In-alan uygulamaları için tasarım ve Aptamer-Altın Nanopartikül Tabanlı Kolorimetrik Tahliller Gelişimi
23 Haziran 2016
in-the-alanın uygulamaları için küçük moleküllerin tespiti için aptamer-altın nanoparçacık kolorimetrik testinin tasarım ve geliştirme incelenmiştir. Buna ek olarak, akıllı aygıt kolorimetrik bir uygulama (uygulama) doğrulandı ve analiz uzun süreli depolama alanında kullanım için kurulmuştur.
Genel amaç, hedef moleküllerin tespiti için aptamer-altın nanoparçacık tabanlı kolorimetrik testin geliştirilmesine genel bir yaklaşım sunmak ve uzun vadeli depolamayı iyileştirmek ve yanlış pozitif yanıt oranlarını azaltmak için yaklaşımlar sağlamaktır. Bu yöntem, uzun vadeli depolama için sahadaki testlerin tekrarlanabilirliği ve yanlış pozitif yanıt oranının düşürülmesi gibi altın nanopartikül aptamer kolorimetrik testler alanındaki temel soruları yanıtlar. Bu testler raf ömrü ve yanlış pozitif yanıtlar açısından sorunlara yatkın olabilir.
Bu çalışmada, her iki konuda da ilerleme kaydediyoruz. 500 mililitrelik Erlenmeyer şişesini ve büyük karıştırma çubuğunu, beş mililitre konsantre nitrik asit ve 15 mililitre konsantre hidroklorik asit ile kimyasal bir güvenlik kapüşonunda temizleyin. Matonun tüm yüzeyini asit yıkama ile ıslat.
Sonra matayı nukleazsız suyla durulayın ve şişesinin kurumasına izin verin. 100 mililitre bir milimolar altın üç klorür ekleyin. Asitle temizlenmiş Erlenmeyer termosunun üstünü bir alüminyum folyo ile kapatın ve sıcak plakada sürekli karıştırarak kaynayana kadar ısıtın.
Sonra, 10 mililitre 38,8 milimolar sodyum sitrat ekleyin. Renk birkaç dakika içinde berrak veya griden koyu mavi veya siyaha, son olarak koyu veya kırmızıya değişir. Ateşi kapatarak 10 dakika karıştırmaya devam edin.
Altın nanopartikül süspansiyonunun oda sıcaklığına soğumasına izin verin ve sürekli karıştırarak 110 mikrolitre DEPC ekleyin. Tüm matayı alüminyum folyo ile kaplayın ve DEPC işleminin gece boyunca kuluçkaya geçmesine izin verin. Ertesi gün, altın nanopartikül süspansiyonunu otoklavlayın.
Sonra oda sıcaklığına soğutup 0,22 mikron gözenekli selüloz asetat membranından filtreleyin. Filtrelenmiş, otoklavlanmış altın nanopartikül stok çözümünü karanlıkta dört derece Celsius sıcaklığında sakla. Metin protokolünde tanımlandığı şekilde altın nanopartikül konsantrasyonunu hesaplayın.
Burada, dinamik ışık saçılmasıyla belirlenen 10 nanomolar boyutta 10 nanomolar olarak hesaplandı. Standart fosforamidit kimyası kullanarak kokain bağlayan aptamer dizilerini satın alın veya sentezleyin. Aptamerler standart tuz arındırma ile arındırıldıktan sonra, oligonukleotidleri nukleazsız suda 100 mikromolar veya bir milimolar stok çözeltilerinde yeniden oluşturulur.
Aliquoted arındırılmış aptamerler birkaç ay boyunca 20 derece Celsius'ta saklanabilir. DNA'yı 10 nanomolar stok altın nanopartikül çözeltisi ile birleştirin, istenen şekilde altın nanopartiküllerin hacmini değiştirerek testin yapılabilmesi için yeterli örnek sağlanın. Karışımı oda sıcaklığında üç ila dört saat kuluçka yapın ve ışıktan korun.
Eşit hacimde 20 milimolar HEPES, iki milimolar magnezyum klorür ve pH 7.4 tampon ekleyin ve örneği gece boyunca dört derece Celsius sıcaklığında karanlıkta koyun. Tuz titrasyonu ile test renk yanıtını indüklemek için gereken ilk tuz konsantrasyonu, analiz blankı ile belirlenir. 96 kuyuyla bir plakada aptamer-altın klorür testinin 180 mikrolitrelik alikotlarına 20 mikrolitre metanol ekleyin.
Bu testlerin performansında kritik bir adım, hedef eklendikten sonra altın nanopartikülleri dengesizleştirecek sodyum klorür konsantrasyonunu belirlemektir. Örnekleri artan hacimde stok sodyum klorür çözeltisi ile titrleyin ve eşdeğerlik noktasını belirleyin. Burada, en ufak renk değişikliğine neden olacak sodyum klorür hacmini görsel gözlemle belirleyin.
Test yanıtını optimize ederek, oda sıcaklığında 96 kuyu bir plakada 180 mikrolitrelik aptamer-altın nanopartikül testine metanolde seyreltilmiş 20 mikrolitre analit molekülü ekleyin. Hemen, önceki adımda belirlenen sodyum klorür konsantrasyonunu ekleyerek analiz renk yanıtını başlatın. Sodyum klorür konsantrasyonunu artırarak veya azaltarak ve hedef yanıtı boş yanıtla karşılaştırarak mümkün olan en büyük renk değişimini elde edin.
En büyük yanıt farkını sağlayan sodyum klorür konsantrasyonunu kullanın. Sodyum klorür eklendikten 150 saniye sonra test yanıtını gözlemleyin veya ölçün. 650 nanometre ve 530 nanometre soğurgunculukları spektrofotometre kullanarak analiz edin.
Sonuçları, 650 nanometre ve 530 nanometrede elde edilen absorbans oranı olarak analit konsantrasyonuna bağlı olarak çizin. Boş sinyale test tepkisini normalleştirin. Videoda daha önce anlatıldığı gibi aptamer-altın nanopartikül analiz bileşenlerini hazırlayın.
Nükleazsız suda mililitre başına bir gram trehaloz ve mililitre başına bir gram sukroz içeren ayrı çözeltiler yaparak kriogen çözeltisi oluşturulur. Bu testlerin dondurulmasında kritik bir adım, örneklere ne kadar trehaloz ve sukroz çözeltisi ekleyeceğini, böylece tam ve hatta dondurulmasını sağlamaktır. Mililitrede 19,2 miligram trehaloz ve mililitrede 4,8 miligram sukroz içeren bir çözelti yapın; 60 MN4 DNA ile altın başına nanopartikül testi ile son hacmde 200 mikrolitre 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüplerinde bulunun.
Son kriyojen çözeltisi konsantrasyonları DNA kapsamına göre değişir. Örnekleri 146 derece Santi-celsius dondurucu veya sıvı azotla ani dondurun. Örnekleri dondurarak kullanılana kadar sakla.
Bu iş için örnekleri gece boyunca 146 derece soğutulmuş dondurucuda bırakın ve ardından uzun süreli depolama için 20 derece Celsius dondurucuya aktarın. Burada, işlenmemiş ve DNA aptameri ile işlenmiş altın nanopartiküller için sodyum klorür titrasyon eğrilerinin temsil edici sonuçları gösterilmiştir. Testte kullanılan başlangıçta sodyum klorür konsantrasyonu titrasyon ile belirlendi.
Kokain ve kontrol molekülleri için aptamer-altın nanopartikül kolorimetrik testin temsil eden sonuçları burada gösterilmiştir. Grafikler, DNA kapsama yoğunluğunu artırmanın kokain testinin yanlış pozitif yanıt oranı üzerindeki etkisini ortaya koymaktadır. Burada, kokain kolorimetrik testinin fotogörüntü analizinden elde edilen kalibrasyon eğrisi grafikleri gösterilmiştir.
Akıllı telefonlarla elde edilen fotoğraflar. Aptamer-altın nanopartikül kolorimetrik testin kokain ve kontrol moleküllerine yönelik test yanıtının temsilci sonuçları burada sunulmaktadır. Veriler, taze hazırlanmış örnekleri dört haftaya kadar dondurulmuş şekilde saklanan örneklerle karşılaştırır.
Bu işlemi denerken, altın nanopartikülleri dengesizleştirmek ve hedef eklendiğinde tipik renk değişimini teşvik etmek için doğru sodyum klorür konsantrasyonunun belirlenmesi çok önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, ilgi çekici hedeflerin tespiti için altın nanoparçacık aptamer kolorimetrik testlerin nasıl geliştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Burada belirtilen yaklaşımları kullanarak yanlış pozitif yanıt oranlarını azaltabilir ve testlerinizi bir aydan fazla süreyle geçerli tutabilirsiniz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, saha uygulamalarında küçük molekülleri tespit etmek için aptamer-altın nanopartikül kolorimetrik tahlili geliştirmeye odaklanmaktadır. Ayrıca uzun süreli depolama çözümlerini ele alır ve bu tahlilerde yanlış pozitif oranlarını azaltmayı hedefler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Nanoteknoloji
- Analitik Kimya
Arka Plan
- Aptamer-altın nanopartikül tahlilleri hedef molekülleri tespit etmek için kullanılır.
- Bu tahliller, raf ömrü ve yanlış pozitifler ile ilgili zorluklarla karşı karşıyadır.
- Saha koşullarında tekrarlanabilirliği artırmak esastır.
- Uygulamalı kullanımlar için uzun süreli depolama yöntemlerinin doğrulanması gerekmektedir.
Çalışmanın Amacı
- Aptamer-altın nanopartiküller kullanarak güvenilir bir kolorimetrik tahlili geliştirmek.
- Tahlilin uzun süreli depolama yeteneklerini artırmak.
- Tespit sırasında yanlış pozitif yanıtları en aza indirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Tahlilin hazırlanması laboratuvar ekipmanlarının asitle temizlenmesini içerir.
- Renkölçümlü analiz için bir akıllı cihaz uygulamasının doğrulanması.
- Tahlilin saha koşullarındaki performansını test etmek.
- Tahlilin uzun süreli depolanması için protokoller oluşturmak.
Ana Sonuçlar
- Tahlil, saha testlerinde gelişmiş tekrarlanabilirlik göstermiştir.
- Uzun süreli depolama yöntemleri başarıyla doğrulanmıştır.
- Yanlış pozitif oranları önemli ölçüde azaltılmıştır.
- Akıllı cihaz uygulaması renkölçümlü tespit için etkili bir şekilde çalışmıştır.
Sonuçlar
- Geliştirilen tahlili saha uygulamaları için uygundur.
- Depolama ve doğruluktaki gelişmeler pratik kullanımını artırır.
- Bu çalışma, nanopartikül tabanlı tespit yöntemlerinin ilerlemesine katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Developing robust, field-deployable detection methods for small molecules remains a critical challenge in early-stage target validation and assay development. Aptamer-gold nanoparticle colorimetric assays offer a pathway to reduce mechanistic ambiguity and improve predictive confidence in screening workflows by enabling quantitative, visual readouts adaptable to resource-limited settings. Addressing shelf-life limitations and false positive rates directly supports translational biomarker efforts and preclinical model reliability by ensuring assay consistency across discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through target-specific colorimetric responses that clarify binding interactions.
- Operational Value: Reduces false positive signals via aptamer surface passivation, improving assay specificity in complex matrices.
- Predictive Value: Supports lead identification by providing normalized absorbance ratios (650nm/530nm) as quantitative readouts for concentration-dependent target detection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates calibrated response curves using smartphone-based image analysis, enabling reproducible compound evaluation without laboratory-grade equipment.
- Operational Value: Establishes cryopreservation protocols with trehalose-sucrose solutions, extending assay viability beyond one month under frozen storage.
- Scalability Value: Uses standardized 96-well plate formats and sodium chloride titration to define equivalence points, facilitating assay standardization across teams.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-stage target engagement data to preclinical continuity through stable, long-term stored reagents suitable for iterative testing.
- Risk Mitigation: Minimizes false positive rates in colorimetric readouts, reducing noise in biomarker alignment studies and improving decision confidence.
- Reproducibility Value: Demonstrates consistent performance between freshly prepared and four-week frozen samples, supporting reliable cross-functional data sharing.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where quantitative, visually interpretable outputs support go/no-go decisions based on target engagement strength and selectivity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring analyte-dependent shifts in gold nanoparticle aggregation via spectrophotometric ratios.
- Screening: Delivers assay readiness through defined sodium chloride equivalence points and normalized response metrics that enable reliable compound screening.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (A650/A530 ratios) that allow teams to compare analyte concentrations and normalize to blank signals.
- Translational Research: Ensures preclinical continuity via cryostable reagents that maintain functionality over extended storage periods.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, reagent-based platform adaptable to various small molecule targets through aptamer substitution.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity and improved signal-to-noise ratios.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via cryopreservation and smartphone-enabled color analysis.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by minimizing false advances due to non-specific interactions.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through assays with demonstrated stability and specificity over time.
Implementation Considerations
- Requires expertise in oligonucleotide handling, nanoparticle synthesis, and buffer optimization.
- Depends on access to heating blocks, centrifuges, spectrophotometers or colorimetric imaging devices, and cold storage units.
- Necessitates cross-team standardization of sodium chloride titration protocols and cryoprotectant formulations.
- Involves adaptation considerations when transferring assays across different aptamer targets or sample matrices.
- Practical limitations include the need for empirical optimization of salt concentrations and aptamer:nanoparticle ratios for each new target.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Synthesis via Citrate Reduction of Gold Nanoparticles (AuNP) and Characterization
2:35
DNA-aptamer, Buffer, Solution, and Assay Preparation
3:35
Salt Titration and Assay Setup
5:21
Freezing Aptamer–AuNP Assay for Long-term Storage
6:38
Results: Assay Response with Changing DNA Coverage Density and Performance of the Assay for Long-term Storage
7:37
Conclusion
