Jel destekli rehidrasyon kullanma Dev boyutlu Polymersomes Şekillendirme

Bu jel destekli rehidrasyon yönteminin genel amacı, vezikül boyutu dağılımının kolayca kontrol edilebildiği sağlam unilamellar dev polimer vezikülleri sağlam bir şekilde oluşturmaktır. Bu yöntem, zarın fiziksel özelliklerini araştırmak ve daha sonra bu vezikülleri biyomühendislik uygulamalarına entegre etmek için kullanılabilecek polimer veziküllerin oluşumu için sağlam bir alternatif sunar. Bu tekniğin temel avantajı, yüzlerce sağlam dev polimer keseciği geleneksel tekniklere göre çok daha hızlı ve daha az emek yoğun bir şekilde kolayca üretebilme yeteneğidir.

Bu yüzden, bunun fikri, dev lipid vezikülleri oluşturmak için jel destekli rehidrasyon tekniğini öğrendiğimizde ortaya çıktı. Bununla birlikte, dev polimeromlar oluşturmak için mevcut yöntemlerimiz zorlu ve genellikle düşük verimlidir, bu nedenle bu metodolojiyi alternatif bir yaklaşım olarak kullanmaya karar verdik. Polimer çözeltisi hazırlamaya, beş miligram PEO-PBD diblok kopolimerini bir mililitre kloroform içinde bir cam şişede tamamen eriyene kadar döndürerek başlayın.

Nihai yüzde 99.5 mol polimer ve yüzde 0.5 lipid konsantrasyonu elde edilene kadar yeni bir şişeye mililitre polimer ve kloroform çözeltisi başına beş miligram ve mililitre floresan etiketli lipit ve kloroform çözeltisi ekleyin. Buharlaşmayı en aza indirmek için, polimer çözeltisini kloroforma dayanıklı bir kapağı olan hava geçirmez bir şişeye aktarın ve daha sonra kullanmak üzere 20 santigrat derecede saklayın. Agaroz film hazırlamaya başlamak için, 250 mililitrelik bir Erlenmeyer şişesine 50 mililitre su ve 0.5 gram standart agaroz ekleyin.

Mikrodalga kullanarak bir dakika kaynatın. Devam etmeden önce, zayıf yapışmayı veya topaklanmayı önlemek için agaroz çözeltisini 65 ila 75 santigrat derece arasında soğutun. Daha sonra, 1000 mikrolitrelik bir pipet ucunun ucunu kesin ve 300 mikrolitre agaroz solüsyonunu 25 mililitrelik kare cam kapak fişine pipetlemek için kullanın.

Eldiven giyerken, kapak kaymasının kenarını tutun ve 1000 mikrolitrelik başka bir pipet ucunun uzun kenarını kullanarak agarozu tüm yüzeye eşit şekilde yayın. Kapak kaymalı agaroz tarafı yukarı bakacak şekilde parafilm üzerine yerleştirin ve en az bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Önceden hazırlanmış polimer çözeltisinden 30 mikrolitreyi agaroz film kaplı lamel üzerine pipetleyerek devam edin.

Kapak kayma kenarını eldivenli parmaklarınızla tutun ve polimer çözeltisini 18 gauge iğnenin uzun kenarını kullanarak dairesel hareketlerle agaroz filmin üzerine yayın. Kapak kayması polimerini yukarı bakacak şekilde bir vakumlu dessikatörün içindeki plastik bir petri kabına yerleştirerek bitirin. Kalan çözücüyü çıkarmak için desikatörü en az bir saat boşaltın.

Polimeromlar oluşturmak için, önce sıkı bir conta oluşana kadar hafifçe bastırarak kaplanmış örtü kızağının polimer tarafına bir örtüyü iyice yapıştırın. Ardından, hazneye 200 ila 500 mikrolitre rehidrasyon solüsyonu ekleyin. Ardından, bir nem odası oluşturmak için bir cam petri kabının iç kenarı boyunca ıslak bir rulo laboratuvar mendili yerleştirin.

Kapak yapışmış şekilde kapak kağıdını tabağa iyice yerleştirin ve bir kapakla kapatın. Foto ağartmayı en aza indirmek için petri kabını folyo ile örtün ve ardından polimerom oluşumunu tamamlamak için en az 30 dakika boyunca 40 santigrat derecede sıcak bir plakaya koyun. FRAP görüntüleme işlemine başlamak için, kapak iyice yapıştırılmış kapak ile kapak kızını, ayarlanabilir bir kondansatör ile donatılmış ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu üzerine yerleştirin.

Ardından, kullanılan floresan lipide dayalı bir filtre seti seçin ve 100X yağ objektifi kullanarak kapak fişinin üst yüzeyindeki polimeromları görüntüleyin. FRAP kullanarak membran akışkanlığını karakterize etmek için önce bir polimerozoma odaklanın, ardından mikroskop kondansatörünü küçük bir açıklığa kapatın ve polimeromun kenarlarının görüntü alanı içinde kaldığından emin olun. Ardından, kamera pozlamasını artırın, tüm nötr yoğunluk filtrelerini çıkarın ve ilgilenilen bölgenin 30 ila 60 saniye boyunca fotoğraf ağartmasına izin verin.

Son olarak, lambayı kapatın ve kondansatörü tamamen açın. Başlangıç ayarlarına pozlamayı azaltın ve üç dakika boyunca her 30 saniyede bir görüntü yakalayın. Mikroskobun bilgisayarında görüntü analiz yazılımını açın ve polimeromların elde edilen görüntülerini yükleyin.

Analiz Et açılır menüsünü açıp Ölçeği Ayarla seçeneğini belirleyerek ölçümün ölçeğini ayarlayın. Piksel cinsinden mesafe, bilinen mesafe ve uzunluk birimi için uygun kalibrasyon birimlerini girin ve ardından Tamam'ı seçin. Ardından, çizgi araç kutusunu kullanın ve seçilen bir polimerozomun çapını kapsayan bir çizgi çizin.

Analiz açılır menüsünü açıp Ölç'ü seçerek polimeromun çapını ölçün. Analize yardımcı olmak için, bir sonraki polimerozoma geçmeden önce ölçüm çizgisini görüntüye yazdırmak için control plus D'yi kullanın. Yukarıdaki prosedürü kullanarak polimerleri ölçmeye ve tamamlanana kadar her ölçümü veri penceresine eklemeye devam edin.

Son olarak, Dosya ve Farklı Kaydet'e tıklayarak verileri kaydedin.Açılan pencerede Kaydet'e tıklayın ve ardından verileri analiz etmek için sonuç dosyasını bir elektronik tablo olarak açın. Çeşitli tamponlarla rehidre edilmiş PEO-PBD polimer filmlerden oluşan polimerler, floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Görüntüler, polimerlerin, tipik olarak 10 mikrometrenin altındaki çapa sahip farklı rehidrasyon koşulları altında homojen olmadığını göstermektedir.

Farklı sıcaklıklarda suda oluşan polimeromların epifloresan görüntüleri, rehidrasyon sıcaklığı arttıkça daha büyük polimeromların oluştuğunu göstermektedir. Farklı rehidrasyon sıcaklıklarında suda oluşan 100'den fazla polimerom için ortalama çaplar hesaplandı. 24 santigrat derecede, ortalama çap 2.93 mikrometre idi ve 70 santigrat derecede 14.04 mikrometreye kadar yükseldi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik doğru yapılırsa yaklaşık bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, polimerzomları her zaman çözelti içinde tutmak önemlidir. Rehidrasyon solüsyonunun sızmasını ve polimeromların kurumasını önlemek için kapak kuyusunun kapak kızağına güvenli bir şekilde takıldığından emin olun.

Bu prosedürü takiben, polimeromların ek yapısal özelliklerini anlamak için elektron mikroskobu gibi yöntemler kullanılabilir. Bu teknik, sentetik biyoloji ve biyomühendislik araştırmalarının, araştırma ve abiyotik-biyotik arayüz, ilaç dağıtım araştırmaları ve proto-hücre sistemleri için lipid zarlarına sağlam, kimyasal olarak uyarlanabilir bir alternatif olarak polimerozları keşfetmesinin yolunu açar. Bu videoyu izledikten sonra, jel destekli rehidrasyon kullanarak dev polimeromların nasıl sağlam bir şekilde oluşturulacağını, veziküllerin toplam boyutunu nasıl ayarlayacağınızı ve zar bütünlüklerini nasıl karakterize edeceğinizi iyi anlamalısınız.

Kloroform veya agaroz ve iğnelerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu işlemleri gerçekleştirirken çok dikkatli olun. Çeker ocakta çalışmak gibi önlemler alın ve her zaman gözlük ve eldiven kullanın.