Name: Myofilament Ca Değerlendirilmesi 2+ Duyarlılık temelinde Kardiyak Uyarma-kasılma Kaplin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Öğrenin, kardiyak miyositlerde miyofilament Ca2+ duyarlılığını değerlendirme yöntemini. Bu protokol, sağlıklı ve hastalıklı kalplerde uyarılma-kasılma kaplini anlamak için Fura-2 AM kullanarak sarcomere kısalması ve intraselüler Ca2+ ölçümlerini birleştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Eğitim, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (2013068067) tarafından finanse Kore Ulusal Araştırma Vakfı (ÇKS) ile Temel Bilimler Araştırma Programı tarafından desteklenen; Eğitim, Bilim ve Teknoloji, Seul Ulusal Üniversitesi Hastanesi, Hipertansiyon Kore Derneği&#39;nin (2013), SK Telecom Araştırma Fonu Kore Bakanlığı Beyin Kore 21 Yüksek Lisans Programı tarafından (no. 3420130290) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC 31460265; NSFC 81260035).

protokol Sağlık BM Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu uygundur (NIH Yayın No. 85-23, 1996 revize). Bu Seul Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (IACUC onayı No .: SNU-101213-1) tarafından onaylanmıştır. 1. Tampon Hazırlama (Tablo Malzemeleri ve Ekipmanları) <ol><li> MM (deney gününde taze yalıtım çözeltisi 300 ml hazırlayın: NaCl, 135; KCI, 5.4; MgCl2, 3.5; glukoz, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0.4, taurin, 20; pH 7.4 NaOH ile birlikte). </li><li> MM (deney gününde taze bir depolama solüsyonu 100 ml hazırlayın: NaCI 120; KCI 5,4; MgSO 4 5&#39;tir; CaCl2 0.2; sodyum piruvat 5&#39;tir; 5.5 glikoz, taurin 20, HEPES 10, manitol 29, pH 7.4 ) NaOH ile. </li><li> MM perfüzyon çözeltisi 1L (hazırlayın: NaCl, 141.4; KCI, 4; NaH 2 PO 4, 0.33; MGCL2, 1 &#39;dir; HEPES, 10; glukoz, 5.5; CaCl2, 1.8; manitol, 14.5; NaOH ile pH 7.4). </li><li> Izolasyon 25 ml kollajenaz (1 mg / ml), proteaz (0.1 mg / ml), sığır serum albümini (BSA, 1.67mg / ml) ve Ca 2 + (0.05 mM) ilave edilerek kolajenaz çözeltisi 30 ml 1 Hazırlama çözüm. </li><li> Yalıtım çözeltisi 16.7 ml (1 mg / ml), BSA (1.67 mg / ml) ve Ca + 2 (0.05 mM) kolajenaz ekleyerek kolajenaz çözeltisi 2 20 ml hazırlayın. </li><li> yalıtım çözeltisi 40 ml BSA 0.4 g eklenerek BSA çözeltisi 40 ml hazırlayın. 10 ml ve iki bardak içine 30 ml ayrı. : Ca BSA çözeltisi 2 + 30 ml ilave edilir, böylece BSA çözeltisi nihai Ca2 + konsantrasyon 1 mM&#39;dir. </li></ol> Sol Ventriküler (LV) miyositler İzolasyonunda 2. Hazırlık <ol><li> hazırlanması ve izolasyon odasına hayvan tesis temiz ulaşım kafeslerde 8-12 haftalık, erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanları aktarın. </li><li> H37 o C iki su banyoları yemek Not: Su için bir su banyosu kullanın - ceketli rezervuar ve Langendorff perfüzyon sistemi perfüzyon tüpleri. Tek miyositleri ayırmak amacıyla miyokard doku gövdelerine kışkırtmak diğer su banyosu kullanın. </li><li> Sırasıyla, 30 ml ve 20 ml hacim yapmak için 5 ml ve kolajenaz çözeltisi 1 ve 16.7 ml kolagenaz çözeltisi 2 25 ml (yaklaşık olmayan 2+) BSA çözeltisi 3.3 ml. </li><li> Langendorff perfüzyon sistemine sırasıyla (Şekil 1A) izolasyon çözeltisi (100 mi) ve sütun 1 (Col 1) ile sütun 2 kolajenaz çözeltisi 1 (30 mi) (Col 2) ekleyin. </li><li> Langendorff perfüzyon sistemine (Şekil 1A) oksijen birleştirme borusu yoluyla, Sütun 1 ve Col.2 yalıtım solüsyonu ve kolajenaz çözeltisi 1 oksijen. Benzer şekilde, oxygenate kollajenaz çözüm 2 ve üzeri% 100 O 2 ile sallayarak su banyosunda BSA çözeltisiOksijen bağlantı borusu. </li></ol> LV miyosit 3. İzolasyon <ol><li> Pentobarbital sodyum (30 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile SD sıçan anestezisi ve kıstırma ayak ve çekme yansıma eksikliği anestezi durumunu teyit. </li><li> Bir diseksiyon tepsisine sıçan taşıyın. yatar pozisyonda, bant ile vücudun kenarlarına dört ayağı sabitleyin. </li><li> kalbi zarar vermemeye sağlanması, göğüs açmak için cerrahi makas ile göğüs orta eksenel kesiler uygulayın. Bağlantı gemiler (örneğin, üst ve alt vena kava, pulmoner damarları ve aort) ve perikardiyal zarından 13 den kalbi incelemek için temiz makas başka bir çift kullanın. </li><li> Yeterli uzunlukta aort bir kısmını bırakın (5-8 mm), ince forseps ile aort kelepçe ve hızla 1 dakika (Şekil 1A) içinde Langendorff perfüzyon sistemi kanül monte edin. aorta üzerinde sıkıca dikiş ipliği 4/0 kravat. </li><li&gt; Sütun 1 vananın açma ve 10 dakika boyunca önceden ısıtılmış ve oksijenli izolasyon solüsyonu (perfüzyon oranı: 12-14 ml / dak) ile izole kalbi serpmek. , Col 1 vanayı kapatınız Sütun 2 valfi açmak ve 8 kollajenaz çözüm 1 ile kalbi serpmek - 10 dk. </li><li> Aorta keserek sindirilmiş kalbi ayırın ve taze izolasyon solüsyonu (Şekil 1Bi) içeren balona forseps ile aort tutarak aktarın. Daha küçük parçalara (~ 22 mm, Şekil 1Bii) içine (septum dahil) LV serbest duvar en kesmek için ince makas ve forseps kullanın. </li><li> Önceden ısıtılmış ve oksijenli taze kolajenaz çözeltisi 2 (Şekil 1Biii) ihtiva eden bir şişe içine parçaları aktarın. 10 dakika süre ile çalkalanır. miyosit içeren kollajenaz çözüm 2 oksijen teslim tutun. </li><li> (BSA çözeltisi içeren - 2+ bir emme ampul ile damlatıcıları kullanarak 10 ml santrifüj tüpüne süspansiyon ve Ca ekleyin - miyosit TaşıHacim olarak 1: 1). 2 dakika süreyle 30 g Santrifüj ve süpernatant atın. BSA çözeltisi 5 ml miyosit pelet yeniden askıya. Santrifüj süpernatantı atmak ve. </li><li> Miyosit pelet dağılması ve oda sıcaklığında (Şekil 1Biv-VI) önceden oksijenli bir depolama solüsyonu 10 ml miyositleri tutun. </li><li> şişede kalan LV dokusu ile - prosedürleri (3.9 3.7 adımlar) tekrarlayın. LV dokusunun çoğu miyositler iyi bir verim elde etmek için kaybolana kadar tekrar - (3.9 3.7 adımlar) prosedürleri tekrarlayarak tutun: Not. </li><li> Deneylerin sonuna kadar oda sıcaklığında 6-8 saat süreyle depolama çözümü myositler tutun. </li></ol> Hücre içi Ca 2 Geçici ve miyosit daralma 4. Eşzamanlı Ölçümleri <ol><li> asetoksimetilester Fura-2 AM (2 mcM) ile yük LV miyositler. Not: Karanlık bir tüp (Şekil 1Bvii) yüklenen miyositler tüm yükleme prosedürleri ve deney gerçekleştirin. <ol><li> centr10 saniye boyunca 2000 x g&#39;de miyosit süspansiyonu (1 mi) ifuge. Süpernatantı atın ve düşük Ca 2 + konsantrasyonu (250 uM, Masa Malzemeleri ve Ekipmanları) ile Tyrode çözeltisi 1 ml miyosit pelet yeniden askıya. </li><li> Yavaşça miyosit süspansiyon, dispers, Fura-2AM ve poloksamer 407 (2 ul) ekleyin ve oda sıcaklığında karışımın tutulması - 15 dakika boyunca (20 ila 24 ° C) (Şekil 1Bvii). </li><li> Santrifüj Karışım 5 saniye için, yüzer tabaka atılır ve 500 uM Ca2 + içeren perfüzyon çözeltisi 1 ml miyosit pelet dağılır. 10 dakika sonra, 5 saniye için karışım santrifüj ve supernatant atın. </li><li> Taze perfüzyon çözeltisi (500 uM Ca2 +, 1 mi) ilave edilir ve, Fura-2AM tutulması - kayıtları için bu çözeltiye yüklenen miyosit pelet. </li></ol></li><li> LV miyosit kasılması ve hücre içi Ca ölçümü 2 + <ol><li> kaydetmeden önce, bir geçiyor perfüzyon tüpü doldurmakbir Tyrode çözeltisi ile su gömleği 36 o C önceden ısıtılmış </li><li> 8 dakika - 5 için ters bir floresan mikroskop odasının yüklenen LV miyosit süspansiyon - Bir Fura 2 AM birkaç damla koyun. Yavaş yavaş Tyrode çözeltisi (2.2 mL / dakika) serpmek. </li><li> alan stimülasyonu (2 Hz) başlatmak için dijital stimülatörü ön panelinde bulunan &quot;start&quot; düğmesine basın. Not: çıkış gerilimini (10 V, 5 msn süre) bölmenin her iki yanında yer alan platin teller üzerinden bölme miyosit uygulanır. <ol><li> stabil olduğu sözleşme Seç miyositler kayıt (hiper veya hipo-daralma göstererek olmayanlar). </li></ol></li><li> video tabanlı sarkomer algılama sisteminin yatay pozisyonda seçim miyosit ayarlayın ve sarkomer optimum görüntü elde etmek için mikroskop odağı ayarlayın. net sarkomer açıkça ortalamanın kadar gözlenir hangi alanda mor dikdörtgen kutu yerleştirinsarkomer uzunlukları (kırmızı tepe) bir tekil sivri bir tepe (Şekil 2A, alt resim) gösterir. </li><li> Alan stimülasyonu (Şekil 2A ve B) cevaben sarkomer uzunluğunun değişiklikleri kaydedin. Not: 1 içinde yüklü miyositleri kullanın - 2 saat. </li><li> Video tabanlı sarkomer algılama sistemine alan miyosit (Şekil 2A) boyutu böylece kameranın diyafram ayarlayın. 510 nm (satın alma frekansı 1000 Hz) 360 nm / 380 nm eksitasyon ve emisyon ile miyosit uyarır. Tutanak sarkomer kısalma ve alan uyarımı (Şekil 2B) ile Fura2 AM oranı. </li></ol></li></ol> Myofilament Ca 2+ Hassasiyet 5. Değerlendirme <ol><li> Ölçülen değer ile hem (- (20 izleri 10) ve aynı miyosit ve sarkomer uzunluğu vs Fura-2 oranı faz-düzlem döngü arsa sarkomer uzunlukları ve kararlı durumda 2 + transientler Ca ortalamas ve delta değişiklikleri; Şekil 2C). </li><li> Her arsa,% 50 rahatlama de Fura -2 oranı (EC 50, Şekil 2C) tanımlar. Döngü ve her müdahale EC 50 hem karşılaştırın. </li></ol>

<ol><li>Bers, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li>
<li>Eisner, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+calcium+cycling+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle.</a> Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).</li>
<li>Palmiter, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+regulating+the+myofilament+response+to+Ca2%2B%3A+implications+of+mutations+causal+for+familial+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy.</a> Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).</li>
<li>Missiaen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+intracellular+Ca2%2B+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease.</a> Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).</li>
<li>Trafford, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca+content+in+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).</li>
<li>Berlin, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+cytosolic+calcium+buffering+properties+of+single+rat+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes.</a> Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).</li>
<li>Robertson, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+time-course+of+Ca2%2B+exchange+with+calmodulin%2C+troponin%2C+parvalbumin%2C+and+myosin+in+response+to+transient+increases+in+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+.</a> Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).</li>
<li>Schober, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofilament+Ca2%2B+sensitization+increases+cytosolic+Ca2%2B+binding+affinity%2C+alters+intracellular+Ca2%2B+homeostasis%2C+and+causes+pause-dependent+Ca2%2B-triggered+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia.</a> Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).</li>
<li>Briston, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balanced+changes+in+Ca+buffering+by+SERCA+and+troponin+contribute+to+Ca+handling+during+%CE%B2-adrenergic+stimulation+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes.</a> Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).</li>
<li>Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+control+of+cardiac+myofilament+response+to+calcium+by+S-glutathionylation+at+specific+sites+of+myosin+binding+protein+C%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C.</a> Front Physiol. 4, 336(2013).</li>
<li>Jin, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofilament+Ca2%2B+desensitization+mediates+positive+lusitropic+effect+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+in+left+ventricular+myocytes+from+murine+hypertensive+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+L-type+Ca2%2B+channel+activity+by+neuronal+nitric+oxide+synthase+and+myofilament+Ca2%2B+sensitivity+in+cardiac+myocytes+from+hypertensive+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat.</a> Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>Spurgeon, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+calcium+and+myofilaments+in+single+rat+cardiac+myocytes+achieve+a+dynamic+equilibrium+during+twitch+relaxation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation.</a> J Physiol. 447, 83-102 (1992).</li>
<li>Preston, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+effects+of+the+DCM+mutant+Gly159Asp+troponin+C+in+skinned+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres.</a> Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).</li>
<li>Willott, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Troponin+that+cause+HCM%2C+DCM+AND+RCM%3A+what+can+we+learn+about+thin+filament+function%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function?</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).</li>
<li>Yasuda, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+study+contraction+characteristics+of+a+single+cardiac+myocyte+using+carbon+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).</li>
<li>Sears, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neuronal+nitric+oxide+synthase+isoform+regulates+myocardial+contraction+and+calcium+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling.</a> Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).</li>
<li>Ashley, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+nitric+oxide+synthase+1+regulates+basal+and+beta-adrenergic+contractility+in+murine+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes.</a> Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).</li>
<li>Zhang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+phospholamban+phosphorylation+is+associated+with+impaired+relaxation+in+left+ventricular+myocytes+from+neuronal+NO+synthase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice.</a> Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).</li>
<li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li>
<li>Grynkiewicz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada, tek izole kardiyak miyosit içinde Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikleri değerlendirmek için protokoller tanımlar ve bu elektrofizyolojik özellikleri yanında parametreyi, hücre içi Ca 2 + transientler ve Myofilament dinamiklerini ölçmek önemini vurgulamaktadır. bir ya da parametrelerin iki kayıtları kalp kasılma ve gevşeme altında yatan mekanizmaları izah olmayabilir olmasıdır. Miyosit daralma ve hücre içi Ca2 + profil ayrı ayrı 1 ölçmek geleneksel yöntemlerin aks...

Kardiyak eksitasyon-kasılma (EC) bağlantı miyokard, yani kalbin 1,2 kasılma fonksiyonu mekanik özelliklerini analiz etmek için temel düzenidir. AK bağlantı sarkolemmal iyon kanallarının faaliyetleri ikincil membran depolarizasyon tarafından başlatılan (örneğin, yama-kelepçe teknikleri ile ölçülebilir voltaj kapılı Na + kanal). (Nanomolar gelen nM sitozolik Ca 2 + konsantrasyonunun artması ryanodin reseptörleri (RyRs) aracılığıyla voltaj bağımlı L-tipi sonraki aktivasyonu Ca 2 + kanal LTCCs aracılığıyla 2+ akını Ca toplu tetikler (LTCCs) ve Ca 2+ açıklaması, ) (uM) seviyesini mikromolar. Sitosolik Ca2 + böyle bir artış, ince filamanların troponin C (TNC) bağlanabilen Ca2 + teşvik eder ve ortaya çıkarır filament kompleks yapı değişiklikleri, aktin-miyosin etkileşimin kolaylaştırmak ve myocardi ulaşıral 3 daralma. Tersine, sitozolik Ca 2 + SR Ca 2 + -ATPase&#39;ın ile sarkoplazmik retikulum (SR) (SERCA2a) geri re-Alınan veya Na + / Ca 2+ eşanjör ve plazmalemmal yoluyla miyosit dışarı ekstrüde edilir Ca + 2 ATPaz 1,2. Sonuç olarak, sitozolik Ca düşüş 2+ aktin-miyozin ve miyosit rahatlama 1-3 ayrışmasından kaynaklanan özgün durumuna ince filamentler yapısal değişiklikleri başlatır. Çoğu memeli kalp hücrelerinin 1 sitosolik Ca2 + kaldırılması% 90 - Bu şemada, SERCA2a aktivitesi, genel olarak 70 oluşturmaktadır miyokardiyal gevşeme hızını belirlemek için kabul edilir. Vb LTCC, RYR ve SERCA2a, böyle anormal Ca 2 + işleme gibi hastalıklı kalp 1-4 bozulmuş kontraktilite ve dinlenmek için birincil mekanizma olarak kabul edilmiştir. 2+ toplam hücre içi Ca yaklaşık% 1 EC bağlantı hesaplarında haberci ve Ca 2+ çoğunluğu olarak işlev hücre içi Ca 2 + tamponlar 5,6 bağlıdır serbest sitozolik Ca 2 +. Bu durum, çeşitli Ca 2 + tamponlar, SR, örneğin, membran fosfolipidleri, ATP, fosfokreatin, kalmodulin, parvalbumin, myofibril TNC miyosin, SERCA2a ve calsequestrin kardiyak miyositlerde bol olduğu gerçeğidir. 5,6,7. Aralarında, SERCA2a ve TNC baskın Ca2 + tamponlar 5,6,7 vardır. Ayrıca, Ca 2 + onun tamponlar bağlanmasını seğirme sırasında dinamik bir süreçtir ve ek nedeni bağlayıcı Ca değişikliği 2+ (örneğin, 2+ Ca% 30-50 2+ transientler 7 TNC bağlanır ve Ca sırasında ondan ayırmak) kons 2+ hücre içi Ca değişiklikler de, sitoplazmada serbest Ca 2 + sonuçlarını &quot;serbest&quot;entration. Sonuç olarak, hücre içi Ca 2 + düzeyinin pertürbasyon kasılma disfonksiyonu ve aritmi 8,9 öncüleri olan anormal Myofilament hareketleri, neden olur. (Fizyolojik ve patolojik hem de) pek çok faktör Myofilament Ca 2 + tamponlama ve Myofilament Ca 2+ duyarlılığını 8-10 etkileyen Myofilament proteinlerin post-transkripsiyonel modifikasyonları, kaynakları olabilir. Son zamanlarda, bu Ca 2 + transientler, anormal Ca 2 + bırakma ve aritmiler 8 duraklamaya bağlı güçlendirilmesini tetikleme, Myofilament proteinleri mutasyonlar Ca 2 + bağlayıcı afinite ve hücre içi Ca2 + taşıma artış olduğu bildirilmiştir. Bu anlayış doğrultusunda, biz de yüksek sistolik ve diyastolik Ca 2 + düzeyleri ile ilişkili nöronal nitrik oksit sentaz up-regülasyonu sekonder hipertansif sıçan kalplerinde o Myofilament Ca 2 + duyarsızlaştırma göstermiştirSırayla, Ca 2 + bağımlı inaktivasyon 12 LTCC açığı artırmaktadır 11. Bu nedenle, Myofilament Ca 2+ duyarlılığı hücre içi Ca2 + homeostasis ve miyosit kasılma fonksiyonu bir &quot;aktif&quot; düzenleyicisidir. Bu Myofilament ve Ca arasındaki etkileşimleri analiz etmek için gerekli hale gelmiştir 2+ miyosit AK kavraması ve kalp fonksiyonlarının ayrıntılı bir araştırma için proteinleri ele. Burada, izole kardiyak miyositlerdeki Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikleri değerlendiren bir protokol açıklar. Hücre içi Ca 2 + profilinin kapsamlı bir analiz, Myofilament Ca 2+ duyarlılık ve daralma yeni mekanizmaları altında yatan miyokard mekaniği ortaya çıkarmak olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley sıçan</td><td>Koatech</td><td></td><td>8-12 hafta</td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodyum</td><td>Hanlim İlaç (Kore)</td><td>AHN901</td><td>Sigorta kodu:645301220</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Merck</td><td>8.08616.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; </td><td>Sigma</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Fetal Albümin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 ()</td> <td>Moleküler Problar</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127 DMSO</td><td>Invitrogen</td> içinde% 20 çözelti <td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama Su Banyosu</td><td>Chang Shin Bilimsel</td><td>Model: C-108</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard Softwae Suite</td><td>IonOptix Ltd</td><td>Deneysel Oluşturucu</td><td>Miyositlerde EC Birleştirme Verilerinin Elde Edilmesi ve</td></tr><tr><td>Analizi Miyosit Kalsiyum & Kasılma Kayıt Sistemi</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sirkülasyonlu Su Banyosu</td><td>BS-Tech</td><td>BW2-8</td><td></td></tr><tr><td>Miyosit Floresan Mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>DIATPHOTO 200</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S Power</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresan & Video Algılama</td><td>IonOptix</td><td>MyoCam-S</td><td></td></tr><tr><td>CFA300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT400</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresan & Sistem Arayüzü</td><td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td>Uyarma Işık Kaynağı</td><td>IonOptix</td><td>mSTEP</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek yoğunluklu ARC Lambası Güç kaynağı</td><td>Cairn Araştırma Filtresi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tekerlek kontrolörü</td><td>IonOptix</td><td>GB/MUS200</td><td></td></tr><tr><td>Dijital Stimülatör</td><td>Tıbbi Sistemler Corpart</td><td>S-98 Mutimode</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Deneysel Çözeltilerin Bileşimleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>İsim</güçlü></td><td>güçlü<Güçlü>Şirket<güçlü></td><td>güçlü<güçlü>Katalog Numarası</güçlü></td><td>Yorumlar</güçlü></td></tr><tr><td>İzolasyon Çözeltisi (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Konsantrasyon (mmol) 135</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Konsantrasyonu (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Konsantrasyonu (mmol) 5</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Konsantrasyonu (mmol) 5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Konsantrasyonu (mmol) 3.5</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Konsantrasyonu (mmol) 20</td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; </td><td>Sigma</td><td>71649</td><td>Konsantrasyon (mmol) 0.4</td></tr><tr><td>Depolama Çözeltisi (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Konsantrasyon (mmol) 120</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Konsantrasyon (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Konsantrasyon (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Konsantrasyon (mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl < alt > 2 < / alt ></td> <td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Konsantrasyon (mmol) 0.2</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Konsantrasyon (mmol) 29</td></tr><tr><td>MgSO4< / sub</td><td>>Sigma</td><td>M5921</td><td>Konsantrasyon (mmol) 5</td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>Konsantrasyon (mmol) 5</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Konsantrasyon (mmol) 20</td></tr><tr><td>Perfüzyon Çözeltisi (Tiroz çözeltisi, pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Konsantrasyon (mmol) 141.4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Konsantrasyon (mmol) 4</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>Konsantrasyon (mmol) 0.33</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Konsantrasyonu (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Konsantrasyonu (mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Konsantrasyonu (mmol) 1.8&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Fura 2AM yüklemesi için, CaCl2 konsantrasyonları 0.25 mM ve 0.5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Konsantrasyonu (mmol) 1</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Konsantrasyonu (mmol) 14.5</td></tr><tr><td>Kollangenaz Solüsyonu 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzolasyon Solüsyonu (30mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sığır Fetal Albümini (BSA solüsyonu 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Konsantrasyon (mmol) 1.67 mg / mL</td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Konsantrasyon (mmol) 1 mg / mL</td></tr><tr><td>Proteaz</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td>Konsantrasyon (mmol) 0.1 mg / mL</td></tr><tr><td>CaCl 2 </td> <td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Konsantrasyon (mmol) 0.05 mM</td></tr><tr><td>Kollangenaz Solüsyonu 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzolasyon Solüsyonu ( 20 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sığır Fetal Albümini (BSA çözeltisi 3.3 mL)</td><td></td><td></td> <td>Konsantrasyon (mmol) 1.67 mg / mL</td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Konsantrasyonu (mmol) 1 mg / mL</td></tr><tr><td>CaCl < alt > 2 < / alt ></td> <td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Konsantrasyonu (mmol) 0.05 mM</td></tr><tr><td>BSA çözeltisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzolasyon Çözeltisi ( 40mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sığır Fetal Albümin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Konsantrasyonu (mmol) 400 mg</td></tr><tr><td>CaCl < alt > 2 < / alt ></td> <td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Konsantrasyonu (mmol) 1mM</td></tr></tbody></table>

myofilament ca değerlendirilmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; duyarlılık temelinde kardiyak uyarma-kasılma kaplin

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

Kalp yetmezliği ve kardiyak aritmi, dünya çapında mortalite ve morbidite nedenlerinin başında gelmektedir. Ancak, hastalıklı kalbinde patogenezi ve miyokard arıza mekanizması tam açıklığa kavuşturulması kalır. Son zorlayıcı kanıtlar Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikler kardiyak miyositler hücre içi Ca 2 + homeostazı ve iyon kanal faaliyetlerini etkileyen gösteriyor sağlıklı ve hastalıklı kalpleri kardiyak aksiyon potansiyeli ve daralma sorumlu temel mekanizmalar. Gerçekten de, (örneğin, Na +, Ca 2+ ve K + kanalları ve Na + -Ca 2+ değiştirici) ve hücre içi Ca 2 + taşıma proteinleri (örneğin., Ryanodin reseptörleri ve Ca kardiyak aksiyon potansiyelleri altında yatan iyon kanallarının faaliyetleri ve taşıyıcılar sarkoplazmik retikulum (SERCA2a) ya da fosfolamban&#39;ın ve fosforilasyon) 2 + ATPaz geleneksel katı değerlendirme için ölçülürKalp eksitasyon-kasılma (EC) bağlantının temel mekanizmaları yedik. Myofilament kasılma ve gevşeme fonksiyonel birimi ve Myofilament Ca 2 + duyarlılığı myofibril performans uygulanmasında zorunlu ise zarı ve hücre içi Ca + 2 değişiklikler iki elektriksel aktivitesindeki AT kuplaj başlatma sinyalleridir. Bu çalışmanın odak noktası olmadıkça Bununla birlikte, az sayıda çalışma miyokardın fonksiyonel analiz içine Myofilament Ca 2+ duyarlılığını içermektedir. Burada, sarkomer kısalma / yeniden uzaması ve Fura-2 AM (oranlı metrik algılama) ve sıçan kalpleri kardiyak miyozitlerde Myofilament Ca 2+ duyarlılık değişiklikleri değerlendirmek kullanarak hücre içi Ca 2 + seviyesini ölçen bir protokol açıklar. Temel amacı Ca 2+ duyarlılık mekanik analiz için AK bağlantı dikkate alınması gerektiğini Myofilament vurgulamaktır. i kapsamlı bir soruşturmaöteleme ve terapötik değeri daha etkili stratejiler tasarlamak için değerli bilgiler sağlayacaktır sağlıklı ve hastalıklı kalplerde miyosit kontraktilite altında yatan kanalları, iyon taşıyıcılar, hücre içi Ca 2 + taşıma ve Myofilament Ca 2+ hassasiyeti üzerinde.

LV miyositler normal ve hipertansif sıçan kalpleri izole edilmiştir. Alan uyarılmasına tepki olarak açık bir şeritlerin (sarkomer temsil eder) ve sabit kasılmalarla çubuk şekilli miyositler uygun miyositler olarak kabul edilir ve kayıt (Şekil 2A) için seçilir. F ŞEKIL 2A&#39;da gösterilen örnekte, Fura 02:00 AG miyosit yatay konumlandırılmış ve miyosit kayıt alanı ve en az arka bölgenin en dahildir kaplayacak şekilde kameranın açıklık ayarlanır -yüklü. k...

Bu makale, sıçan kalbinden izole edilen kardiyak miyositlerde kasılma sırasında miyofilament Ca2+ duyarlılığındaki değişiklikleri değerlendiren bir protokolü açıklamaktadır. Kardiyak elektrofizyoloji, sistolik/diyastolik sitozol Ca2+ seviyeleri ve kasılma/gevşeme ile birlikte bu ölçüm, sağlıklı ve hastalıklı kalplerde kardiyak uyarılma-kasılma eşleşmesine aracılık eden mekanizmaların desteklenmesinde zorunludur.

Myofilament Ca Değerlendirilmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Duyarlılık temelinde Kardiyak Uyarma-kasılma Kaplin

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

Bu prosedürün genel amacı, sağlıklı ve hastalıklı kalplerdeki kasılmanın temelinde yatan mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için miyofilaman kalsiyum duyarlılığına erişmektir. Bu yöntem, kalp konjesiyonu ve kalp yetmezliği ile ilgili soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, iyon kanalları, iyon taşıyıcıları ve hücreler arası kalsiyum yönetimi ile birlikte, sağlıklı ve kalp hastalığı olan fare kalbi kasılabilirliğinin altında yatan mekanizmaya dair kapsamlı bir anlayış sağlamasıdır.Bu prosedüre başlamak için, iki su banyosunu 37 °C'ye ısıtın. 25 mL kollajenaz çözeltisi birine 5 mL kalsiyumsuz BSA çözeltisi ve 16,7 mL kollajenaz çözeltisi ikisine 3,3 mL kalsiyumsuz BSA çözeltisi ekleyin. Ardından, Langendorff perfüzyon sistemindeki birinci kolona 100 mL izolasyon çözeltisi ve ikinci kolona 30 mL kollajenaz çözeltisi bir ekleyin.Langendorff perfüzyon sistemindeki oksijen bağlantı tüpü aracılığıyla, birinci sütundaki izolasyon çözeltisini ve ikinci sütundaki kollajenaz çözeltisini oksijenize edin. Benzer şekilde, çalkalamalı su banyosundaki kollajenaz çözeltisi iki ve BSA çözeltisini oksijen bağlantı tüpü üzerinden %100 oksijen ile oksijenize edin. Bu adımda, bir SD sıçanına intraperitoneal pentobarbital sodyum enjeksiyonu ile anestezi uyguladıktan sonra, ayak parmağı sıkıştırma yöntemi ve çekilme refleksinin yokluğu ile anestezi durumunu doğrulayın.Ardından, sıçanı bir diseksiyon tepsisine aktarın. Sırt üstü pozisyondayken, dört bacağı bantla gövdenin yanlarına sabitleyin. Daha sonra, aortu ince bir pensle kenetleyin ve derhal Langendorff perfüzyon sisteminin kanülünü yerleştirin.Ardından, sütür ipini aortanın üzerinde sıkıca bağlayın. Birinci kolondaki vanayı açın ve izole edilen kalbi 10 dakika boyunca önceden ısıtılmış, oksijenlendirilmiş izolasyon solüsyonu ile perfüze edin. Sonrasında, ikinci kolondaki vanayı açın ve kalbi sekiz ila 10 dakika boyunca kollajenaz solüsyonu bir ile perfüze edin.Ardından, aortayı keserek sindirilmiş kalbi çıkarın ve taze izolasyon çözeltisi içeren flaska aktarın. İnce makas ve pens kullanarak, septum dahil olmak üzere sol ventrikül (LV) serbest duvarının büyük kısmını daha küçük parçalara bölün. Daha sonra, dokuları önceden ısıtılmış ve oksijenle zenginleştirilmiş taze kolajenaz çözeltisi iki içeren bir flaska aktarın.Ardından, 10 dakika boyunca çalkalayın ve kollajenaz içeren miyosit çözeltisini oksijenlendirilmiş halde tutun. Sonrasında, miyosit süspansiyonunu 10 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve kalsiyum içeren BSA çözeltisi ekleyin. İki dakika boyunca santrifüj edin.İki dakika sonra, süpernatantı dökün ve miyosit pelletini beş mililitre BSA çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Ardından, santrifüjleyin ve süpernatantı tekrar dökün. Sonrasında miyosit pelletini dağıtın ve miyositleri, deney sona erene kadar oda sıcaklığında 10 mililitre ön oksijenlendirilmiş saklama çözeltisi içinde tutun.Şimdi, LV miyositlerini iki mikromolar asetoksimetil ester Fura-2AM ile yükleyin. Bir mililitre miyosit süspansiyonunu 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatantı atın ve miyosit peletini düşük kalsiyum konsantrasyonlu bir mililitre Tyrode çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.Ardından, miyositlere Fura-2AM ve iki mikrolitre poloksamer 407 ekleyin. Miyosit süspansiyonunu nazikçe dağıtın ve karışımı 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. 15 dakika sonra, karışımı beş saniye boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve miyosit peletini 500 µM kalsiyum içeren bir mililitre perfüzyon solüsyonu içerisinde dağıtın. 10 dakika sonra, karışımı beş saniye boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Ardından, taze perfüzyon solüsyonu ekleyin ve Fura-2AM yüklü miyosit peletini kayıtlar için bu solüsyonda tutun.Kayda başlamadan önce, bir su ceketinden geçen perfüzyon tüpünü 36 °C'deki Tyrode çözeltisi ile doldurun. Ardından, Fura-2AM yüklü LV miyosit süspansiyonundan birkaç damlayı ters floresan mikroskobun haznesine yerleştirin ve beş ila sekiz dakika bekleyin. Bunu, dakikada 2,2 mL hızında Tyrode çözeltisi ile yavaşça perfüze edin.Ardından, 2 Hz'de alan stimülasyonunu başlatmak için dijital stimülatörün ön panelindeki başlat düğmesine basın. Kayıt için stabil şekilde kasılan miyositleri seçin. Burada, sham ve hipertansif sıçanlardan alınan LV miyositlerindeki sarkomer kısalmasının ham izleri ve Fura-2 oran ölçümleri gösterilmektedir.Sarkomer uzunluğu ve Fura-2 sinyallerinin ortalama izleri burada gösterilmiştir. Ve burada, iki gruptaki sarkomer uzunluğuna karşı Fura-2 oranının faz düzlemi grafikleri yer almaktadır. Yörünge döngüsü sağa kaymıştır ve EC50 hipertansiyonda daha yüksek olma eğilimindedir; bu durum miyofilaman kalsiyum duyarsızlaşmasını düşündürmektedir.Bu prosedürü denemeden önce, Fura-2AM yüklemesi yapmadan miyosit kontraksiyonunu saptayarak kortiyumu, yani izole edilmiş miyositleri test etmeyi hatırlamak önemlidir. Ayrıca, aşırı yüklemeyi önlemek için Fura-2AM yüklemesinden sonra her zaman miyosit kontraksiyonunu kontrol edin. Bu prosedürün ardından, ek soruları yanıtlamak için patch clamp teknikleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Örneğin, A tipi Ca kanalı aktivitesi, yani fonksiyonel olarak miyosit eksitasyon-kontraksiyon eşleşmesi. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, gelecekteki kardiyak fizyoloji araştırmacılarına insanlardaki kalp hastalıkları hakkında daha derin bilgiler keşfetme yolu açmıştır. Rutin deneyimle birlikte, miyofilaman kalsiyum kanalı aktivitesinin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Sağlıklı ve hastalıklı kalplerde kardiyak uyarılma-kasılma eşleşmesini yöneten mekanizmaları daha iyi anlamak amacıyla.

assessment-myofilament-ca2-sensitivity-underlying-cardiac-excitation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz doğrudan kas kuvveti, kas gücü, kasılma kinetiği ve izole iskelet kaslarında yorulma ölçmek için bir yöntem...

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

Murin sol ventrikül papiller kas in vitro kardiyak kontraktiliteyi araştırmak için kullanılabilir. Bu makalede ayrıntılı olarak izolasyon ve deneysel protokoller kalp kasılma özelliklerini incelemek için açıklar.

Farelerde Kardiyak inotropiyi Soruşturma İzole papiller Kaslar kontraktilite Ölçümleri

Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Bu protokol, derili kardiyomiyositler kullanılarak kardiyak fonksiyonun ekstraksiyon ve değerlendirilmesi tekniğini adım adım tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodoloji, farelerden erkeklere kadar farklı kardiyak yerlerden toplanabilen küçük dondurulmuş biyopsiler kullanarak miyofilament fonksiyonunun ölçülmesine ve akut modülasyonuna olanak sağlar.

Derili Kardiyomiyositler Kullanarak Kardiyak Fonksiyonun İn Vitro Değerlendirilmesi

Tavşan kardiyomiyositlerinde GtACR1 aktivasyonunun elektromekanik etkilerinin değerlendirilmesi için bir protokol sayılmiyoruz. Hücre izolasyonu, kültür ve adenoviral transdüksiyon ve yama-kelepçe ve karbon-fiber teknikleri ile fonksiyonel deneyler hakkında ayrıntılı bilgi salıyoruz.

Optogenetik Modüle Kardiyomiyosit Aktivitesinin Elektromekanik Değerlendirilmesi

Burada nano-Newton çözünürlüğü ile striated kas miyofibrils kontraktil özelliklerini değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Protokolde interferometri tabanlı optik kuvvet sondası içeren bir kurulum uyguluyor. Bu kurulum yüksek sinyal-gürültü oranı ile veri üretir ve miyofibrils kontraktil kinetiği değerlendirilmesini sağlar.

İskelet Kas Biyopsilerinden Miyofibrillerin İzlenmesi ve Nano-Newton Çözünürlük Transdüseri ile Kontraktil Fonksiyonun Belirlenmesi

Bu protokol, aktif olarak kasıtlı bir kardiyak trabecula ex vivo'dansarkom, kalsiyum ve makroskopik geometrik verilerin bir koleksiyonunu sunar. Bu eşzamanlı ölçümler üç görüntüleme yönteminin entegrasyonu ile mümkün olmaktadır.

Kardiyak Trabeculae Ex Vivo'nun Eşzamanlı Brightfield, Floresan ve Optik Tutarlılık Tomografik Görüntülemesi

İzole sıçan miyositlerinde kalsiyum (Ca2+) geçici ölçümü ile birlikte sarkomer uzunluğu tespiti yoluyla kontraktil fonksiyonun ölçümünü tanımlayan bir dizi protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşımın kalp yetmezliğinin hayvan modellerindeki çalışmalar için uygulanması da dahil edilmiştir.

Kemirgen Miyositlerde Kardiyak Kasılma Disfonksiyonu ve Ca2+ Geçicilerinin Analizi

Bu protokol, klinik öncesi gelişim sırasında ilaca bağlı kontraktilitedeki değişiklikleri değerlendirmek için güvenilir bir platform olan MyoBLAZER sistemi ile donör kalplerinden alınan yetişkin insan primer kardiyomiyositlerinde kontraktilitenin nasıl ölçüleceğini açıklar.

İzole Yetişkin İnsan Primer Kardiyomiyositlerinde Kalp Kontraktilitesinin Ölçülmesi

İşlevsel bölgeye yönelik florometri, protein alanı hareketlerini gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılan bir yöntemdir. Bu tekniğin doğal hücrelerde uygulanması için modifikasyonu, artık murin izole iskelet kası liflerindeki voltaj kapılı Ca2 + kanallarından tek voltaj sensörü hareketlerinin tespit edilmesine ve izlenmesine izin vermektedir.

İskelet Kas Uyarılabilirliğini Incelemek için Doğal Hücrelerde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri

Öğrenin, kardiyak miyositlerde miyofilament Ca2+ duyarlılığını değerlendirme yöntemini. Bu protokol, sağlıklı ve hastalıklı kalplerde uyarılma-kasılma kaplini anlamak için Fura-2 AM kullanarak sarcomere kısalması ve intraselüler Ca2+ ölçümlerini birleştirir.

Myofilament Ca Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet