Diseksiyon ve Threespine Stickleback Brankial İskelet Düz montaj
May 7th, 2016
Solungaç tırmıkları, faringeal dişler ve branş kemikleri dahil olmak üzere branş iskeleti, çoğu balıkta birincil gıda işleme bölgesi olarak hizmet eder. Burada, bu iç iskeleti üç omurgalı dikme sırtlarında incelemek ve düz bir şekilde monte etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu yöntem aynı zamanda çeşitli diğer balık türleri için de geçerlidir.
Bu prosedürün genel amacı, Stickleback Branş İskeletini incelemek ve düz bir şekilde monte etmektir. Bu yöntem, gelişim, genetik ve evrim alanlarındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Hayvanların yeni ortamlara nasıl adapte olduğu ve gelişim sırasında yetişkin morfolojisindeki varyasyonun nasıl ortaya çıktığı gibi.
Bu tekniğin ana avantajı, dalsal iskeleti parçalara ayırarak ve düz bir şekilde monte ederek, tam montajda incelenemeyen çeşitli trofik özellikleri görselleştirebilmesidir. Hazırlık aşamasında, üç omurga dikmesinin ilgili kafa iskeleti morfolojisini gözden geçirin. Balığı diseksiyon için hazırladıktan sonra, gözü kaplayan zarı delmek için gözün yan tarafına 45 derecelik bir açıyla keskin beş numaralı forseps sokarak başlayın.
Ardından, bir yoğurt kabının kapağı gibi göz zarını soyun. Ardından, gözün arkasına açık forseps yerleştirin, optik siniri tutun ve gözü çıkarın. Gözü delmemek için dikkatli olun, aksi takdirde melanin sızdırır.
Bu işlemi karşı taraftaki göz ile tekrarlayın. Daha sonra, küçük bir makasın bıçağını operkül flebinin arka tarafının altına yerleştirin ve yumuşak dokuyu operkülün üzerindeki dorsal olarak göz yuvasına doğru kesin. Daha sonra göz yuvasına dorsal olan ön kemiği kesin.
Ardından, göz yuvasının merkezinin etrafındaki orta hat parasfenoid kemiğini kesin. Karşı taraftaki operkül kesimini tekrarlayın. Sonraki adımlar için, pelvik dikenler tutamak olarak kullanılabilir.
Nazikçe doğrudan vücuttan çekerek katlanırlar. Şimdi, forsepsleri ameliyatın altına yerleştirin ve yüzü yavaşça vücuttan soyun. İşlem sırasında hala bağlı olan yumuşak dokuları kesmek.
Solungaç tırmıklarının etrafında dikkatli olun ve onları bozmamaya dikkat edin. Yüz iskeletini çıkarırken percoll ile birlikte yanlışlıkla ilk ceratobranchial kemiği almak kolaydır. Fazladan bir şey tutmadığınızdan emin olmak için öne doğru soyarken percoll'larının altına bakın.
Şimdi, forsepslerle, ön kraniyal yüz iskeletini soyup çıkarırken, orta hat basihyalinin her iki tarafından ceratohyalleri ayırın. Karşı tarafta tekrarlayın. Anterior kraniyal yüz iskeleti, tüm çeneyi, tüm hyoid iskeleti, altta yatan dorsal ve endokondriyal elemanları ve kafatasının ön kısmını içerir.
Ardından, kapalı forsepsleri bağırsak tüpünün hemen altına yerleştirin ve öne doğru sürükleyin. İşlem sırasında branş iskeletine bağlı kalan kasları ve bağları ayırmak. Ardından, dorsal branş iskeletini ventral beyin kılıfına bağlayan kasları kazımak için kapalı forsepsin ucunu kullanın.
Arkadan öne doğru hareketle kazıyın. Stickleback'in karşı tarafında kas çıkarma işlemini tekrarlayın. Daha sonra, bağırsak tüpünün tabanını kavrayarak ve öne doğru çekerek dalsal iskeleti çıkarın.
Bağırsak tüpünü, beşinci ceratobranchial'ın arkasında dikey bir kesim kullanarak ayırın. Yaygın bir hata, bağırsak tüpünü çok önde tutmaktır, bu da ventral frontal tüpü çok geride bırakır. Göğüs boşluğunun arka kısmını derinlemesine kavradığınızdan emin olun ve fazla bağırsak tüpünü daha sonra her zaman çıkarabilirsiniz.
Beyinden kalan kemik parçalarını çıkardıktan sonra, branş iskeletinin dorsal tarafındaki kasa. Makası branş sepetine yerleştirin ve iki taraflı dorsal diş plakaları setleri arasında bir sırt kesimi yapın. Sırt diş plakalarına zarar vermemek için bu kesiği ortada tutun.
Daha sonra, dalsal iskeletin arka ucundaki lastiksi bağırsak lümeninde iki sığ yanal kesim yapın. Bağırsak tüpünün antieror ucunda. Branş iskeletinin açılmasına yardımcı olmak için.
Şimdi, iskeleti nazik temizleme için yüzde 50 gliserol, sıfır nokta iki yüzde beş potasyum hidroksit yüklü bir mikrosentrifüj tüpüne aktarın. Veya bunun yerine, daha fazla temizleme gerekmiyorsa saf gliserole aktarın. Yeniden boyama gerekiyorsa, ayrıntılar metin protokolünde verilmiştir.
Montaja hazırlanmak için, çözeltiyi saf gliserol olarak değiştirin ve tüpü en az beş dakika çalkalayın. Ardından, dallı iskeleti çıkarın ve sırt tarafı yukarı bakacak şekilde 22 x 60 milimetrelik bir cam kapak kaymasının altına yakın bir yere yerleştirin. Şimdi, iskeletin üzerine birkaç damla gliserol aktarın.
Ardından, iki küçük modelleme kil topunu açın ve kapak fişinin her iki ucunda birer tane oynayın, bunlar ara parça görevi görür. Ardından, ön branş iskeletini düzleştirmek için yeterli basınçla preparatın üzerine gevşek bir şekilde ikinci bir örtü kayması. Şimdi, dorsal diş plakaları da dahil olmak üzere sol sırt flebini soyun ve kanadı kapak kızakları arasında kaydırın.
Sonra aynısını sağ sırt flebi için de yapın. Ve tüm dallı iskeleti kapak kaymasının kenarından uzağa doğru itin. Prosedürü tamamlamak için, kil toplarını düzleştirmek için üst kapak kızağına hafifçe bastırın.
Dal iskeletini düz bir şekilde monte etmeleri için yeterli. Ancak, ezilecek kadar değil. İşlem sırasında bir sıra tırmıklayıcı gizlenirse, lameller arasında forsepsleri kaydırın ve ceratobranchial'i veya tüm preparatı yeniden yönlendirin.
Saf gliserol içine düz bir şekilde monte edildiğinde, preparat oda sıcaklığında en az on yıl boyunca düz olarak saklanabilir. Bu protokol, disseke edilmiş ve düz monte edilmiş bir dalsal iskelet ile sonuçlanır. Çeşitli önemli trofik özelliklerin kronize edilebildiği yerler.
Sırt görünümünden, tüm solungaç tırmıkları sıraları, tüm faringeal diş plakaları ve neredeyse tüm branş kemikleri kolayca görselleştirilebilir ve kronize edilebilir. Alizarin kırmızı S, ayrıca bir rodamin veya benzeri bir kırmızı filtre üzerinde florür ve diğer işaretleyicilerle çift etiketlemeye ve görselleştirme için alternatif yöntemlere izin verir. Bu resimde solungaç tırmıkları karatlarla işaretlenmiştir.
Dişler ok başları ile işaretlenmiştir ve kemikler yıldızlarla işaretlenmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, diseksiyon birkaç dakika içinde yapılabilir ve yüzlerce hayvan üzerinde nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Ve bir stickleback dalsal iskelet diseksiyonu göstermiş olsak da, bu prosedürün çeşitli balık türleri için bir rehber olarak kullanılabileceğini umuyoruz.
Dalsal iskeleti inceleyerek, tüm bağlarda görülemeyen çeşitli önemli trofik özellikleri hızlı ve kolay bir şekilde görselleştirebiliriz. Kraniyal yüz iskeletinin gelişiminin ve evriminin daha iyi anlaşılmasını sağlar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, üç dikenli kuğubalıklarının branşiyal iskeletinin incelenmesi ve düzlemsel montajı için bir protokol sunar; bu, balıklarda yiyecek işlemenin önemli bir yönüdür. Yöntem çeşitli balık türleri için uygulanabilir ve gelişimsel ve evrimsel biyolojiyi anlamaya yardımcı olur.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Evrimsel Biyoloji
Arka Plan
- Branşiyal iskelet, solungaç dikenleri, farenks dişleri ve branşiyal kemikleri içerir.
- Çoğu balıkta yiyecek işlemenin ana yeri olarak hizmet eder.
- Bu yapıyı anlamak, hayvan adaptasyonu ve morfolojik varyasyon hakkında bilgiler sağlayabilir.
- Diseksiyondan önce kafa iskelet morfolojisini gözden geçirmek şarttır.
Çalışmanın Amacı
- Kuğubalıklarının branşiyal iskeletini incelemek ve düzlemsel montaj yapmak.
- Tam montaj hazırlıklarında gözlemlenemeyen trofik özellikleri görselleştirmek.
- Gelişim, genetik ve evrimdeki temel soruları araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Balıkların diseksiyon için hazırlanması.
- Gözü kaplayan zarı delmek için keskin forsepslerin yerleştirilmesi.
- Branşiyal iskeletin diseksiyonu.
- İncelenen iskeletin düzlemsel montajı.
Ana Sonuçlar
- Teknik, branşiyal iskeletin detaylı görselleştirilmesini sağlar.
- Balıklarda trofik özelliklerin incelenmesini kolaylaştırır.
- Çeşitli balık türlerine uygulanabilir bir yöntem sağlar.
- Gelişimsel ve evrimsel süreçlerin anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sonuçlar
- Diseksiyon ve düzlemsel montaj yöntemi, branşiyal iskeletin incelenmesi için etkilidir.
- Bu yaklaşım, önemli biyolojik sorulara cevap vermeye yardımcı olabilir.
- Balık morfolojisi ve adaptasyonunun daha geniş anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise morphological analysis of the branchial skeleton, a key determinant of feeding efficiency and dietary adaptation in fish. By allowing quantification of trophic traits such as gill raker number and pharyngeal tooth density, it supports target validation in studies of evolutionary developmental biology. The method provides a scalable, reproducible system for linking genotype to phenotype in vertebrate craniofacial patterning.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic variants affecting craniofacial morphology through quantitative trait analysis.
- Operational Value: Provides a standardized, high-throughput compatible dissection workflow for phenotypic screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, two-dimensional preparations suitable for imaging-based assay readouts.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through consistent flat-mount morphology and glycerol-based clearing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing developmental changes in skeletal patterning relevant to human congenital disorders.
- Operational Value: Enables cross-species applicability, enhancing translational continuity in vertebrate model systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where phenotypic screening of genetic mutants or natural variants requires detailed anatomical readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking genomic variation to measurable skeletal phenotypes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative morphological outputs essential for assay development.
- Analytics: Enables measurement of trait distributions such as bone length and tooth number for statistical comparison.
- Translational Research: Connects fish craniofacial evolution to conserved developmental pathways in higher vertebrates.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for skeletal phenotyping across diverse fish species and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in genotype-phenotype maps by reducing observational ambiguity in complex 3D structures.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dissection and mounting steps applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing clear, quantifiable phenotypic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic loci based on effect size and penetrance of craniofacial traits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vertebrate anatomy and microsurgical dissection techniques.
- Dependent on fine forceps, micro-scissors, and glycerol-based clearing solutions.
- Necessitates standardized training to ensure consistent flat-mount quality and avoid tissue damage.
- Adaptation to larger or more heavily mineralized fish may require adjusted clearing times or enzymatic treatments.
- Practical limitations include potential obscuration of posterior elements if mounting pressure is uneven.
