Name: Radyoaktif Yüzeyler Karbon Dioksit Üretimi ölçümü Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Keşfedin Drosophila melanogaster'da radyoaktif substratlar kullanarak karbon dioksit üretimini ölçme yöntemini. Bu hassas teknik, enerji metabolizması ve genetik mutasyonların etkilerini araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazar, Dr. Mingjian Lu ve Morris Birnbaum'a NIDDK'dan (R21DK089391) yardımcı tavsiyeler ve finansman desteği için teşekkür eder.

Radyoaktif Metabolik Alt Tabakalar İçeren Fly Gıda 1. Hazırlık <ol><li> 2 uCi radyo işaretli substrat (D -glükoz [6- 14C] -glükoz, D [1- 14C] ya da [1- 14C] -palmitic asit, 40 - - 60 mCi / mikrofüj tüpüne, 1 karıştırın 15 ul FD &amp; C 1 numaralı mavi gıda boyası ile mmol) ve H2O 25 ul toplam hacim eşit. DİKKAT: Karbon-14 düşük enerji beta yayıcı ve havada kısa bir yelpazesine sahiptir. Ancak, radyoaktif işaretli moleküller veya deneyci tarafından kazara yutulması dökülmesi önlemek için özen gösterin. Gıda şişeler kolayca devrilebilir uçmak; radyo-sıvı formdadır, özellikle devrilme engellemek bir kap içinde barındırmak için emin (1.2 aşama) ya da unsolidified gıda (adım 1.4) de olabilir. Beslenen ediliyor ya da radyo CO 2 küçük miktarlarda nefes başlayacak radyoaktif işaretli substratlar beslenmiş Sinekler. Bu sinekler duman davlumbaz akrilik kutularda muhafaza ve küçük bir tabak KOH ca olmalıdırn CO 2 gaz yıkayıcı olarak kullanılmak üzere kutuya ayarlanmalıdır. </li><li> Pipetleyin boş sinek gıda şişenin dibine radyo-etiketli substrat ve mavi boya karışımı tüm (yükseklik: 9.4 cm, genişlik: 2.2 cm). </li><li> (- Gıda 10 ml içeren bir flakon için yüksek güç seviyesinde 20 saniye 15) gıda sadece sıvılaştırılmış kadar ısı standart bir mikrodalga fırında yemek uçmak. </li><li> Mavi rengin tekdüzelik izleme sıyırınız, girdap hızla radyoaktif işaretli substrat / mavi boya karışımına 975 ul erimiş gıda ekleyin. </li><li> 30 dakika - Gıda soğutmak ve 20 RT&#39;de tamamen katılaşmaya izin verin. </li></ol> Yetişkin Meyve Sinekler 2. Besleme Radyoaktif Metabolik Substratları <ol><li> Yetişkin anestezisi bir basınç regülatörü ile bir CO2 tankına akrilik bir baza kaynaştırılmış ve bağlı olan, gözenekli poli etilen CO2 anestezi cihazı kullanılarak uçar. / Dk 5 L anestezi cihazının içine CO 2 akış. <ol><li> aktarım anestezisi(- Şişe başına 30 sinekler n = 15) d radyoaktif işaretli, mavi boyalı gıda içeren flakon uçar. Cap köpük tıpa ile şişeler ve sinekler uyanmak kadar yatay dinlenme. Bir kapaklı akrilik bir kaba aktarın şişeler (180 cm x 180 cm x 240 cm yüksekliğinde). </li></ol></li><li> 2 için radyoaktif işaretli gıda sinekler aktarmadan önce 24 saat - - Kısa vadeli beslenmesi için, 18 için sinekleri açlıktan. 3 saat besleme adımı T o açlık adım önemlidir beslenen sinekler güvenilir kendilerine sunulan yiyecek yeni bir kaynak yemem çünkü . 5 boyunca uzun bir dönem için - 7 gün, sineklerin aç olmak zorunda değildir, ama deneyi sinek yerleştirilmiştir şişelerde radyo-etiketli gıda su içeriği kontrol ve şişeler su eklemek için bir iğne ve şırınga kullanmalıdır kuru gıda ile. </li><li> Aktarım, yeni bir şişenin içine &quot;dokunarak&quot; tarafından etiketsiz gıda uçar. 2 Bir başlangıç ​​kovalamaca dönemi - 4 saat sinekleri cuticles gelen radyoaktif işaretli gıda parçacıkları temizlemek için verir ve radyoaktif sindirimini sağlargut kalan Ed yiyecek. Mavi karınlarının aramak için sinek görsel muayene ile bağırsak yoluyla gıda ilerlemeyi izlemek. </li><li> Daha sonra, transfer, farklı yiyecek türleri uçan 96 saat genetik 18 ˚C veya 30 ° C&#39;de - - ya da ortam sıcaklıklarında (12 (12 etkilerinin ölçümü için standart yiyecek ya da% 1 agar üzerinde 24 saat solunum üzerinde açlık durumuna karşı beslenen) manipülasyonlar için, örneğin, ısıya duyarlı GAL80 (GAL80 ts) kullanılarak). Not: Bu takip süresinin uzunluğu deney gerçekleştirilmiştir ve tecrübesi dahilinde,. Örneğin için, 30 ° C&#39;de 96 saat takip amacıyla GAL80 ts kullanıldığı deneylerde gerekli olabilir, tam GAL4 bağımlı transgen ekspresyonu aktive etmek için. </li></ol> CO 2 -Collection Aparatı 3. hazırlanması <ol><li> 14 C-glikoz ya da 14 C-palmitik asit ve tha ile etiketlenmiş sinekler içerecektir inşa &quot;bakla fly&quot; malzemeleri, örgü kaplı tüpler birleştirint atmosfere açık kalacaktır. 25 mm uzunluğunda, yuvarlak dipli tüpler bırakarak, 12 mm x 75 mm polipropilen borular üst 50 mm kesti. 130 mikron naylon mesh 35 mm x 35 mm kareler hazırlayın. Ayrıca, bir teyp dispanser saydam bandı edinin. </li><li> CO 2 -Collection aparatları için malzeme birleştirin. Her bölmeyi sinek için 20 ml&#39;lik cam sintilasyon flakon, bir off-orta deliği olan kauçuk üst stoper, iyi üst stoper delikten eklenecek bir merkez, sınıf GF / B cam mikrofiber filtre kağıdı (2.1 cm çapında bir araya daire, 1 mikron gözenek). GF / B filtre kağıdı nedeniyle yüksek ıslak mukavemet ve yüksek yükleme kapasitesi kullanılmaktadır. </li><li> Kullanılacağı gün% 5 KOH taze hazırlayın. Sadece adım 3.4 önce katlamak ve de bu lastik En durdurucunun delikten geçirilir merkezine dairesel GF / B filtre kağıdı yerleştirin ve% 5 KOH 100 ul ile doyurulması. Şekil 1&#39;e bakınız. </li><li> etiketsiz medya, bir üzerinde inkübasyon (ler) aşağıdakinesthetize CO 2 ile uçar. Fırça naylon mesh ile kesme polipropilen tüpe, kap içine uçar, ve tüp örgü uymak için saydam bandı kullanın. sinekler uyanma ve örgü güvenli tüp yapıştırılmış edilmeden önce kaçan önlemek için hızlı bir şekilde çalışın. Sinekler eşit sayıda belirli bir deney için her sinek bölmesinde kullanılmalıdır; 10 - Sinek baklada 20 sinekler sintilasyon sayımı (aşağıda adım 4.1) ile ölçüm için yeterli radyoetiketli-CO 2 üretirler. </li><li> 20 ml&#39;lik bir cam sintilasyon şişesi uçucu bölmesini aktarın. kauçuk üst tıpa iyi KOH doymuş GF / B filtre kağıdı içeren bir merkez tutan cam şişe kap. cam sintilasyon şişenin dudak üzerinde lastik top stoper geniş üst katlayın. Şekil 1&#39;e bakınız. </li><li> Set cam kapaklı, akrilik kap içinde sinekler içeren şişeler ve zaman (2 ila 12 saat iyi çalışıyor) değişen sürelerle inkübe. </li></ol> Sonuçların 4. Analizi <ol><li> at4 ml sintilasyon kokteyli ihtiva eden bir 6 ml plastik ışınlama şişeye inkübasyon uncap cam şişeler ve aktarım KOH doymuş GF / B filtre kağıdı sonu. </li><li> Gerekirse, depolanan yüzeylerde daha sonra belirlenmesi için -80 ° C&#39;de kuru buz ve mağaza sinek bakla sinekler dondurma. Bu örnekler, radyoaktif ve buna uygun olarak saklanmalıdır unutmayın. </li><li> / UCi cpm belirlemek için 0.5 uCi radyoaktif işaretli substrat - arka plan olarak hizmet vermeye kullanılmayan GF / B filtre kağıdı içeren bir ve 0.1 içeren bir iki diğerleri: Ek sintilasyon şişeleri hazırlayın. </li><li> üreticinin protokolüne uygun olarak bir parıldama sayacı kullanılarak her numune için cpm ölçün. </li><li> Saatte sinek başına pmol 14 CO 2 / bgbm ve pmol 14 CO 2 hesaplayın. Her numune için cpm değeri arka plan cpm çıkarın. düzgün radyoaktif işaretli substrat verilerinden, arka plan düzeltilmiş cpm / numunenin uCi sayılır hesaplayın. <ol><li> Kullanİmalatçı tarafından sağlanan spesifik aktivite ve radyoaktif olarak işaretlenmiş alt-tabaka radyokimyasal konsantrasyonu (örneğin, 50 uCi / umol ve 0.1 uCi / ml, sırasıyla) pmol / cpm hesaplamak için kullanılır. Pmol 14 CO 2 / numune 14 CO 2 / numune cpm arka plan düzeltilmiş sinek pod verileri dönüştürmek için bu faktör kullanın. Sonra sinek sayısı ve sinek bölmesinde saat sayısına göre bölün. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+flies+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fruit flies in biomedical research.</a> Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).</li>
<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metabolic+homeostasis+and+nutrient+sensing+in+Drosophila%3A+implications+for+aging+and+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases.</a> Dis Model Mech. 7 (3), 343-350 (2014).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Deshpande, S. A., Carvalho, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Drosophila+food+intake%3A+comparative+analysis+of+current+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nat methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li>
<li>Bland, M. L., Lee, R. J., Magallanes, J. M., Foskett, J. K., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+supports+growth+in+Drosophila+by+regulating+muscle+activity+and+nutrient+uptake+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+biol%22%5BJournal%5D)">AMPK supports growth in Drosophila by regulating muscle activity and nutrient uptake in the gut.</a> Dev biol. 344 (1), 293-303 (2010).</li>
<li>Hulbert, A. J., Clancy, D. J., Mair, W., Braeckman, B. P., Gems, D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin%2FIGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Geront%22%5BJournal%5D)">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Exp Geront. 39 (8), 1137-1143 (2004).</li>
<li>Van Voorhies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+function+in+Drosophila+melanogaster+in+response+to+hypoxia+and+pure+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen.</a> J. Exp. Biol. 212 (19), 3132-3141 (2009).</li>
<li>Montooth, K. L., Marden, J. H., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+determinants+of+variation+in+energy+metabolism%2C+respiration+and+flight+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping determinants of variation in energy metabolism, respiration and flight in Drosophila.</a> Genetics. 165 (2), 623-635 (2003).</li>
<li>Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+metabolic+rate+in+Drosophila+using+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Measurement of metabolic rate in Drosophila using respirometry.</a> JoVE. (88), e51681(2014).</li>
<li>Icreverzi, A., de la Cruz, A. F., Van Voorhies, W. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+cyclin+D%2FCdk4+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+aging+and+sensitizes+animals+to+hypoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Drosophila cyclin D/Cdk4 regulates mitochondrial biogenesis and aging and sensitizes animals to hypoxic stress.</a> Cell cycle. 11 (3), 554-568 (2012).</li>
<li>Tuttle, S., Muschel, R., Bernhard, E., McKenna, W. G., Biaglow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+ability+of+cells+overexpressing+MYC+proteins+to+reduce+peroxide+and+hydroperoxides%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Decreased ability of cells overexpressing MYC proteins to reduce peroxide and hydroperoxides.</a> Br J Cancer. 27, 140-144 (1996).</li>
<li>Ontko, J. A., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+rate+of+oxidation+of+fatty+acids+in+animal+tissues.+Effect+of+substrate+concentration%2C+pH%2C+and+coenzyme+a+in+rat+liver+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the rate of oxidation of fatty acids in animal tissues. Effect of substrate concentration, pH, and coenzyme a in rat liver preparations.</a> J Biol Chem. 239, 3674-3682 (1964).</li>
<li>Vincent, A., Briggs, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((parkin-induced+defects+in+neurophysiology+and+locomotion+are+generated+by+metabolic+dysfunction+and+not+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">parkin-induced defects in neurophysiology and locomotion are generated by metabolic dysfunction and not oxidative stress.</a> Hum Mol Gen. 21 (8), 1760-1769 (2012).</li>
<li>Katz, J., Abraham, S., Hill, R., Chaikoff, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occurrence+and+mechanism+of+the+hexose+monophosphate+shunt+in+rat+liver+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The occurrence and mechanism of the hexose monophosphate shunt in rat liver slices.</a> J Biol Chem. 214 (2), 853-868 (1955).</li>
<li>Katz, J., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+glucose-C14+for+the+evaluation+of+the+pathways+of+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The use of glucose-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism.</a> J Biol Chem. 235 (8), 2165-2177 (1960).</li>
<li>Piper, M. D. W., Blanc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holidic+medium+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">A holidic medium for Drosophila melanogaster.</a> Nat methods. 11 (1), 100-105 (2014).</li>
<li>Sang, J. H., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Requirements+of+Axenically+Cultured+Drosophila+Melanogaster+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Nutritional Requirements of Axenically Cultured Drosophila Melanogaster Adults.</a> J Exp Biol. , (1961).</li>
<li>Chernick, S. S., Chaikoff, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+and+hepatic+utilization+of+glucose+for+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Insulin and hepatic utilization of glucose for lipogenesis.</a> J Biol Chem. 186 (2), 535-542 (1950).</li>
<li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+%22rate+of+living%22+model%3A+further+evidence+that+longevity+and+metabolic+rate+are+not+inversely+correlated+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Phys%22%5BJournal%5D)">Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster.</a> J Appl Phys. 97 (5), 1915-1922 (2004).</li>
</ol>

Yazar, rekabet eden herhangi bir mali çıkar beyan etmemektedir.

Bu protokol, yetişkin Drosophila melanogaster spesifik radyo-etiketli substratlar oksidasyonunun ölçülmesi için bir yöntem tarif eder. Bu teknik, basit kantitatif, tekrarlanabilir ve hassas olduğunu ve bunun ATP üretimi için okside besin (ler) tanımlamak için kullanılabilir, çünkü toplam CO2 üretimi ve O 2 tüketimi ölçmek mevcut yöntemleri tamamlar. Burada tarif edilen yöntem kullanılarak, belirli radyo-etiketli substratlar oksidasyonu sonucunda serbest CO2 ölçümü toplam CO2 üretimini ölçmek teknikleri tamamlayıcıdır. Toplam CO2 üretimi (V CO2) ve toplam O 2 tüketimi (V O2) bilindiği zaman, metabolizma hızı hesaplanabilir ve oksidasyon yakıt kaynağı solunum değişim oranına göre tahmin edilebilir (V metabolizma hızı tahmin edilebilir CO2 / V O2 = RER). Ne zamankarbonhidratlar özel alt tabaka, rer = 1, ama yağ asitleri özel kaynak, YEK = 0.7, glikoz ve lipit oksidasyon reaksiyonlarının stokiyometri nedeniyle zaman. Drosophila 14 oksijen tüketimini ölçmek için ekipman yokluğunda, oksidatif yakıt kaynağı tespit edilemez. Etiketleme iz bir radyoaktif substrat veya başka miktarları ve radyoaktif olarak işaretlenmiş CO2 üretimi ölçüm oranları ile uçar tarafından Ancak, bir uyaranın sırasında veya etkileri ile ilgili farklı zaman noktalarında belirli bir alt tabakayı okside sineklerin yeteneği hakkında sonuçlar çıkarabiliriz yakıt oksidasyonu üzerindeki mutasyon verilen. Bu protokol kritik adımlar vardır. dökülmelerini ve araştırma alanlarının kirlenmesini önlemek için radyoaktif maddeleri kullanırken Birincisi, dikkatli olunmalıdır. Adımlarda 2.1 ve 3.4 sırasında sinekler anestezi İkincisi, deneyci uzun süreli CO 2 etkilerinden kaçınmak için hızlı bir şekilde çalışması gerekirmetabolizma ve davranışları üzerindeki poz. 20 sinek bir grup anestezi ve yeni bir şişeye ya da 20 saniye ya da daha az bir uçucu bölmesine aktarılabilir. Bir gıda flakon bir anestezi cihazının transfer olduğunda, şişe gıda yüzeyine yapışmış getting anestezi sinekler önlemek için, yan dinlenmiş olmalıdır. sinekler adım 2.2 olarak birkaç gün boyunca beslenen radyoaktif işaretli gıda olduğunda, deneyci sinekler dehidrasyon duyarlı gıda kurumasına olmadığını sigorta gerekir. beslenen veya aç karnına önce etiketleme, etiketin seçimi, etiketleme süresi uzunluğu, uçucu bölmesinde süre ve anestezi yöntemi, bu yöntem kullanıldığında sorun giderme ve değişikliğe tabi tutulabilir parametrelerdir. (- 3 saat 2) önceden açlık süresi tabi olmadıkça radyoaktif işaretli gıda önemli miktarlarda tüketmek olası değildir Birincisi, kısa etiketleme dönemlerine tabi sinekler. Etiket c İkincisi, seçimBir tek metabolik fenotipleri hakkında çizebilir sonuçları etkiler. Örneğin, d-radyo işaretli CO2 üretimi [1- 14C] -glükoz, sitrik asit döngüsü ve pentoz fosfat şant vasıtasıyla oksidasyon yansıtabilir D- radyo işaretli CO2 üretimi ise [6- 14C] -glükoz oksidasyon yansıtır sitrik asit döngüsü boyunca sadece 12,15,16. Temel bir amino asit 17,18 için bir radyo-etiketli izleyici ile sinekler besleme proteinlerden türetilen amino asitlerin oksidasyonu değerlendirmek için bir strateji olabilir. Son olarak, radyo işaretli glukoz ile uzun etiketleme süreleri de trigliseritler 19 ve hali hazırda piruvat ile interconverts alanin gibi amino asitler gibi moleküllerin diğer sınıflarına Bu ön-maddesinin dahil olma ihtimalini artırır. Bu moleküllerin 6, bu farklı sınıflara dahil radyoaktivite ölçümü ile değerlendirilebilir. Gerçekten de, sinekler ayrı kohortlar beslenebilir radAynı şekilde alt tabakaların iolabeled ve daha sonra, örneğin, koşullar 6 saklanır ve beslenen glikojen ve trigliserid kalır ve aç bırakılmış olan uçucu bölmesi deneyler ya da radyo-ölçümü için de kullanılır. Başka bir strateji radyoaktif işaretli diyet besin oksidasyonunu kendileri ve bu besinlerin değil depolama biçimlerini ortaya çıkarmak için muhtemel kısa etiketleme dönemlerini kullanmaktır. Üçüncü olarak, sinekler iki grup, ilk zaman belirli bir miktar üzerinden 14 CO 2 üretimi benzer oranları, ama çok farklı oranlarda sahip olabilmesi de mümkündür. Bu nedenle, sinek bölmesine harcamak uçar süreyi değişen fenotipik varyasyon değerlendirirken değiştirmek için önemli bir parametre olabilir. Son olarak, bu protokol CO 2 anestezi sinek pod cihazı içine sinekler koyarak kısa bir süre kullanımı için çağırır. CO 2 anestezi sinek pod deney boyunca metabolik fonksiyonu etkileyebilir mümkündür. Alternatif birpproach metabolizma hızı 20 etkilemez azot anestezi kullanmaktır. Yakıt oksidasyon ve metabolizma hızı gibi karmaşık bir sistemi ölçen herhangi tekniği ile olduğu gibi, burada anlatılan yöntem sınırlamaları vardır. Birincisi, alt tabakanın farklı başlangıç ​​miktarları ile testinin CO2 toplama safhasına girecek ve böylece radyoaktif işaretli gıda farklı miktarlarda tüketmek olabilir farklı gruplarda uçar ve mümkündür. Bu büyük örneklem büyüklüğü ile deney yaparak ve topluca sinekler beslenerek bir ölçüde kontrol edilebilir. benzer mavi renkli bağırsaklar radyoetiket tüketilen ve deney kovalamaca kısmına taşınabilirler kısa etiketleme süreler için, uçar. sinekler grupta geri kalan radyo-miktarı da deneyin sonunda ve besleme ve ilk takip süresinin sona ermesinden sonra sinekler ayrı gruplar halinde ölçülebilir. arasında ikinci, aktivite düzeylerisinek bakla sinek grupları farklı olabilir. Bu deneysel olarak belirlenen ve veri yorumlanırken dikkate alınması gerekecektir. Üçüncü olarak, bu teknik, toplam CO2 üretimi, belirli bir beslenme besin veya besin depolama form (lar) sadece üretimini ölçmek değildir. Bu protokol için bir yedek değil ama farklı ve ek bilgi sağlar, çünkü yerine VCO 2 ölçümlerine tamamlayıcıdır. Burada tarif edilen yöntem, belirli bir metabolik maddelerin eser miktarlarda oksidasyon ürünü olan, radyo-etiketli CO2 nefes verme ölçer. glikoz, yağ asitleri, ya da amino asit - - kullanılan etiket değiştirerek tarafından böyle bir açlık olarak ve farklı genetik geçmişleri farklı fizyolojik koşullar altında metabolizma farklı yüzeylerde katkılarını değerlendirmek için giderek sofistike deneyler tasarlayabilirsiniz. Bu tekniğin gelecekte uygulamaları metabolis ölçülmesini içerirgelişme larva ve pupa aşamaları sırasıyla besin depolama ve arıza, aşırı ile karakterize edilir Drosophila yaşam döngüsü, iki kademeli m.

Model organizma Drosophila melanogaster çalışma genetik ilkeleri, gelişim süreçleri, büyüme, yaşlanma, davranış, bağışıklık ve insan hastalığı 1,2 anlaşılmasına büyük katkıda bulunmuştur. Drosophila genetik ve hücre biyolojik yaklaşımlar sayısız Bu alanlarda ilerleme sürdü. Bununla birlikte, meyve sineği metabolizma çalışması, daha yavaş gelişmiş bir küçük bir hayvan metabolik parametreleri ölçmek zorluklara büyük oranda yer alır. Diyabet gibi insan hastalıklarının araştırılmasında bir model olarak Drosophila kullanarak büyüme ve çeşitli patolojiler için metabolizma katkıları anlamak için ilgi geliştirmek ve bu organizma 3,4 metabolik teknikleri adapte alan itti. Güvenilir yöntemler artık meyve sineğinin metabolik parametrelerin bir dizi ölçümü için kullanılabilir. Örneğin, gıda alımını değerlendirmek basittir <s&gt; 5 kadar, depolanan trigliseridler ve glikojen, hem de glikoz dolaşımdaki hemolimf düzeyleri ve glukoz 4 iki molekül oluşan bir disakkarittir sinek, trehaloz, büyük sirkülasyon şeker seviyeleri. Metabolik izleyiciler kullanılması gibi depolama formları glikojen ve trigliserid 6 glukoz gibi diyet ve emilen besinlerin dönüşümünden besin emilimi çalışma sağladı. Metabolik oranları meyve oksijen tüketimi 7,8 ve karbondioksit ölçümü üzerinden uçmak (CO 2) üretiminde değerlendirilebilir. sitrik asit döngüsü, diyet ve depolanmış karbonhidrat ve yağ asitlerinin metabolizması türetilir asetil koenzim A (CoA) gibi döngüsü girebilir iki karbon birimleri okside eder. Döngüsünün her turlu bir GTP (veya ATP) her molekülü ve elektron donör FADH 2, NADH üç molekülleri ve atık ürün CO 2 iki molekülleri üretir. CO 2 üretimi canBazal metabolizma hızı tahmin etmek için kullanılabilir. Toplam CO2 üretimi ticari olarak temin edilebilen ya da el yapımı respirometers 9-10,11 kullanımı yoluyla Drosophila belirlenebilir. Özellikle O 2 tüketimi ölçümü ile birleştiğinde, toplam CO2 üretiminin ölçümü, tüm vücut enerji metabolizmasında değerli bilgiler sağlar. Bununla birlikte, besin tanımlamaz bu önlem adenosin trifosfat (ATP) üretilmesi için oksitlenmektedir. karbonhidratlar, yağlı asitler ve proteinler: besin maddelerinin üç önemli sınıfı asetil CoA sitrik asit döngüsü, aşağıdaki dönüştürme girebilir. Glukoz-6-fosfat, diyet glukoz veya depolanan glikojen türetilen, asetil CoA oluşturur piruvat dehidrojenaz ile dekarboksile edilir piruvata dönüştürülebilir. daha sonra sitrik asit döngüsü girer asetil CoA SS-oksidasyon verimleri ile diyet veya hafızaya trigliseridlerden türetilen yağ asitlerinin dağılımı. En sonundaAmino asitlerin bir kısmı alfa-ketoglutarat CoA ya ​​da sitrik asit döngüsü ara-asetil, piruvata dönüşümü takip sitrik asit döngüsü girebilir. bazal ve uyarılmış koşullarında enerji metabolizması Besin özel katkı radyoaktif izleyiciler kullanılarak izlenebilir. Burada sunulan protokol kültür 12,13 yetiştirilen hücrelerde oksidasyon değerlendirmek için kullanılan bir protokol Drosophila kullanım için uyarlanmıştır. Bu yaklaşımda, meyve sinekleri beslenen 14C-radyo işaretli metabolik substratlar (karbonhidratlar, yağlı asitler ya da amino asit) kısa bir süre (saat) diyet ya da uzun süre (gün) darbe, etiketlenmemiş gıda takip ve sonra maruz bırakılmıştır odası bikarbonat gibi solunan CO2 yakalama için potasyum hidroksit (KOH) -saturated filtre kağıdı ihtiva etmektedir. Radyo-işaretli bikarbonat sintilasyon sayımı ile tayin edilebilir. Deney arasındaki radyo etiketli-CO2 üretimi farklılıklarsinekler ark grupları, örneğin genotip arasındaki yakıt metabolizmasında uzun bir hızlı veya içsel farkları boyunca ATP üretimi için farklı yakıt kullanımını yansıtabilir.

<table><tbody><tr><td>PALMITIK ASIT, [1-14C] -, 50 & MIKRO; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC075H050UC</td><td></td></tr><tr><td>GLUKOZ, D- [6-14C] -, 50 & mikro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC045X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz, D- [1-14C] -, 50 & Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC043X050UC</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Şişeleri, Dar, Polistiren</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak Tabanlı Polipropilen Tüpler, 12 x 75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959AA</td><td></td></tr><tr><td>Mesh, nitex naylon, 120 & mikro; m</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>20 ml borosilikat cam sintilasyon şişeleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-15</td><td></td></tr><tr><td>Merkez dışı delikli şişe üst durdurucu</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882310-0000</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen merkez kuyusu</td><td>Fisher Scientific</td><td>K882320-0000</td><td></td></tr><tr><td>Whatman GF/B cam mikrofiber filtre kağıdı, daire, 2,1 cm çap</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-874-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>Ulusal Teşhis</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Push-On/Twist-Off Kapaklı Sintilasyon</td><td>Şişeleri National Diagnostics</td><td>SVC-06</td><td></td></tr></tbody></table>

radyoaktif yüzeyler karbon dioksit Üretimi ölçümü<em&gt; drosophila melanogaster</em

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

Drosophila genetiği gücü giderek hormon sinyalizasyon ve metabolizma soruların ve bu organizmanın insan hastalık modellerinin geliştirilmesi için uygulanmaktadır. Böyle metabolik oranları gibi parametrelerin ölçümleri için hassas metotlar, meyve sineği gibi küçük hayvanlarda fizyoloji ve hastalığın daha iyi anlaşılmasını götürmek için gereklidir. Burada anlatılan yöntem, glikoz veya yağ asidi olarak 14 C-etiketli yüzeylerde eser miktarda içeren yiyecekleri beslenen yetişkin sineklerin az sayıda yakıt oksidasyonu değerlendirir. Besleme süresi ve herhangi bir ek deneysel manipülasyon sonra, sineklerin, radyo-etiketli CO2 potasyum bikarbonat gibi radyo-etiketli substratlar oksidasyonu sonucunda elde sonra trans nefes verme KOH doymuş filtre kağıdı içeren cam şişelere yerleştirilir mesh başlıklı kısa tüpler aktarılır KHCO 3. Bu radyo-etiketli bikarbonat, sintilasyon sayımı ile ölçülür. Bu aq olduğunuYakıt oksidasyon çalışmaları için, uantitative tekrarlanabilir ve basit bir yaklaşım. Radyo-etiketli glükoz, yağlı asitlerin ya da amino asitlerin kullanılması, besleme ve aç kalma gibi, farklı genetik geçmişlerde, farklı koşullar altında bir enerji metabolizması için bu farklı yakıt kaynaklarının katkı belirlenmesini sağlar. Bu in vivo enerji metabolizmasında ölçmek için kullanılan diğer yaklaşımları tamamlamaktadır ve metabolik regülasyon anlayışı ilerletmek gerekir.

Bir radyoaktif substrat metabolizmasında üretilen nefesle ve tuzak radyoaktif işaretli CO2 miktarı bir sinek bölmesinde sineklerin sayısı yanı sıra hayvanlar CO2 toplama aparatı geçirdikleri zamanın miktarı ile ilişkili olmalıdır. Bunu test etmek için, 18 saat aç bırakıldı gerçekleştirilen 2 st için radyo-etiketli palmitik asit (0.02 uCi / ul Gıda) beslenir ve daha sonra 3 veya 6 saat inkubasyon için 12 ya da 25 hayvan gruplarında radyo işaretli CO2 üretimi için test edildi. 25 sinekler tarafından üretilen CO 2 miktarının 12 sinekler tarafından üretilen neredeyse iki katı miktarı oldu, ve her bir grup için miktar inkübasyon süresi 6 saat (Şekil 2A) 3 saat çıkarılmıştır zaman ikiye katlandı. Pmol 14 CO 2 / sinek / saat her grupta neredeyse eşdeğer oldu. Oruç ß o tarafından yağ asitlerinin parçalanmasını uyarırxidation; Bu nedenle, yağ asidi oksidasyon CO2 üretimi beslenen hayvanlara kıyasla aç bırakılmış olan hayvanlarda yüksek olmalıdır. Bu durumda olup olmadığını belirlemek için, 18-saat gerçekleştirilen 2 st için radyo-etiketli palmitik asit beslenmiştir aç. Bu kısa besleme puls sonrasında sinekleri, iki gruba ayrıldı ve 3 saat etiketlenmemiş sinek yiyecek ya da% 1 agar aktarılır ve daha sonra 2 saat boyunca bölmeleri kalkan aktarılır. Iki ayrı deneylerde, ß oksitleme aç bırakılmış hayvanlarda artmıştır gösteren gıda (Şekil 2B) üzerindeki takip sinekler kıyasla agar üretilen önemli ölçüde daha radyo-etiketli CO 2 takip sinekler. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig1.jpg" /> Şekil 1. Ekshale Toplama için cihaz, Radyoaktif CO 2. radyoaktif işaretli metabolik substratlar tüketilen Sinekler vardırBir &quot;sinek pod&quot; (FP), örgü (M) ile şapkalı bir kesim santrifüj tüpü içine yerleştirilmiş. Uçucu bölmesi 100 ul, doymuş GF / B filtre kağıdı içeren bir merkez de (CW) yerleştirilmesi yoluyla grimsi merkez deliği içeren bir lastik En durdurucu, (S), bir 20 ml&#39;lik bir cam sintilasyon şişesi içine yerleştirilir ve kapatılmış olan % 5 KOH. Nefes verme CO2 KOH ile reaksiyona girer ve bikarbonat gibi filtre kağıdı üzerinde tutulur. Trapped, radyoaktif işaretli CO2 doymuş filtre kağıdının sintilasyon sayımı ile tayin edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54045/54045fig2.jpg" /> Şekil 2. Zaman ile 14 CO 2 Üretim İlişkileri ve içinde Sineklerin sayısıFed ve oruç Koşullarına Fly Pod ve Tepki. (A), radyo etiketli palmitat beslenen sinekler üretilen 14 CO 2 miktarı (n = 12 (açık çubuklar) ya da 25 (kapalı barlar)) bir sinek bölmesine geçirdi ve zaman (3 veya 6 saat test edilen sineklerin sayısı ile ilişkilidir ). Başına sinek temelinde, sinekler 0.99, 1.13, 1.10 ve 1.01 pmol 14 CO 2 / hr (grafik veri olarak doğru sıralamayla aynı sol listelenen veriler) üretti. (B) gıda kovaladı sinekler daha palmitat daha radyoaktif işaretli okside agarda kovalanan Sinekler. Veriler, iki deneyden ve standart sapma olarak rapor edilir, n = 16-17 sinekler / grup (deney 1); n = 10 sinekler / grup (deney 2). * P = 0.017, Student t-testi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54045/54045fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Bu makale, Drosophila melanogaster'de yakıt oksidasyonunun ölçümü için eser miktarda spesifik radyoaktif işaretli metabolik substratların sineklere beslendiği bir yöntemi açıklamaktadır. Yakıt oksidasyonundan üretilen solunan radyoaktif işaretli CO2 toplanır ve ölçülür.

Radyoaktif Yüzeyler Karbon Dioksit Üretimi ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

Bu protokolün genel amacı, palmitik asit veya glukoz gibi radyolojik olarak işaretlenmiş substratlar kullanılarak, sağlam meyve sinekleri tarafından üretilen karbondioksiti ölçmektir. Bu yöntem, belirli bir mutasyonun enerji metabolizmasını etkileyip etkilemediği gibi, Drosophila araştırmacıları için temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, az sayıdaki meyve sineğinde yakıt oksidasyonunun kantitatif, hassas ve tekrarlanabilir ölçümlerine olanak tanımasıdır.Sineklerin anesteziden uyanmasından önce deneysel düzeneğin doğru şekilde kurulmasını sağlamak için sinek kapsülü montaj adımları küçük parçaların hızlıca manipüle edilmesini gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Karbon-14 düşük enerjili bir beta yayıcıdır ve havada kısa bir menzile sahiptir, ancak radyolojik olarak işaretlenmiş moleküllerin dökülmesini veya deney yapan kişi tarafından yanlışlıkla yutulmasını önlemek için yine de dikkatli olunmalıdır. Toplam 25 microliters hacim elde etmek için bir ila iki microcurie radyolojik olarak işaretlenmiş substratı, 15 microliters FD&C Number One mavi gıda boyası ve su ile karıştırın.Radyoetiketli substrat ve mavi boya karışımının tamamını boş bir sinek besin tüpünün dibine pipetleyin. Sinek besin tüpleri kolayca devrilebildiği için, onları devrilmelerini önleyecek bir kap içerisinde muhafaza ettiğinizden emin olun. Standart sinek besinini, besin tam olarak sıvılaşana kadar mikrodalga fırında ısıtın.10 mililitre gıda içeren bir flakon için genellikle yüksek güç seviyesinde 15 ila 20 saniye yeterlidir. Erimiş gıdanın 975 mikrolitresini radyolojik olarak işaretlenmiş substrat ve mavi boya karışımına ekleyin ve tam karışım sağlandığından emin olmak için mavi rengin homojenliğini izleyerek hızlıca çalkalayın. Viskoz erimiş gıdanın doğru şekilde pipetlenmesine olanak tanımak için, pipet uçlarının dar ucu makasla kesilerek genişletilmesi gerekebilir.Yemin oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika boyunca tamamen soğumasını ve katılaşmasını bekleyin. Erişkin sinekleri anesteziye almak için, akrilik bir tabana sabitlenmiş gözenekli polietilenden oluşan ve basınç regülatörlü bir karbondioksit tankına bağlı olan bir karbondioksit anestezi cihazı kullanılır. Anestezi cihazına dakikada beş litre hızında karbondioksit akışı sağlayın.Anestezize edilmiş sinekleri radyoaktif olarak işaretlenmiş mavi boyalı yem içeren viallere aktarın. Her vialin ağzını köpük tıpa ile kapatın ve sinekler uyanana kadar yatay konumda bekletin. Vialleri kapaklı bir akrilik kaba yerleştirin.Kısa süreli besleme için, sineklerin iki ila üç saatlik besleme adımı sırasında yemek yemelerini sağlamak amacıyla, radyolojik olarak işaretlenmiş gıdaya aktarılmadan önce 18 ila 24 saat boyunca aç bırakın. Beş ila yedi gün süren uzun süreli beslemede sineklerin aç bırakılmasına gerek yoktur; ancak deney yapan kişi, viallerdeki radyolojik olarak işaretlenmiş gıdanın su içeriğini izlemeli ve kuru gıdaya sahip viallere bir iğne ve şırınga yardımıyla su eklemelidir. Radyolojik olarak işaretlenmiş substratla besleme süresi sona erdiğinde, sinekleri yeni bir vialle vurarak işaretlenmemiş gıdaya aktarın.İki ila dört saatlik başlangıç takip süresi, sineklerin kütiküllerindeki radyoyapılı gıda partiküllerini temizlemesine ve bağırsakta kalan radyoyapılı gıdanın sindirilmesine olanak tanır. Gıdanın bağırsaktaki ilerlemesini, mavi abdomenleri kontrol etmek için sineklerin görsel muayenesi ile izleyin. Ardından, sinekleri farklı gıda türlerine veya ortam sıcaklıklarına aktarın.Bu takip süresinin uzunluğu, gerçekleştirilen deneye göre değişiklik gösterecektir. Karbondioksit toplama düzeneğini hazırlamadan önce, C-14 glikoz veya C-14 palmitik asit ile işaretlenmiş sineklerin konulacağı ve atmosfere açık kalacak olan ağ kapaklı tüpler olan sinek kapsüllerini oluşturmak için malzemeleri bir araya getirin. Bir jiletle hemostatı kıskaçlayın, Bunsen beki alevinde kızarana kadar ısıtın ve ısıtılmış jileti kullanarak 12 mm x 75 mm'lik polipropilen tüplerin üstten 50 mm'lik kısmını kesin; böylece 25 mm uzunluğunda yuvarlak tabanlı tüpler elde edin.130 mikron naylon ağdan 35 milimetreye 35 milimetrelik kareler hazırlayın. Bir buçuk ila iki inç uzunluğunda birkaç şeffaf bant parçası kesin. Ardından, karbondioksit toplama düzeneği için malzemeleri bir araya getirin.Her bir sinek kapsülü için 20 mililitrelik cam sintilasyon şişesi, merkez dışı delikli kauçuk tıpa, merkezi kuyu ve GFB derece cam mikrofiber filtre kağıdı hazırlayın. Merkezi kuyuyu üst tıpadaki delikten içeri yerleştirin. %5 potasyum hidroksiti kullanım gününde taze olarak hazırlayın.Sinekleri fly pod'a aktarmak için anestezi uygulamadan hemen önce, dairesel GFB filtre kağıdını katlayarak kauçuk üst tıpanın deliğinden geçirilen orta kuyuya yerleştirin ve 100 µL %5 potasyum hidroksit ile doyurun. Anestezize edilmiş sineklerin fly pod'lara aktarılması, bu protokolün en zor adımıdır. Başarıyı sağlamak için gerekli tüm malzemeleri yakınınızda bulundurun; sineklerin karbondioksite maruz kalma süresini sınırlamak ve ağ düzeneği tüpe güvenli bir şekilde sabitlenmeden önce sineklerin uyanıp kaçmasını önlemek için hızlı çalışın.Etiketsiz besiyerlerinde yapılan inkübasyonların ardından, sinekleri karbondioksit ile anesteziye alın. Anestezize edilmiş sinekleri fırça yardımıyla ucu kesilmiş polipropilen tüpe aktarın, naylon ağ ile kapatın ve ağı tüpe sabitlemek için şeffaf bant kullanın. Belirli bir deney için her bir sinek podunda eşit sayıda sinek kullanılmalıdır.Sintilasyon sayımı ile ölçüm yapmak için sinek podu başına 10 ila 20 sinek, yeterli miktarda radyolojik olarak işaretlenmiş karbondioksit üretir. Sinek podunu 20 milliliter'lik cam sintilasyon tüpüne aktarın. Cam tüpün ağzını, potasyum hidroksit ile doyurulmuş GFB filtre kağıdı içeren merkezi bir kuyuya sahip kauçuk uçlu tıpa ile kapatın.Kauçuk uçlu tıpanın geniş üst kısmını, cam sintilasyon şişesinin ağzına doğru katlayın. Sinekleri içeren cam şişeleri kapaklı akrilik bir kaba yerleştirin ve farklı süreler boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonunda cam şişenin kapağını açın ve potasyum hidroksit ile doyurulmuş GFB filtre kağıdını, 4 mL sintilasyon kokteyli içeren altı mililitrelik plastik bir sintilasyon şişesine aktarın.Arka plan olarak hizmet edecek kullanılmamış GFB filtre kağıdı içeren bir adet ve mikrocurie başına dakika başına sayımı belirlemek için 0,1 ila 0,5 microcurie radyolojik olarak işaretlenmiş substrat içeren bir veya iki adet ek sintilasyon tüpü hazırlayın. Bir sintilasyon sayacı kullanarak, üreticinin protokolüne göre her bir örnek için dakika başına sayımı ölçün. Ardından, protokol metninde açıklandığı şekilde toplam karbondioksit üretimini hesaplayın.Sinekler 18 saat boyunca aç bırakılmış, iki saat boyunca radyolojik olarak etiketlenmiş palmitik asit ile beslenmiş ve ardından üç veya altı saatlik inkübasyonlar için 12 veya 25 hayvandan oluşan gruplar halinde radyolojik olarak etiketlenmiş karbondioksit üretimi açısından test edilmiştir. Bu grafikte gösterildiği üzere, 25 sinek tarafından üretilen karbondioksit miktarı, 12 sinek tarafından üretilen miktarın yaklaşık iki katıydı ve inkübasyon süresi üç saatten altı saate çıkarıldığında her grubun ürettiği miktar iki katına çıktı. Sinek başına saat başına düşen pikomolar radyolojik olarak etiketlenmiş karbondioksit miktarı her grupta neredeyse eşitti.Açlık, beta oksidasyon yoluyla yağ asitlerinin yıkımını stimüle ettiğinden, aç bırakılmış hayvanlarda yağ asidi oksidasyonundan kaynaklanan karbondioksit üretimi, beslenen hayvanlara kıyasla yüksek olmalıdır. Bunu test etmek için, 18 saat aç bırakılmış sineklere iki saat boyunca radyolojik olarak işaretli palmitik asit verilmiş, sinekler iki gruba ayrılmış ve ardından işaretlenmemiş sinek yemine veya %1 agar ortamına aktarılmıştır. İki ayrı deneyde, agar üzerinde takip edilen sineklerin, yem üzerinde takip edilen sineklere göre anlamlı derecede daha fazla radyolojik olarak işaretli karbondioksit ürettiği görülmüş; bu durum, aç bırakılan hayvanlarda beta oksidasyonun arttığını göstermiştir.Bu prosedürün ardından, tercih edilen yakıt kaynağının ne olduğu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla toplam karbondioksit üretimi ve toplam oksijen tüketiminin ölçülmesi ve solunumsal değişim oranının hesaplanması gibi tamamlayıcı yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, belirli bir mutasyonun veya deneysel manipülasyonun, belirli bir yakıtın enerji kaynağı olarak kullanılabilme yeteneği üzerindeki etkisini belirlemek için bu protokolün nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Radyoaktivite ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takmak ve uygun zırhlama kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

measurement-carbon-dioxide-production-from-radiolabeled-substrates

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, E. coli'yi  Drosophila melanogaster'in göğüs kafesine enjekte ettikten sonra E. coli bakteri yükünü ölçmek için bir teknik gösteriyoruz.

E. coli Enfeksiyonunu Takiben Drosophila melanogaster'de E. coli Bakteri Yükünün Ölçülmesi

Metabolik bozukluklar, insanlarda en yaygın hastalıklardan biri arasında yer alıyor. Genetik uysal bir model organizma D. melanogaster metabolizmasını düzenleyen yeni genleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu çalışma da CO 2 üretimini ölçerek sinekler metabolizma hızı okuyan sağlayan nispeten basit bir yöntem tarif etmektedir.

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Bu yazıda, oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila permeabilized thoraxes içinde kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu teknik doku klasik mitokondrial yalıtım tekniği için karşılaştırıldığında çok az bir miktar gerektirir ve elde edilen sonuçlar daha fizyolojik ilgilidir.

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

Biz oksijen tüketimi ve Drosophila melanogaster larva ve yetişkin Beynindeki hücre dışı asitleştirme ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bir metabolik analyzer adapte ve en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı ile kullanılmaktadır. Mikro-doku bağlar bu protokolü kritik bileşenidir ve tasarlanmış ve bunların kullanımı bu analizi için özel olarak yaratılmıştır.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

Kulometrik respirometri, küçük organizmaların metabolik hızını ölçmek için idealdir. Bu çalışmada Drosophila melanogaster için uyarlandığında, ölçülenO2 tüketimi, önceki çalışmalarda vahşi tip D. melanogaster için bildirilen aralık içindeydi. Daha küçük ve daha az aktif olan CASK mutantları tarafından sinek başınaO2 tüketimi, vahşi tipten önemli ölçüde daha düşüktü.

Kulometrik Mikrorespirometri Kullanılarak Drosophila melanogaster'de O2 Tüketiminin Ölçülmesi

Bu yazıda, merkezi sinir sistemi incelemek için nasıl üçüncü instar Drosophila larvaları göstermektedir.

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Böcekler, oenocytes cuticular hidrokarbon bileşikleri üretir. Bu bileşikler kuruma karşı korumak ve kimyasal iletişimi kolaylaştırmak. Burada yetişkin oenocytes izole etmek için kullanılan bir diseksiyon tekniği...

Yetişkin gelen Oenocytes diseksiyonu Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster testisler hızla ve verimli bir şekilde diseksiyon iğneleri kullanarak yetişkin erkekler izole. Uygulama ile kolayca yüksek verim sıralama ya da daha geleneksel bir moleküler biyoloji yöntemleri ile DNA veya RNA veya protein analizi için yeterli antikor veya enzim tabanlı deneyleri için testislerin bir ya da iki gün içinde bir miktar ayırabilirsiniz.

İzolasyonu Drosophila melanogaster Testisler

Keşfedin Drosophila melanogaster'da radyoaktif substratlar kullanarak karbon dioksit üretimini ölçme yöntemini. Bu hassas teknik, enerji metabolizması ve genetik mutasyonların etkilerini araştırmak için kullanılır.

Radyoaktif Yüzeyler Karbon Dioksit Üretimi ölçümü

Daha fazla video keşfet