Diseksiyon ve Threespine Stickleback Brankial İskelet Düz montaj

Bu prosedürün genel amacı, Stickleback solungaç iskeletinin diseksiyonunu yapmak ve düzleme ile monte etmektir. Bu yöntem; hayvanların yeni ortamlara nasıl adapte oldukları ve yetişkin morfolojisindeki varyasyonların gelişim sürecinde nasıl ortaya çıktığı gibi gelişim, genetik ve evrim alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, brankiyal iskeletin diseke edilip düz monte edilmesi sayesinde, bütünle montajla çalışılamayan çeşitli trofik özelliklerin görselleştirilebilmesidir. Hazırlık aşamasında, üç dikenli kitlenin ilgili baş iskelet morfolojisini gözden geçirin. Balığı diseksiyona hazırladıktan sonra, gözü örten membranı delmek için 5 numaralı keskin penseti gözün yan tarafına 45 derecelik bir açıyla yerleştirerek başlayın.

Ardından, bir yoğurt kabının kapağı gibi göz membranını soyun. Sonra, açık pensi gözün arkasına yerleştirin, optik siniri kavrayın ve gözü çıkarın. Gözü delmemeye dikkat edin, aksi takdirde melanin sızacaktır.

Bu işlemi karşı taraftaki göz için tekrarlayın. Ardından, küçük bir makasın ucunu operkül flebinin arka tarafının altına yerleştirin ve operkülün üzerindeki yumuşak dokuyu, göz çukuruna doğru dorsal yönde kesin. Daha sonra, göz çukurunun dorsalinde bulunan frontal kemiği kesin.

Ardından, göz çukurunun merkezinin etrafından, parasfenoid kemiğin orta hattı boyunca kesin. Operkül kesimini karşı tarafta tekrarlayın. Sonraki adımlar için pelvik dikenler tutamak olarak kullanılabilir.

Vücuttan doğrudan ve nazikçe çekilerek dışarı doğru açılırlar. Şimdi, penseti operkülün altına yerleştirin ve yüzü yavaşça vücuttan ayırarak soyun. Bu işlem sırasında hala yapışık olan tüm yumuşak dokuları budayın.

Solungaç tırmıklarının çevresinde dikkatli olun ve onları bozmamaya özen gösterin. Yüz iskeleti çıkarılırken, percoll ile birlikte ilk ceratobranchial kemiğini yanlışlıkla tutmak kolaydır. Percolli öne doğru soyarken, fazladan bir şeye tutunmadığınızdan emin olmak için altına bakın.

Şimdi, penset kullanarak, anterior kranial fasiyal iskeleti soyup çıkarırken ceratohyals'leri orta hattaki basihyal'in her iki yanından ayırın. İşlemi karşı tarafta tekrarlayın. Anterior kranial fasiyal iskelet; tüm çeneyi, tüm hyoid iskeleti, alttaki dorsal ve endokondral elementleri ve kafatasının anterior kısmını içerir.

Ardından, kapalı pensleri bağırsak tüpünün hemen altına yerleştirin ve onları anteriora doğru çekin. Bu işlem sırasında brankiyal iskelete bağlı kalan kasları ve ligamentleri birbirinden ayırın. Daha sonra, kapalı penslerin ucunu kullanarak dorsal brankiyal iskeleti ventral beyin kasasına bağlayan kasları kazıyarak temizleyin.

Posteriyordan anteriyora doğru bir hareketle sıyırın. Kas çıkarma işlemini stickleback'in karşı tarafında tekrarlayın. Ardından, bağırsak tüpünün tabanını kavrayıp anteriyora doğru çekerek brankiyal iskeleti çıkarın.

Bağırsak tüpünü, beşinci ceratobranchial'in posteriorundan dik bir kesi yaparak ayırın. Sık yapılan bir hata, bağırsak tüpünü çok anterior kısımdan tutmaktır; bu durum ventral frontal tüpün çok geride kalmasına neden olur. Torasik kavitenin posterior derinliğinden tuttuğunuzdan emin olun; fazla olan bağırsak tüpünü her zaman daha sonra temizleyebilirsiniz.

Brankiyal iskeletin dorsal tarafındaki beyin kasasında kalan tüm kemik fragmanları temizlendikten sonra, makası brankiyal sepete yerleştirin ve bilateral dorsal diş plakları setleri arasından dorsal bir kesi yapın. Dorsal diş plaklarına zarar vermemek için bu kesinin merkezde kalmasını sağlayın.

Ardından, brankiyal iskeletin posterior ucundaki lastiksi bağırsak lümenine iki sığ lateral kesi yapın. Bağırsak tüpünün anterior ucuna, brankiyal iskeletin açılmasına yardımcı olmak için.

Şimdi, nazik bir şeffaflaştırma işlemi için iskeleti %50 gliserol ve %0,25 potasyum hidroksit içeren bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Alternatif olarak, daha fazla şeffaflaştırmaya gerek yoksa doğrudan saf gliserole aktarın. Yeniden boyama gerekirse, ayrıntılar metin protokolünde verilmiştir.

Montaj hazırlığı için solüsyonu saf gliserol ile değiştirin ve tüpü en az beş dakika boyunca çalkalayın. Ardından, brankiyal iskeleti çıkarın ve dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde 22 x 60 milimetrelik bir cam lamelin altına yakın bir yere yerleştirin. Şimdi, iskeletin üzerine birkaç damla gliserol aktarın.

Ardından, modelleme kilinden iki küçük top yapın ve bunları kapatma camının her iki ucuna yerleştirin; bunlar ara parça görevi görecektir. Daha sonra, anterior brankiyal iskeleti düzleştirmeye yetecek kadar basınç uygulayarak, hazırlığın üzerine ikinci bir kapatma camını gevşekçe yerleştirin. Şimdi, dorsal diş plakaları da dahil olmak üzere sol dorsal flebi soyarak açın ve flebi kapatma camlarının arasına kaydırın.

Ardından aynı işlemi sağ dorsal flap ile gerçekleştirin. Ve tüm brankiyal iskeleti lamın kenarından uzaklaştırın. Prosedürü tamamlamak için, kil toplarını düzleştirmek amacıyla üst lamba üzerine hafifçe bastırın.

Sadece brankiyal iskeletin düz bir şekilde sabit kalacağı kadar basınç uygulayın. Ancak, iskeletin ezilmesine yol açacak kadar fazla baskı yapmayın. İşlem sırasında bir sıra tırmık dişinin görünürlüğü kaybolursa, lamların arasına bir pens yerleştirerek seratobrankiyalı veya hazırlığın tamamını yeniden yönlendirin.

Saf gliserol ile düz monte edildiğinde, preparat oda sıcaklığında düz bir şekilde en az on yıl boyunca saklanabilir. Bu protokol, disseke edilmiş ve düz monte edilmiş bir brankiyal iskelet ile sonuçlanır. Burada, çeşitli önemli trofik özellikler kronikleştirilebilir.

Dorsal görünümden, tüm solungaç tırmıkları sıraları, tüm faringeal diş plakaları ve neredeyse tüm brankiyal kemikler kolayca görselleştirilebilir ve kronifiye edilebilir. Alizarin red S, aynı zamanda rhodamine veya benzeri bir kırmızı filtrede floresans verir; bu da diğer işaretleyicilerle çift etiketlemeye ve görselleştirme için alternatif yöntemlere olanak tanır. Bu görüntüde solungaç tırmıkları şevronlarla işaretlenmiştir.

Dişler ok başlarıyla, kemikler ise yıldızlarla işaretlenmiştir. Uzmanlaşıldığında, diseksiyon birkaç dakika içinde tamamlanabilir ve yüzlerce hayvana nispeten hızlı bir şekilde uygulanabilir. Bu videoda bir üç gözlü kılıç balığı (stickleback) brankial iskelet diseksiyonu göstermiş olsak da, bu prosedürün çeşitli balık türleri için bir kılavuz olarak kullanılabileceğini umuyoruz.

Branchial iskeletin diseksiyonu ile, bütün montajlarda görünmeyen bir dizi önemli trofik özelliği hızlı ve kolay bir şekilde görselleştirebiliriz. Bu durum, kraniofasiyal iskeletin gelişiminin ve evriminin daha iyi anlaşılmasını sağlar.