrifüjü</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Steril pipetler, 25 ml</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon tüpleri, 50 ml</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rna arıtma hücre içindeki dan yetiştirilen<em&gt; listeria monocytogenes</em&gt; makrofaj

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Memeli enfeksiyonu sırasında bakteriyel patojenlerin transkriptomunun analizi, enfeksiyona aracılık eden genleri ve faktörleri incelemek için değerli bir araçtır. Bununla birlikte, bakteriyel RNA'yı enfekte hücrelerden veya dokulardan izole etmek zorlu bir iştir, çünkü memeli RNA'sı çoğunlukla enfekte olmuş hücrelerin lizatlarına hakimdir. Burada, kemik iliği kaynaklı makrofaj hücreleri içinde büyüyen Listeria monocytogenes bakterilerinin RNA izolasyonu için optimize edilmiş bir yöntemi açıklıyoruz. Enfeksiyon üzerine, hücreler hafifçe parçalanır ve bozulmamış bakterileri korurken, konakçı proteinlerin ve RNA'nın çoğunu atmak için hızla filtrelenir. Daha sonra, bakteriyel RNA, sıcak fenol-SDS ekstraksiyonu ve ardından DNaz tedavisi kullanılarak izole edilir. Ekstrakte edilen RNA, çoklu tekniklerle gen transkripsiyon analizi için uygundur. Bu yöntem, makrofaj hücrelerinin 1-4 enfeksiyonu sırasında Listeria monocytogenes gen regülasyonu çalışmalarımızda başarıyla kullanılmaktadır. Protokol, diğer bakteriyel patojenleri ve hücre tiplerini incelemek için kolayca değiştirilebilir.

Model sistem, Şekil 1 &#39;de gösterilen ve L ile enfekte makrofaj hücreleri içerir makrofaj sitozolde çoğaltmak bakterileri monocytogenes. 2 deney düzeni temsil Şekil. Şekil 3 WT L. sırasında virülans genlerinin RT-qPCR analizi tipik sonuçlarını temsil Zengin laboratuar ortamı BHI büyümeye kıyasla makrofajlar büyüme monocytogenes. Sonuçlar L. iki ana hastalık oluşturma faktör...

Burada, murin makrofajları içinde büyüyen Listeria monocytogenes bakterilerinden bakteriyel RNA izolasyonu için bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik, diğer hücre içi patojenler ve memeli konak hücreleri ile birlikte kullanılabilir.

RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Makrofaj

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Bu prosedürün genel amacı, makrofaj hücrelerinde hücre içi olarak büyütülen bakterilerden RNAle ekstraksiyonu yapmaktır. Bu yöntem, bakterilerin enfeksiyonu yönetmek için hangi genlerdeki faktörleri tetiklediği gibi, bakteriyel patogenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, konakçı nükleik asit kontaminasyonunu minimize ederken bakteriyel RNA'yı önemli ölçüde zenginleştirmesidir.Prosedürü, laboratuvarımdan doktora öğrencisi Anna Pasechneck gerçekleştirecek. Hücreleri bakteriyel enfeksiyona hazırlamak için, birinci günde, 30 mL BMDM ortamı ve Pen/Strep içeren 145 mm'lik kaplara 2 × 10⁷ kemik iliği türevli makrofaj (BMDM) hücresi ekleyin. Hücreleri zorunlu hava sirkülasyonlu bir inkübatörde 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında gece boyunca inkübe edin.Vahşi tip L.monocytogenes bakteri kültürünü 10 mililitre beyin kalp infüzyonu veya BHI besiyerine inoküle edin. Tüpleri bir inkübatöre eğimli konumda yerleştirin ve gece boyunca çalkalamadan 37 °C'de inkübe edin. Ertesi gün, antibiyotiksiz BMDM besiyerini ve PBS'yi 37 °C'ye önceden ısıtın.Ardından, hücrelere 30 mililitre taze BMDM medyumu eklemeden önce, antibiyotikleri uzaklaştırmak için makr

rna-purification-from-intracellularly-grown-listeria-monocytogenes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu makale, bozulmamış izolasyonu ve saflaştırılması için bir yöntem...

Patojen Vakuoller saflaştırılması gelen<em&gt; Legionella</em&gt;-Enfekte Fagositler

Kaynak: Jung, A. L. et. al., Legionella pneumophila Dış Membran Vezikülleri: Makrofajlar Üzerindeki Pro-inflamatuar Potansiyellerinin İzolasyonu ve Analizi. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, bakteri replikasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için makrofajların Legionella pneumophila dış zar vezikülleri (OMV'ler) ile ön tedavisini göstermektedir. OMV'ler, konakçı bağışıklık sinyalini değiştirerek makrofajları enfeksiyona karşı daha izin verici hale getirir. Tedavi edilen hücrelerde tedavi edilmeyen...

Dış Membran Vezikülleri ile Ön İşlem Görmüş Makrofajlarda Legionella pneumophila Replikasyonunun Test Edilmesi

Kaynak: Sigal, N. ve diğerleri. Makrofaj Hücrelerinde Hücre İçinde Yetiştirilen Listeria monositogenlerinden RNA Arındırma.  J. Vis. Exp. (2016).Bu video, enfekte kemik iliği kaynaklı makrofajlardan (BMDM) içselleştirilmiş patojenik bakterilerin izole edilmesini gösteriyor. Bakterilerin konak hücrelere bağlanmasına izin verilir ve bağlanmamış bakteriler yıkanır. İçselleştirmeden sonra, içselleştirilmeyen bakterileri yok etmek için bir antibiyotik eklenir. Konak hücreler lizediliyor,...

Enfekte Konak Hücrelerden Hücre İçi Patojenik Bakterilerin İzolasyonu

Kaynak: Sigal, N. ve diğerleri. Makrofaj Hücrelerinde Hücre İçinde Yetiştirilen Listeria monositogenlerinden RNA Arındırma. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, enfekte fare makrofajlarından izole edilen Listeria monocytogenes'ten RNA çıkarımı göstermektedir. Protokol RNA'yı korur, hücreleri fenol-kloroform ve ısı kullanarak lizler ve RNA'yı santrifüjle ayırır. Tuz ve etanol, soğuk kuluçka ile birleşerek RNA çökelmesini teşvik eder. Ortaya çıkan RNA, konak kaynaklı gen ifadesini yakalar ve bakteriyel...

Enfekte Fare Makrofajlarından Elde Edilen Listeria monocytogenes'ten RNA Ekstraksiyonu

Bu videoda, hücre içi patojenik bir bakteri olan hücre içi ve hücre dışı Listeria monocytogenes'i, kültür makrofajlarının in vitro olarak enfeksiyonunu takiben akış sitometrisi kullanarak ölçüyoruz.

İntrasellüler ve Acil Ekstraselüler Listeria monocytogenes'in In Vitro Flow Sitometri Analizi

Bu kağıt kullanılarak farenin oral enfeksiyonu için yeni bir yöntemi...

Sözlü İletim<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Kirlenmiş Gıda Yutma ile Farelerde

Makrofajlar uzun doğal ve adaptif immün yanıtları kritik bir bileşeni olarak kabul edilmiştir. Makrofajlar ve mikrop arasındaki etkileşimin, evrimsel genetik ve biyokimyasal yönleri ile ilgili bilginin son patlama makrofajlara bilimsel ilgi yenilenmiştir. Bu makalede, fare kemik iliği makrofajları ayırt etmek için bir yöntem tarif edilir.

Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Listeria monocytogenes sıklıkla hücre içi asalaklığın çalışma için büyük bir model olarak kullanılan bir Gram pozitif bakteri patojendir. Geç L. Görüntüleme küçük müdahale edici RNA ekranlar bağlamında enfeksiyon aşamaları monocytogenes, hedef konakçı hücrelerin bakteriyel bir enfeksiyon için gerekli hücresel yolların küresel çalışma sağlar.

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bu protokolde, Amaxa Nucleofector 96 kuyulu Mekik Sistemini kullanarak murin makrofaj hücre hatlarını siRNA'larla verimli bir şekilde transfekte etmek, makrofajları lipopolisakkarit ile uyarmak ve inflamatuar sitokin üretimi üzerindeki etkileri izlemek için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Burada, Legionella pneumophila (L. pneumophila) Sıvı kültürlerden dış zar vezikülleri (OMV'ler) saflaştırılmasını anlatmaktadır. Bu arıtılmış, veziküller daha sonra pro-enflamatuar bir potansiyel analiz etmek için makrofajların tedavisi için kullanılmaktadır.

Legionella pneumophila Dış Zar veziküller: İzolasyon ve Makrofajlar Onların Pro-inflamatuar Potansiyeli Analizi

Biz faktörler ana bilgisayar kodlama faaliyetlerini analiz için kullanılan her iki tüp bebek ve içinde vivo enfeksiyonu deneyleri tarif.

Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

Öğrenin, makrofaj içinde yetişen Listeria monocytogenes'ten bakteri RNA'sı izolasyonu yöntemini. Bu teknik, bakteri gen ekspresyonunu ve patogenez mekanizmalarını incelemek için yüksek saflıkta RNA sağlar.

RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen

Daha fazla video keşfet