In-alan uygulamaları için tasarım ve Aptamer-Altın Nanopartikül Tabanlı Kolorimetrik Tahliller Gelişimi

Genel amaç, hedef moleküllerin tespiti için aptamer-altın nanoparçacık tabanlı kolorimetrik testin geliştirilmesine genel bir yaklaşım sunmak ve uzun vadeli depolamayı iyileştirmek ve yanlış pozitif yanıt oranlarını azaltmak için yaklaşımlar sağlamaktır. Bu yöntem, uzun vadeli depolama için sahadaki testlerin tekrarlanabilirliği ve yanlış pozitif yanıt oranının düşürülmesi gibi altın nanopartikül aptamer kolorimetrik testler alanındaki temel soruları yanıtlar. Bu testler raf ömrü ve yanlış pozitif yanıtlar açısından sorunlara yatkın olabilir.

Bu çalışmada, her iki konuda da ilerleme kaydediyoruz. 500 mililitrelik Erlenmeyer şişesini ve büyük karıştırma çubuğunu, beş mililitre konsantre nitrik asit ve 15 mililitre konsantre hidroklorik asit ile kimyasal bir güvenlik kapüşonunda temizleyin. Matonun tüm yüzeyini asit yıkama ile ıslat.

Sonra matayı nukleazsız suyla durulayın ve şişesinin kurumasına izin verin. 100 mililitre bir milimolar altın üç klorür ekleyin. Asitle temizlenmiş Erlenmeyer termosunun üstünü bir alüminyum folyo ile kapatın ve sıcak plakada sürekli karıştırarak kaynayana kadar ısıtın.

Sonra, 10 mililitre 38,8 milimolar sodyum sitrat ekleyin. Renk birkaç dakika içinde berrak veya griden koyu mavi veya siyaha, son olarak koyu veya kırmızıya değişir. Ateşi kapatarak 10 dakika karıştırmaya devam edin.

Altın nanopartikül süspansiyonunun oda sıcaklığına soğumasına izin verin ve sürekli karıştırarak 110 mikrolitre DEPC ekleyin. Tüm matayı alüminyum folyo ile kaplayın ve DEPC işleminin gece boyunca kuluçkaya geçmesine izin verin. Ertesi gün, altın nanopartikül süspansiyonunu otoklavlayın.

Sonra oda sıcaklığına soğutup 0,22 mikron gözenekli selüloz asetat membranından filtreleyin. Filtrelenmiş, otoklavlanmış altın nanopartikül stok çözümünü karanlıkta dört derece Celsius sıcaklığında sakla. Metin protokolünde tanımlandığı şekilde altın nanopartikül konsantrasyonunu hesaplayın.

Burada, dinamik ışık saçılmasıyla belirlenen 10 nanomolar boyutta 10 nanomolar olarak hesaplandı. Standart fosforamidit kimyası kullanarak kokain bağlayan aptamer dizilerini satın alın veya sentezleyin. Aptamerler standart tuz arındırma ile arındırıldıktan sonra, oligonukleotidleri nukleazsız suda 100 mikromolar veya bir milimolar stok çözeltilerinde yeniden oluşturulur.

Aliquoted arındırılmış aptamerler birkaç ay boyunca 20 derece Celsius'ta saklanabilir. DNA'yı 10 nanomolar stok altın nanopartikül çözeltisi ile birleştirin, istenen şekilde altın nanopartiküllerin hacmini değiştirerek testin yapılabilmesi için yeterli örnek sağlanın. Karışımı oda sıcaklığında üç ila dört saat kuluçka yapın ve ışıktan korun.

Eşit hacimde 20 milimolar HEPES, iki milimolar magnezyum klorür ve pH 7.4 tampon ekleyin ve örneği gece boyunca dört derece Celsius sıcaklığında karanlıkta koyun. Tuz titrasyonu ile test renk yanıtını indüklemek için gereken ilk tuz konsantrasyonu, analiz blankı ile belirlenir. 96 kuyuyla bir plakada aptamer-altın klorür testinin 180 mikrolitrelik alikotlarına 20 mikrolitre metanol ekleyin.

Bu testlerin performansında kritik bir adım, hedef eklendikten sonra altın nanopartikülleri dengesizleştirecek sodyum klorür konsantrasyonunu belirlemektir. Örnekleri artan hacimde stok sodyum klorür çözeltisi ile titrleyin ve eşdeğerlik noktasını belirleyin. Burada, en ufak renk değişikliğine neden olacak sodyum klorür hacmini görsel gözlemle belirleyin.

Test yanıtını optimize ederek, oda sıcaklığında 96 kuyu bir plakada 180 mikrolitrelik aptamer-altın nanopartikül testine metanolde seyreltilmiş 20 mikrolitre analit molekülü ekleyin. Hemen, önceki adımda belirlenen sodyum klorür konsantrasyonunu ekleyerek analiz renk yanıtını başlatın. Sodyum klorür konsantrasyonunu artırarak veya azaltarak ve hedef yanıtı boş yanıtla karşılaştırarak mümkün olan en büyük renk değişimini elde edin.

En büyük yanıt farkını sağlayan sodyum klorür konsantrasyonunu kullanın. Sodyum klorür eklendikten 150 saniye sonra test yanıtını gözlemleyin veya ölçün. 650 nanometre ve 530 nanometre soğurgunculukları spektrofotometre kullanarak analiz edin.

Sonuçları, 650 nanometre ve 530 nanometrede elde edilen absorbans oranı olarak analit konsantrasyonuna bağlı olarak çizin. Boş sinyale test tepkisini normalleştirin. Videoda daha önce anlatıldığı gibi aptamer-altın nanopartikül analiz bileşenlerini hazırlayın.

Nükleazsız suda mililitre başına bir gram trehaloz ve mililitre başına bir gram sukroz içeren ayrı çözeltiler yaparak kriogen çözeltisi oluşturulur. Bu testlerin dondurulmasında kritik bir adım, örneklere ne kadar trehaloz ve sukroz çözeltisi ekleyeceğini, böylece tam ve hatta dondurulmasını sağlamaktır. Mililitrede 19,2 miligram trehaloz ve mililitrede 4,8 miligram sukroz içeren bir çözelti yapın; 60 MN4 DNA ile altın başına nanopartikül testi ile son hacmde 200 mikrolitre 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüplerinde bulunun.

Son kriyojen çözeltisi konsantrasyonları DNA kapsamına göre değişir. Örnekleri 146 derece Santi-celsius dondurucu veya sıvı azotla ani dondurun. Örnekleri dondurarak kullanılana kadar sakla.

Bu iş için örnekleri gece boyunca 146 derece soğutulmuş dondurucuda bırakın ve ardından uzun süreli depolama için 20 derece Celsius dondurucuya aktarın. Burada, işlenmemiş ve DNA aptameri ile işlenmiş altın nanopartiküller için sodyum klorür titrasyon eğrilerinin temsil edici sonuçları gösterilmiştir. Testte kullanılan başlangıçta sodyum klorür konsantrasyonu titrasyon ile belirlendi.

Kokain ve kontrol molekülleri için aptamer-altın nanopartikül kolorimetrik testin temsil eden sonuçları burada gösterilmiştir. Grafikler, DNA kapsama yoğunluğunu artırmanın kokain testinin yanlış pozitif yanıt oranı üzerindeki etkisini ortaya koymaktadır. Burada, kokain kolorimetrik testinin fotogörüntü analizinden elde edilen kalibrasyon eğrisi grafikleri gösterilmiştir.

Akıllı telefonlarla elde edilen fotoğraflar. Aptamer-altın nanopartikül kolorimetrik testin kokain ve kontrol moleküllerine yönelik test yanıtının temsilci sonuçları burada sunulmaktadır. Veriler, taze hazırlanmış örnekleri dört haftaya kadar dondurulmuş şekilde saklanan örneklerle karşılaştırır.

Bu işlemi denerken, altın nanopartikülleri dengesizleştirmek ve hedef eklendiğinde tipik renk değişimini teşvik etmek için doğru sodyum klorür konsantrasyonunun belirlenmesi çok önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, ilgi çekici hedeflerin tespiti için altın nanoparçacık aptamer kolorimetrik testlerin nasıl geliştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Burada belirtilen yaklaşımları kullanarak yanlış pozitif yanıt oranlarını azaltabilir ve testlerinizi bir aydan fazla süreyle geçerli tutabilirsiniz.