Deri Cerrahi denervasyon: Cilt Hastalıkları Fare modelleri Sinirler için Gereği Test Bir Yöntem
26 Haziran 2016
Bu makale, fare derisinin genetik etiketlemesi, cerrahi denervasyon, deri biyopsisi ve tam montajlı β-galaktosidaz boyama ile etiketli epitelin görselleştirilmesi için ayrıntılı protokoller içerir. Bu yöntemler, normal ve patolojik cildin fare modellerinde sinir gereksinimini test etmek için kullanılabilir.
Bu prosedürün genel amacı, sinirlerin normal ve patolojik cilt üzerindeki etkisini incelemektir. Bu yöntem, kutanöz sinirlerin homeostazı ve hastalığı etkileyip etkilemediği gibi normal cilt biyolojisindeki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, aynı hayvandan alınan sağlam ve denerve edilmiş deri örneklerini karşılaştırabilmenizdir.
Bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü sinirlerin tanınması ve çevre dokulara minimum hasarla çıkarılması zor olabilir. İlk olarak, fareyi uyuşturun ve bir ayak parmağı tutamını kullanarak uygun sedasyon düzlemine ulaşıp ulaşmadığını kontrol edin. Ayrıca, farenin normal solunum ve kalp atışı sergilediğini onaylayın.
Şimdi hayvanı aseptik bir cerrahi alanda bir ısıtma pedine yerleştirin. Elektrikli bir kesme makinesi kullanarak, biyopsinin alınacağı sırt tarafındaki saçları dikkatlice çıkarın. Daha sonra traş edilen bölgeyi Betadyne ve alkollü mendiller kullanarak silin.
Tüm saç kırpıntılarının bölgeden çıkarıldığından emin olun. Şimdi siyah bir işaretleyici kullanarak biyopsi bölgesini ana hatlarıyla belirtin. Saç foliküllerinin uzunlamasına kesitlerini elde etmek için, biyopsinin daha uzun kenarı, dorsal orta hatta parasetidal olarak önden arkaya doğru uzanmalıdır.
Bir neşter kullanarak, altta yatan kas fasyasına zarar vermeden tam kalınlıkta bir eksizyon yapın. Kanama tipik olarak minimaldir. Biyopsi örneği epidermis, dermis, deri altı yağ ve panniculus carnosus'u içermelidir.
Eksize edilen cilt örneğini dermis tarafı aşağı bakacak şekilde kuru bir kağıt havlu üzerinde düzleştirin. Fazla kağıt havluyu kesin ve diğer numunelerin toplanması gerekiyorsa, numuneyi bir saate kadar soğuk TBS'de saklayın. Fareye geri dönersek, yaklaşık üç milimetre aralıklarla 60 naylon dikiş kullanarak biyopsi bölgesini dikin.
Ardından, bilincini geri kazanana kadar fareyi bir kurtarma kafesinde izleyin. Belirlenmiş kurumsal hayvan bakımına uygun olarak analjezik kullanın ve fare sıkıntılı görünüyorsa yönergelerini izleyin. Ameliyattan sonraki yedi ila 10 gün içinde dikişleri çıkarın.
Biyopsileri histoloji veya tam montajlı boyama için işlemeye devam edin. Hayvanı uyuşturun, tüm sırt derisini tıraş edin ve biyopsi işlemine benzer şekilde alanı temizleyin. Şimdi, boynun tabanından kuyruğun yaklaşık yarım santimetre yukarısına kadar dorsal orta hat boyunca steril bir neşter kullanarak bir kesi yapın.
Steril künt forseps kullanarak, boynun yakınındaki skapular yağ yastıkçıklarından arka bacağın hemen üstüne kadar altta yatan dokuyu görselleştirmek için sol taraftaki cildi yandan nazikçe geri çekin. Şimdi dorsal kutanöz siniri diseksiyon ışık mikroskobu altında tanımlayın. Bunlar, keskin kıvrımlar yapmadan ve cildin altındaki gevşek bağ dokusuna girmeden önce gövde duvarının yarı saydam fasyasından kaudal olarak geçen beyaz iplikler olarak görünür.
Daha sonra, ultra ince forsepsler kullanarak, siniri yalnızca T3 ila T12 anatomik bölgelerinde bulunan hayvanın sol tarafından, segmentlerinin gövde duvarında büküldüğü yerden deriye giriş bölgelerine kadar kopararak çıkarın. Forsepsleri dikey olarak yönlendirin ve sinirleri bükülme bölgelerinin yaklaşık yarım santimetre altında kavrayın. Bir kez tutulduktan sonra, sinirlerin gerilmesine ve onları çıkarmak için çevredeki dokudan ayrılmasına neden olmak için yukarı doğru çekin.
Bitişik kan damarlarına zarar vermekten kaçının. Periyodik olarak% 0.9 hala tuzlu su çözeltisi damlaları uygulayarak dokuyu nemli tuttuğunuzdan emin olun. Gövde duvarından cilde uzanan tüm sinirleri çıkarmaya devam edin, ancak gövde duvarının yoğun fasyası içindeki sinirleri bozmayın.
Ardından, açıkta kalan cilt flebindeki tüm sinirleri çıkarın. Bu lifler, dorsal kutanöz sinirin distal dallarını içerir ve cilt flebinin dermal tarafındaki bağ dokusu içinde sporadik olarak yerleştirilmiş beyaz dallanan iplikler olarak görünür. Bu ince dalları çıkarmak için forsepsleri dermal yüzeye kabaca paralel olarak konumlandırın, siniri kavrayın ve yukarı doğru koparın.
Bu şekilde görünen tüm sinirleri çıkarın. Kan damarlarını ve cildi delmeyin. Bu adım sırasında, komşu kan damarlarının yırtılmasını önlemek önemlidir.
Bitişik bir kan damarı olan bir sinir bulursanız, sonunda bitişik damarın olmadığı bir alana kadar takip edin ve kopararak çıkarın. Şimdi, dorsal orta hat kesisinin sağ tarafındaki cildi gevşetin, ancak herhangi bir siniri çıkarmayın. Bu, kontralateral sahte operasyonel kontrol olarak hizmet edecektir.
Son olarak, hayvanı dikin ve daha önce olduğu gibi ameliyat sonrası izleyin. Daha sonra, stabil sinir kaybını doğrulamak için, ameliyattan haftalar sonra, steril bir hipodermik iğne kullanarak denerve edilmiş alanı nazikçe delin. Hayvanın tipik olarak titreyerek veya başını çevirerek yanıt verip vermediğine dikkat edin.
Deri bölgesi stabil bir şekilde denerve edilmişse, hayvan çok az tepki gösterecek veya hiç tepki göstermeyecektir. Eşleşen deney ve kontrol örnekleri için yanıt verilmeyen alandan ve kontralateral sahte taraftan deri biyopsileri alın. Biyopsilerden, sahte ve denerve edilmiş örnekler arasındaki dokunma kubbesi bolluğu veya morfolojisindeki potansiyel farklılıkları belirlemek için birden fazla histolojik kesitten numune almak önemlidir.
Glebe one cree ERT2 fare suşu, tamoksifenin neden olduğu genetik rekombinasyonun, dokunmatik kubbe epiteli gibi yüksek kirpi yolu aktivitesi gösteren cilt bölgelerine hedeflenmesine izin verir. Bu fareler, dokunma kubbesi epitelini görselleştirmek için abolaxi muhabir farelerini indüklemek için çaprazlandı. Düğümler, hem normal dokunmatik kubbeleri hem de bunlarla ilişkili Merkel hücrelerini korumak için çok önemlidir.
Bu, deneysel olarak, normal dokunma kubbesi morfolojisinin kademeli kaybının yanı sıra, denervasyonu takiben keratin sekiz biriken hücre kaybı ile gösterilmiştir. Sinirler ayrıca, Glebe one cree ERE2 ekspresyonları tarafından izlendiği gibi dokunmatik kubbede kirpi sinyalizasyonunu ve hem sahte hem de denerve edilmiş deriden eve monte beta kolektif taraflı lekelenmeyi teşvik etmek için çok önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bu sinirlerin normal cilt fonksiyonunda yer alıp almadığını veya hastalığı modüle edip etmediğini test etmek için dorsal kutanöz sinirlerin cerrahi olarak nasıl kesileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, hayvana minimum stres uygulayarak rutin ve güvenilir bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü takiben, sinirlerin deriden tamamen kesilip kesilmediğini ve gen ekspresyonunun etkilenip etkilenmediğini doğrulamak için amino floresan boyama gibi yöntemler kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, fare derisi için genetik etiketleme, cerrahi denervasyon ve deri biyopsisi protokollerini, etiketli epiteli tüm-montaj β-galaktozidaz boyaması ile görselleştirme yöntemleriyle birlikte sunmaktadır. Bu teknikler, normal ve patolojik deri durumlarında sinirlerin rolünü araştırmak için esastır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Dermatoloji
- Patoloji
Arka Plan
- Sinirlerin deri biyolojisi üzerindeki etkisini anlamak çok önemlidir.
- Deri sinirleri, deri homeostazı ve hastalıklarında rol oynayabilir.
- Tam ve denerve derinin karşılaştırmalı analizi, bilgiler sağlayabilir.
- Sinirlerin tanınmasının zorluğu nedeniyle görsel teknikler gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Normal deri biyolojisinde sinirlerin rolünü incelemek.
- Sinirlerin patolojik deri durumlarına etkisini değerlendirmek.
- Sinir tanımlama ve çıkarma için güvenilir yöntemler geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Fare derisinin genetik etiketlenmesi.
- Cerrahi denervasyon teknikleri.
- Deri biyopsisi prosedürleri.
- Görselleştirme için tüm-montaj β-galaktozidaz boyaması.
Ana Sonuçlar
- Deri örneklerinde sinir tanımlama yöntemleri gösterildi.
- Denerve ve tam deri karşılaştırması için protokoller sağlandı.
- Deri sağlığında sinir varlığının önemi vurgulandı.
- Sinir-deri etkileşimleri üzerinde daha fazla araştırma kolaylaştırıldı.
Sonuçlar
- Sinirler deri biyolojisi ve patolojisini önemli ölçüde etkiler.
- Geliştirilen teknikler, sinir fonksiyonlarının anlaşılmasına yardımcı olabilir.
- Gelecek çalışmalar bu yöntemler üzerinde daha derin bilgiler için inşa edebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables direct comparison of innervated and denervated skin from the same animal, providing a controlled approach to assess nerve-dependent mechanisms in skin homeostasis and disease. By isolating the variable of nerve presence, it supports mechanistic de-risking in target validation for dermatological pathways. The technique is applicable to mouse models of skin pathology, offering translational relevance for preclinical evaluation of neurocutaneous interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding nerve-skin signaling in cutaneous mechanosensory organs like touch domes.
- Operational Value: Enables functional validation of neuronal targets by comparing denervated and sham controls within identical genetic backgrounds.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying whether neuronal targets drive pathology or homeostasis in skin disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized biological systems with quantifiable outputs such as touch dome morphology and gene expression for compound screening.
- Reproducibility: Generates matched experimental and control samples from the same animal, reducing inter-subject variability in assay results.
- Scalability: Allows repeated sampling over time to monitor disease progression, supporting longitudinal assay design.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Adaptable to mouse models of skin pathology including atopic dermatitis, psoriasis, and cancer to test nerve dependence.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by maintaining consistent nerve manipulation across study phases.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by determining whether observed phenotypes require intact innervation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for neuroimmune or neuroepithelial pathways in skin.
- Discovery Biology: Tests whether cutaneous nerves are required for touch dome maintenance or gene expression, supporting pathway de-risking.
- Screening: Produces denervated and intact skin samples suitable for standardized whole-mount staining and imaging-based readouts.
- Analytics: Enables quantitative comparison of structural and molecular endpoints between conditions to assess biological significance.
- Translational Research: Applies nerve ablation to disease models to evaluate continuity of nerve-dependent mechanisms from discovery to preclinical stages.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nerve manipulation platform applicable across multiple skin disease models and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating nerve contribution to skin phenotypes.
- Operational Value: Standardizes nerve removal and control procedures, improving reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target engagement in a pathophysiologically relevant context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurocutaneous targets based on functional requirement in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques and nerve identification under dissection microscopy.
- Dependent on sterile surgical infrastructure and postoperative animal care protocols.
- Necessitates standardization of denervation extent and validation methods (e.g., sensory testing) across users.
- Must account for variability in nerve regeneration or compensatory innervation when interpreting longitudinal data.
- Limited to accessible dorsal skin regions; adaptation to other sites may require modified surgical approaches.
