Name: PGR-Mavi Plasmitlerinin ve Golden Gate Meclis kullanma Terminatör Hızlı Doğrulama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Keşfedin Golden Gate Assembly kullanarak biyo-bilgisayar yöntemleriyle belirlenen terminatörlerin hızlı doğrulamasını. Bu yöntem, sentetik biyoloji araştırmalarında gen ifadesi düzenlemesini hızlandırır ve verimliliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Genomik ve Evrimsel Bilim ilerlemek faj Avcılar (SEA-fajlar) Programın - Yazarlar Aktif Öğretim Genom Konsorsiyumu (GCAT) ve HHMI-Fen Eğitimi İttifak ile Malcom Campbell ve Todd Eckdahl kabul etmek istiyorum. Bu proje Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi (P20RR016460) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (P20GM103429) hibe tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma hibe # IIA-1457888 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından kısmen desteklenmiştir. Ayrıca kurumsal (Ouachita Baptist Üniversitesi) fonları JD Patterson Yaz Araştırma Bursu ile sağlandı.

1. Tasarımı ve Uygun Sticky saplı Sipariş oligonükleotidler <ol><li> Serbestçe kullanılabilir çevrimiçi programları kullanarak genomik analiz yoluyla potansiyel rho-bağımsız sonlandırıcılar tanımlayın. 7 </li><li> Iki iplikçikli DNA ile çalışırken, sonlandırıcı yönü, test edilecek belirler. 7 PGR-Mavi plazmid, sadece en (ileri şerit) yön 3 &#39;5&#39; lige sonlandırıcılar doğrular. <ol><li> , Ücretsiz online yazılım kullanarak PGR-Blue test için APE, örneğin dizisi yeniden yönlendirmek için onun tersine tamamlayıcı bir alt (ters) iplik terminatör dönüştürün. </li></ol></li><li> oryantasyon doğru olduğu belirlendikten sonra, üst telin sonuna 5 &#39;yapışkan sonu &quot;5&#39;-CGAC-3&quot;&#39; ekleyin. . Alt şeridinin sonuna 5 &#39;yapışkan sonu &quot;5&#39;-CCGC-3&quot;&#39; Ekle 8 Bu o bağlanan insert uygun olarak eklenecektir sağlayacaktıryönlendirme GGA kullanılmıştır. </li><li> dizileri belirlendikten sonra, ticari tek iplikli oligonükleotidler olarak sipariş. </li></ol> 2. Tavlama Oligonükleotidler (Dondurularak kurutulmuş DNA Sadece geçerlidir) <ol><li> 100 uM bir konsantrasyona nükleaz içermeyen su içinde Tek tek oligonükleotidler yeniden askıya. </li><li> 1 M NaCl ve 100 mM Tris-HCI pH 7.4: 10 x dupleksleştirme tamponu sağlayın. Tavlama tamponu birkaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. Dupleksleştirme tamponu yapılır ve oligonükleotidler yeniden süspanse edildikten sonra, tavlama 8 başlar. </li><li> Her terminatör test edilecek, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne ultra saf su 16 ul ekleyin. </li><li> Her mikrosantrifüj tüpüne 10x tavlama tampon 2 ul ekleyin. </li><li> İstenilen terminatör gelen üst iplik oligonükleotid 1 ul (100 uM) ekleyin. </li><li> İstenen terminatör arasında alt iplik oligonükleotid 1 ul (100 uM) ekleyin. </li><li> kaynar su ba oluşturunsıcak bir plaka üzerinde musluk suyu ve yerin yaklaşık 400 ml içeren bir 1000 ml&#39;lik beher kullanarak inci. </li><li> float adım 2.6 mikrosantrifüj tüpleri yerleştirin ve 4 dakika boyunca kaynatın. 4 dakika sonra, ısı plakası rahatsız edecek, ancak boru ayrılıp su banyosunda yavaş yavaş soğumaya O / N (18 saat) 8 yüzer. -20 ° C&#39;de tavlanmış terminatörleri saklayın. </li></ol> 3. Golden Gate Meclisi (Standart Mix - Maliyet Etkin) <ol><li> tavlı terminatör 40 nM seyreltme yapın. tavlanmış sonlandırıcılar karışımı (100 mM) 1 ul nükleaz ücretsiz su 124 ul ekleyin. <ol><li> buz üzerinde 30 10,000 xg&#39;de sn ve mağaza için santrifüj örnekleri. </li></ol></li><li> PCR için yeni bir tüp uygun kullanılan içine, nükleaz içermeyen su 6 ul ekleyin. </li><li> 1 Ticari DNA ligaz tamponu ul [300 mM Tris-HCI (pH 7.7-7.8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, ve 10 mM ATP] ekleyin. Buz üzerinde sonraki tüm adımları uygulayın. </li><li> eklemekPGR-Blue (35-50 ng / | il) mikrosantrifüj tüpüne, hedef plazmid 1 ul. </li><li> mikrosantrifüj tüpüne 40 nM tavlanmış sonlandırıcılar 1 ul ekle. </li><li> mikrosantrifüj tüpüne 0.5 ul ticari yüksek sadakat Bsal restriksiyon endonükleaz ekleyin. </li><li> mikrosantrifüj tüpüne ticari DNA ligazı 0.5 ul ekle. </li><li> 120 saniye boyunca 10,000 x g&#39;de Reaksiyon karışımı santrifüjleyin. Sonra termalcycler doğrudan tüp yerleştirin. </li><li> 37 ° C&#39;de 15 dakika 1 döngü, ardından 16 ° C&#39;de 1 dakika, ardından 37 ° C&#39;de 1 dakika 20 döngü: PCR programı çalıştırın. Numunelerde hemen veya -20 ° C&#39;de dondurularak saklayın. 8 </li></ol> 4. Golden Gate Meclisi (Ticari Master Mix - Zaman Verimli) <ol><li> Bu 40 nM terminatör DNA konsantrasyonu sulandırır 2. adımda oluşturduğunuz sonlandırıcılar tavlı 100 mcM 1 ul nükleaz ücretsiz su 124 ul ekleyin.Yeni bu adımı gerçekleştirin, 1,5 ml&#39;lik ependorf tüp etiketli. </li><li> PCR için yeni bir tüp uygun içine, nükleaz serbest su 14 ul ekleyin. Yeni tüp buna göre etiketlenmiş olduğundan emin olun. </li><li> mikrosantrifüj tüpüne Ticari Master Mix Tampon 2 ul ekleyin. </li><li> mikrosantrifüj tüpüne PGR-Mavi plazmid 1 ul (35-50 ng / | il) ilave. </li><li> mikrosantrifüj tüpüne 40 nM tavlanmış sonlandırıcılar 2 ul ekle. </li><li> mikrosantrifüj tüpüne Ticari Master Mix 1 ul ekleyin. </li><li> 120 saniye boyunca 10,000 x g&#39;de 40 nM tüp santrifüjleyin. Sonra termalcycler doğrudan tüp yerleştirin. </li><li> 55 ° C&#39;de 15 dakika 1 döngü, ardından 37 ° C&#39;de 60 dakika 1 döngü: PCR programı çalıştırın. Kullanım örnekleri -20 ° C &#39;de hemen veya dondurulması ve depolanması. </li></ol> 5. Dönüşüm ve Koloni Seçimi <ol><li> Hazırlayın 1 mM concentrat içeren Petri kapları ağar Luria Bankası (LB)ampisilin iyonu (Amp) ve arabinoz (ARB) içindeki bir 10 mM konsantrasyonu. Bu stok çözeltisi, daha sonraki kademelerde kullanım çünkü 1M L -arabinose stok çözeltisi en az 10 ml hazırlayın. </li><li> Herhangi bir yüksek verimli kullanın (10 Ağustos - 10 Eylül transformant / mikrogram) kimyasal yetkili E. transformasyon için E. coli (JM109) hücreleri. En iyi sonuçlar için 9 yetkin hücre 50 ul ligasyon reaksiyonunun 3-5 ul ekle. Kimyasal yetkili hücreleri kullanırken, hücreler kullanılıyor özel dönüşüm protokolü uygulayın. </li><li> steril L-şekilli &quot;hokey sopası&quot; kullanılarak agar plakaları önceden ısıtılmış LB (Amp / ARB) üzerinde dönüştürülmüş hücrelerin yarısı (25 ul) yayıldı ve 37 ° C &#39;de O / N inkübe edin. Nedeniyle ayrışma ampisilin hızlı oranına, 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe yoktur. </li><li> görsel muayene ile renk dayalı koloni seçimi yapın. Başarılı bir ligasyonu / beyaz görünür ışıkta sarı olması ve unde yeşil floresan gerekirr mavi (450 nm) veya UV ışığı. 20 saat - Başarısız bir ligasyon 18 sonra görünür ışık altında mavi renkli bir koloni üretecek. </li></ol> 6. Doğrulama ve Terminator sayısallaştırılması <ol><li> 1 mM ampisilin ve arabinoz 10 mM 5 ml steril LB-suyu tüpleri hazırlayın. gerekli tüp sayısı, test edilen terminatörler ve kontrol ünitesinin (hücreler ampisilin direnci ile floresan değildir ve kesilmemiş PGR-Mavi plazmidi içeren hücreler) sayısına bağlıdır. </li><li> Görünür ışık altında steril bir döngü kullanarak 2-3 / beyaz sarı koloniler (adım 5.4) seçin. Numuneler 37 ° C ve 16-18 saat süre ile 160 rpm&#39;de bir çalkalama sıvılarında inkübe izin verin. fazla 24 saat süreyle bu örnekleri inkübe etmeyin. <ol><li> İsteğe bağlı olarak, yeterli hücre büyümesinin sağlanması için, 600 nm (OD 600) de optik hücre yoğunluğu belirlemek için bir spektrofotometre kullanmak. Genel olarak, 0.8-1.0 ~ bir OD 600 büyüme 16-18 saat sonra gözlenmiştir. </li></ol></li><li> kullanımsonraki adımlar için steril 96 oyuklu plaka. aseptik bir ortamda ve üç kopya halinde aşağıdaki adımları yürütün. her oyuğa steril LB + Amp / arabinoz suyu (1 mM ampisilin / 10 mM arabinoz) 199 ul ekleyin. üç ayrı kontroller için plaka üzerinde odası bulunmaktadır. <ol><li> Aşağıdaki üç kontrollerini kullanın: İyi (1) içeren LB + Amp / arabinoz suyu sadece ve iyi (2) (boş) dönüştürülmemiş kompetan hücreler boş olarak hizmet etmek için. ölçümü (3) sonlandırıcı gücü olmayan bir sonlandırma dizisi ile lige kesilmemiş ilk PGR ya içeren PGR-mavisi içeren hücreler (ölçümü için bir referans kontrol) dahil edilmelidir. Plaka okuyucu düzeni için Şekil 1&#39;e bakınız. </li></ol></li><li> Pipet O hücre çözeltisi 1 ul / 96 oyuklu plakanın bireysel çukurlar halinde K et suları. </li><li> Bir nefes kapaklı mühür plakaları ve 37 ° C&#39;de 18-20 saat ve 160 rpm çalkalayın. </li><li> Bir levha okuyucu ile okuyarak OD 600 belirler600 nm&#39;de absorbans. Aşağıdaki gibi GFP floresan ölçün: uyarma 395 ve emisyon 509. Önlem RFP floresan şöyle: uyarma 575 ve emisyon 605. 18-20 saat sonra OD 600 yaklaşık 0,5 olmalıdır. </li><li> büyüme varyasyon normalleştirmek için, denklem kullanmak: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq1.jpg" /> GFP ve RFP hem. </li><li> normalleşme sonra, denklem kullanılarak göreceli terminatör gücünü belirlemek <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq2.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Li, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+promoter+sequence+and+its+strength+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+E+Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GreenGate---a+novel%2C+versatile%2C+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043(2013).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+biology+undergraduate+education%2C+a+call+for+action--initial+responses%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses.</a> CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).</li>
<li>Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+the+biology+community%3A+snapshots+of+change%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in the biology community: snapshots of change.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).</li>
<li>Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARNold%3A+a+web+tool+for+the+prediction+of+Rho-independent+transcription+terminators%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators.</a> RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).</li>
<li>Campbell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pClone%3A+Synthetic+Biology+Tool+Makes+Promoter+Research+Accessible+to+Beginning+Biology+Students%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).</li>
<li>Rhee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+medium+composition+and+plasmid+combination+on+the+growth+of+recombinant+Escherichia+coli+JM109+and+on+the+production+of+the+fusion+protein+EcoRI%3A%3ASPA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA.</a> J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).</li>
<li>Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+mutations+in+the+Escherichia+coli+AraC+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein.</a> J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).</li>
<li>Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+L-arabinose+operon+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli.</a> Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).</li>
<li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composability+of+regulatory+sequences+controlling+transcription+and+translation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).</li>
<li>Sharon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+gene+regulatory+logic+from+high-throughput+measurements+of+thousands+of+systematically+designed+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters.</a> Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokolde en önemli adım sıralamaya uygun oligonükleotid tasarımı önceliklidir. oligonükleotitler, uygun yapışkan uçları GGA bütünleşik hale getirilmesi olası olduğundan emin olmak için, üst ve alt iplikler hem de 5 &#39;uçlarına eklenen olmalıdır. Ayrıca, bakan sağ olduğu soldan bakan sonlandırıcılar (alt iplikçikteki transkripsiyonu durdurmak sonlandırıcılar) yönünü değiştirmek için önemli olan GFP ve RFP ifade bakan sağ olduğundan (üst ipliği sonlandırıcı (üst iplikçikteki transkripsiyonu sonlandırır) ) yönünde. ...

Büyük sentetik biyoloji projeleri, gen ekspresyonunu düzenlemeye yardımcı olmak için oldukça etkili transkripsiyon sonlandırıcılarının kullanılmasını gerektirir. Yeni sonlandırıcıların tanımlanması, yeni genomların biyoinformatik analizini gerektirir. Bununla birlikte, her biri tahmin için kullanılan benzersiz bir algoritmaya sahip artan miktarda biyoinformatik yazılım geliştirildikçe, varsayılan sonuçlar arasında daha fazla tutarsızlık ortaya çıkmaktadır. Bu süreç biraz öznel olduğundan ve in silico olarak yapıldığından, bu tahminlerin biyolojik olarak doğrulanması gerekir. 1 Ek olarak, in-silico analiz yoluyla tanımlanan varsayılan sonlandırıcıların hacmi, nispeten kısa bir zaman diliminde tamamlanabilen klonlama stratejilerinin kullanılmasını gerektirir. 
PGR-Blue plazmid, tüm reaksiyon adımlarının tek bir mikro-santrifüj tüpünde aynı anda gerçekleştirilmesine izin vererek klonlama prosedürünü basitleştirmek için Golden Gate Assembly (GGA) kullanmak üzere yeniden tasarlanmış PGR plazmidinin bir modifikasyonudur. 2,3 Pozitif kolonileri tanımlama kolaylığını artırmak için renk seçimi plazmide dahil edildi. Başarılı bir ligasyon, arabinoz içeren plakalar üzerinde büyütüldüğünde görünür ışıkta beyaz/sarı ve mavi (450 nm) veya ultraviyole (UV) ışık altında floresan yeşil olmalıdır. Kesilmemiş pGR-mavisi bir mavi kromo proteini (amilCP) içerdiğinden, değiştirilmemiş bir plazmit içeren koloniler görünür ışık altında mavidir. Bu basitleştirme, kolaylaştırılmış protokolle birlikte, araştırmacıların biyoinformatik tanımlamadan biyolojik doğrulamaya üç ila dört gün içinde geçmelerini sağlar. Bu sistemin tasarım doğası hem araştırma laboratuvarında hem de eğitim ortamlarında faydalı olabilir.
pGR-Mavi plazmid, sonlandırıcı kuvvetin nicelleştirilmesine izin verir. 4 Yeşil floresan proteini (GFP) ve kırmızı floresan proteini (RFP) üretmek için tek bir arabinoz ile indüklenebilir promotör kullanılır. Sonlandırıcı, GFP dizisinden sonra, ancak RFP dizisinden önce plazmide klonlanır, böylece RFP proteininin transkripsiyonu durdurulur. Sonlandırıcının gücü, üretilen GFP'nin üretilen RFP'ye oranı ile belirlenir. 
Vizyon ve Değişim5 raporu, Bilim, Teknoloji, Mühendislik ve Matematik (STEM) eğitiminin araştırmaya dayalı deneyimleri sınıfa dahil etmesini önerdi. 6 Ancak bu, belirli bir zaman dilimi içinde sınırlı becerilere sahip öğrenciler tarafından yapılabilecek protokollerin geliştirilmesini gerektirir. Protokol üç gün gibi kısa bir sürede tamamlanabilirken, aynı zamanda bir Kurs Araştırma Deneyimi (CRE) oluşturmak için her önemli adımın ayrı bir haftalık (2-3 saat) laboratuvar döneminde gerçekleştirilebileceği şekilde tasarlanmıştır. Bu şekilde kullanıldığında, prosedür üç ila altı hafta sürecektir ve Genetik, Hücre Biyolojisi veya Biyoinformatik alanlarında hem giriş hem de ileri düzey kurslar için uygundur.

<table><tbody><tr><td>pGR-Mavi Plazmid</td><td>Addgene</td><td>68374</td><td></td></tr><tr><td>pGR-Plazmid</td><td>Addgene</td><td>46002</td><td></td></tr><tr><td>AeraSeal-(Steril Levhalar)</td><td>Excel Scientific</td><td>BS-25</td><td>Yalnızca Steril Levhalar</td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligaz Tamponu</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td>HF olmayan enzim işe yarar ancak ısıya daha az kararlıdır.</td></tr><tr><td>NEB Golden Gate Montaj Karışımı</td><td>NEB</td><td>E1600S</td><td>Commerial Master Mix protokolde atıfta bulunulmuştur.</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak Mikrosantrifüj Yüzer Raf</td><td>Nova Tech International</td><td>F18875-6401</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Arabinoz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-3256</td><td>D-Arabinoz, pBAD promotörünü indüklemez</td></tr><tr><td>Luria Base (LB) - Et suyu, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1900</td><td></td></tr><tr><td>Luria Tabanı (LB) - Ağar, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2025</td><td></td></tr><tr><td>Tecan-Infinite M200 Plaka Okuyucu</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix & Yetkili Hücrelere Git - Suş JM109</td><td>Zymo Research</td><td>T3005</td><td>Şirket tarafından önerilen dönüşüm protokolü</td></tr><tr><td>ApE'yi kullanın: Bir plazmid editör yazılımı</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tris-HCl, Moleküler Sınıf</td><td>Promega</td><td>H5121</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (Kristal/Biyolojik, Sertifikalı)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S671</td><td></td></tr><tr><td>Ticari Oligonükleotid sentezi</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (IDT)</td><td></td><td>http://www.idtdna.com/site</td></tr><tr><td>Mikrotest Doku Kültürü Plakaları - 96 kuyulu (Steril)</td><td>Falcon</td><td>35-3072</td><td></td></tr><tr><td>mikobakteriyofaj "Bernal13"</td><td>Gen Bankası</td><td>KJ510413</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz Serbest Su</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (IDT)</td><td>IDT004</td><td></td></tr><tr><td>Steril, L-şekilli Hokey-Stick Hücre</td><td>Yaşam Bilimleri Ürünleri</td><td>6444-S1</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Damla 2000c UV-Vis Spektrometresi</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>ARNold: Rho'dan bağımsız transkripsiyon sonlandırıcılarının tahmini için bir web aracı.</td><td></td><td></td><td></td>http://rna.igmors.u-psud.fr/</tr></tbody></table>

pgr-mavi plasmitlerinin ve golden gate meclis kullanma terminatör hızlı doğrulama

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

Bu protokolün amacı, biyoinformatik olarak tanımlanmış sonlandırıcıların hızlı bir şekilde doğrulanmasına izin vermektir. Ayrıca, plazmit (pGR-Blue) bu protokol için özel olarak tasarlanmıştır ve sonlandırıcı verimliliğinin ölçülmesine izin verir. Kavramın bir kanıtı olarak, mikobakteriyofaj Bernal'de altı sonlandırıcı biyoinformatik olarak tanımlandı13. Tanımlandıktan sonra, sonlandırıcılar daha sonra uygun yapışkan uçlara sahip oligonükleotidler olarak yapıldı ve birlikte tavlandı. Golden Gate Assembly (GGA) kullanılarak, sonlandırıcılar daha sonra pGR-Blue'ya klonlandı. Görünür ışık altında, yalancı pozitif koloniler mavi görünür ve pozitife dönüşmüş koloniler beyaz/sarıdır. Arabinoz ile indüklenebilir bir promotörün (pBad) indüksiyonundan sonra, üretilen yeşil floresan proteininin (GFP) üretilen kırmızı floresan proteinine (RFP) oranı ölçülerek koloni gücü belirlenebilir. pGR-Blue ile protokol üç gün gibi kısa bir sürede tamamlanabilir ve bir eğitim ortamı için idealdir. Ek olarak, sonuçlar, bu protokolün, transkripsiyonun düzenlenmesi ile ilgili sonlandırıcı verimliliğinin in silico tahminlerini anlamak için bir araç olarak yararlı olduğunu göstermektedir.

Bu protokol, Golden Gate Meclisi (Şekil 2) kullanılarak GFP ve RFP arasında bağlandı bir sonlandırıcı ile PGR-Mavi içeren hücreleri üretecek. lige inserti ihtiva eden pozitif koloniler rengine göre seçilebilir. Görünür ışık pozitif koloniler / beyaz sarı olacaktır ve yanlış pozitif 37 ° C (Şekil 3) inkübasyon 18-20 saat sonra mavi koloniler üretecektir. Koloni seçiminden sonra, bir plaka okuyu...

Bu protokol, in silico bulunan sonlandırıcıların gücünü hızlı bir şekilde ölçmek için Golden Gate Assembly ve plazmid pGR-blue'yu kullanır.

PGR-Mavi Plasmitlerinin ve Golden Gate Meclis kullanma Terminatör Hızlı Doğrulama

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

Sentez biyolojisi protokolünün genel amacı, golden gate montajının kullanıldığı bir in-vitro sistemdele terminatör işlevselliğini hızla belirlemek ve terminatör gücünü nicelleştirmektir. Bu protokol, biyoinformatik yöntemlerle in silico olarak bulduğumuz terminatörleri biyolojik bir ortamda test etmek için kullanılır. Bu yöntem, biyoinformatik olarak tanımlanan terminatörlerin laboratuvar ortamında hızlı ve basit bir şekilde doğrulanmasına olanak tanır.Bu protokolün temel avantajı hızıdır. Biyoenformatik tanımlamadan biyolojik doğrulamaya bir haftadan kısa sürede geçebiliriz. Bunu yaparken, bir terminatörün gerçekten bir terminatör olduğunu doğrulayabilir ve terminasyon gücünü nicel olarak belirleyebiliriz.Genel olarak, kısıtlama enziminin ligaz ile aynı tüpe eklenmesi sezgilere aykırı geldiği için kişiler başlangıçta bu teknikte zorlanabilirler. Ancak, tip 2S kısıtlama endonükleazları kullanıyoruz ve enzimin tanıma bölgesi gerçek kesim bölgesinden ayrıdır. Terminatör pGR blue plazmidine ligandıktan sonra, bu kalıcı bir ligasyon olur.Ancak, restriksiyon enzimini ve ligazı aynı tüpte bulundurup birden fazla döngüden geçirerek yüksek bir klonlama verimliliği elde edebiliriz. Bu prosedüre, münferit oligonükleotidleri nükleaz içermeyen suda 100 µM konsantrasyonda yeniden süspande ederek başlayın, ardından 10x tavlama tamponu hazırlayın. Sonra, test edilecek her bir terminatör için 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpü etiketleyin.Her tüpe 16 µL ultra saf su, 2 µL 10x tavlama tamponu ve istenen terminatörlerin üst ve alt zincir oligonükleotidlerinden birer 1 µL ekleyin. Sipariş ettiğiniz oligonükleotidlerin doğru yapışkan uçlara sahip olduğundan emin olmanız çok önemlidir. Çünkü bunlar birbirine tavlandığında, terminatörün doğru oryantasyonda olduğundan emin olmak kritik önem taşır.Eğer terminatör yanlış yönde yerleştirilmişse, pGR blue onun işlevsel bir terminatör olup olmadığını doğrulayamayacaktır. Ardından, mikrosantrifüj tüplerini bir yüzerle yerleştirin ve bir su banyosunda dört dakika boyunca kaynatın. Dört dakika sonra ısıtıcı plakayı kapatın ancak tüpü yavaşça soğuması için gece boyunca suyun içinde bırakın.Tavlanmış terminatörleri 20 °C'de saklayın. Tavlanmış terminatörlerin 40 nM dilüsyonunu hazırlamak için öncelikle onları buz üzerinde çözdürün, ardından yeni bir 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne 1 µL tavlanmış terminatör ile 124 µL nükleaz içermeyen su ekleyin. Numuneleri 10.000x g'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin.Santrifüjden sonra örnekleri buz üzerinde saklayın. Termosiklatöre uygun yeni bir tüpe 6 µL nükleaz içermeyen su ekleyin. Ardından bir µL ticari DNA ligaz tamponu ekleyin.Sonraki tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin. Ardından, mikrolitre başına 35 ila 50 nanogram pGR blue hedef plazmidi içeren 1 µL, 40 nM tavlanmış terminatörlerden 1 µL, ticari yüksek sadakatli BSA1 restriksiyon endonükleazından 0,5 µL ve ticari DNA ligazından 0,5 µL ekleyin. Reaksiyon karışımını 10.000x g'de 120 saniye boyunca santrifüjleyin.Ardından tüpü doğrudan termosikletöre yerleştirin ve şu programı çalıştırın: 37 °C'de 1 dakika ve ardından 16 °C'de 1 dakikadan oluşan 20 döngü ve sonrasında 37 °C'de 15 dakikalık bir döngü. Çalışma tamamlandıktan sonra örnekleri ya -20 °C'de dondurup saklayın ya da hemen transformasyon aşamasına geçin.Ligasyon reaksiyonlarını, uygun herhangi bir transformasyon protokolü kullanarak kimyasal olarak kompetan e. coli hücrelerine transforme edin. Burada, JM109 hücreleri zippy transformasyon yöntemiyle transforme edilmektedir.L şeklinde cam bir hokey sopası kullanarak, transforme edilmiş hücrelerin 25 µL'sini 1 mM ampicillin ve 10 mM arabinose içeren ön ısıtmalı LB agar plaklarına yayın. Plakları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. 24 saatten fazla inkübe etmeyin.Ampisilin hızla bozunur. Ertesi gün, kolonilerin rengini kontrol edin. Başarılı bir ligasyon, görünür ışık altında beyaz veya sarı renkli olmalı ve mavi veya UV ışığı altında yeşil floresan göstermelidir.Başarısız bir ligasyon, görünür ışık altında mavi renkli bir koloni oluşturacaktır. Her bir terminatör ve kontrol için, 1 millimolar ampicillin ve 10 millimolar arabinose içeren 5 mililitre steril LB broth içeren bir test tüpü hazırlayın. Bu protokolü uygularken, pGR ile uygun kontrollerin mevcut olduğundan emin olmak gerçekten önemlidir.İlk kontrol sadece LB besiyeri olmalıdır. Bir sonraki kontrol ise ampicilline dirençli olan ancak mavi ışık altında floresan yaymayan hücreler olmalıdır. Bunlar kör örnek olarak hizmet edecektir.Bir sonraki kontrol, kesilmediği için yerleşik bir terminatörü bulunmayan ve terminatör gücü için temel hat oluşturacak olan pGR plazmididir; tüplerinizin sonuncusu ise numuneniz içindir. Görünür ışık altında, 2 ila 3 beyaz veya sarı koloniyi seçmek için steril bir öze kullanın ve bunları LB besiyerine aktarın. Numunelerin bir çalkalayıcıda 37 °C'de, 160 rpm hızda 16 ila 18 saat boyunca inkübe edilmesini sağlayın.Ertesi gün, her bir örneğin 600 nanometredeki optik hücre yoğunluğunu belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. Genellikle, bu süre sonunda 0,8 ile 1,0 arasında bir OD 600 beklenir. Steril bir 96 kuyucuklu plakayı çekerceğe yerleştirin.Her bir örnek veya kontrol için, ampicillin ve arabinose içeren 199 µL steril LB besiyerli 3 kuyu hazırlayın. Ardından, gece boyunca inkübe edilen besiyerlerinden 1 µL hücre solüsyonunu 96 kuyucuklu plakanın ayrı kuyucuklarına pipetleyin. Plakaları hava geçirgen bir kapakla kapatın ve ardından 37 °C'de ve 160 rpm'de 18 ila 20 saat boyunca çalkalayın.Ertesi gün, yaklaşık 0,5 olması gereken OD 600 değerini belirlemek için bir plaka okuyucu kullanın. Ayrıca, 395 nanometre eksitasyon dalga boyunda ve 509 nanometre emisyonda GFP floresanını ölçün. 575 nanometre eksitasyon dalga boyunda ve 605 nanometre emisyonda RFP floresanını ölçün.Excel kullanarak, floresansı OD 600 değerine bölerek büyümedeki varyasyon için normalizasyon yapın. Normalizasyondan sonra, GFP terminatör floresansının GFP kontrol floresansına oranını, RFP terminatör floresansının RFP kontrol floresansına oranına bölerek bağıl terminatör gücünü belirleyin. Microbacteria fajı bernal 13'te biyoinformatik olarak tanımlanan T1 ile T6 arasındaki varsayılan terminatörler, bu videoda açıklandığı şekilde analiz edilmiştir.Bu sonuçlar göreceli floresan değerlerini göstermektedir. Tüm sonuçlar, kontrol olarak kesilmemiş ve modifiye edilmemiş PGR içeren hücreler kullanılarak normalize edilmiştir. T3'ün güçlü bir terminatör olduğu belirlenmiştir.Tüm sonuçlar, üç paralel şeklinde büyütülen bireysel kolonileri temsil etmekte ve görsel sunum için ortalamaları alınmıştır. Hata çubukları, ortalama veri noktaları arasındaki sapmaları temsil etmektedir. Terminatör gücünü nicelleştirmek için en uygun referans kontrolü belirlemek amacıyla, terminatör içermeyen orijinal pGR plazmidi ile terminatör olmadığı bilinen bir dizinin klonlandığı pGR blue kullanılarak elde edilen ham veriler karşılaştırılmıştır.Burada görüldüğü üzere, her iki kontrol de benzer seviyelerde GFP ve RFP ekspresyonu göstermiş ve daha da önemlisi, benzer GFP/RFP oranları üretmiştir. Tüm bu sonuçlar, üç paralel şeklinde büyütülen ve görsel temsil için ortalaması alınan bireysel kolonileri temsil etmektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik sipariş ve nakliye süresi dahil olmak üzere toplamda sadece 72 saat sürebilir.pGR blue'nun yalnızca e.coli içinde çalıştığını belirtmek önemlidir. Ayrıca, terminatörün sadece küçük bir kısmını incelediğimiz için transkripsiyonu kontrol edebilecek diğer düzenleyici elementler hakkında herhangi bir bilgimiz yoktur. pGR blue kullanarak bu protokol ile elde ettiğiniz sonuçları doğrulamak için kantitatif PCR gibi ek yöntemler kullanılabilir.Ayrıca, pGR inserti kesilip çıkarılabilir ve seçtiğiniz bir plazmide ligasyonu yapılabilir.

rapid-verification-terminators-using-pgr-blue-plasmid-golden-gate

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Örneğin çinko parmak nükleazlara (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlara (TALENS) olarak tasarımcı nükleazlar homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ile homolog yeniden birleştirmeye (HR) yolaklar tetikleyerek fare preimplantasyon embriyoların genomunu değiştirmek için kullanılabilir. Bu gelişmeler kesin genetik değişiklikler farelerde hızlı üretimini sağlar.

Tasarımcı nükleazlar kullanılması Fare Genom Mühendisliği

Özel plazmitlerin sentezi emek ve zaman alıcıdır. Bu protokol, özel DNA klonlama prosedürünün işini ve süresini azaltmak için Gibson montaj klonlamasının kullanımını açıklar. Açıklanan protokol ayrıca, geleneksel kes ve yapıştır DNA klonlamasına benzer maliyetle memeli ekspresyonu için güvenilir etiketli protein yapıları üretir.

Plazmid vektörler oluşturulması Gibson tertibatı kullanılarak insan uzama faktör-1α bir promotörün regülasyonu altında FLAG-etiketli Proteinlerinin İfade

Bu protokol, plazmitlerden DNA ipliği yer değiştirme kapıları türetmek ve bunları floresan kinetik ölçümleri kullanarak test etmek için bir yöntemi açıklar. Gates, resmi kimyasal reaksiyon ağlarının (CRN) davranışını yaklaşık olarak tahmin etmek için modüler olarak çok bileşenli sistemlere birleştirilebilir ve bu da CRN'lerin moleküler bir programlama dili olarak yeni bir kullanımını gösterir.

Plazmid kökenli Uygulama Kimyasal Reaksiyon Ağları için DNA Strand Deplasman kapıları

Biz yüksek verimli sıralama kullanan proteinlerin kapsamlı tek site doyma mutagenezi kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirme için bir protokol mevcut. Daha da önemlisi, bu yaklaşım kütüphane inşaatı ve sıralama multipleks dik primer çiftleri kullanır. ampisilin klinik olarak anlamlı bir doz için seçilen TEM-1 β-laktamaz kullanılarak Örnek sonuçlar verilmiştir.

Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

Burada, plazmit konjugasyonunda yer alan bir geni nakavt etmek için bir protokol sunuyoruz ve ardından çiftleşme tahlilleri kullanarak yokluğunun etkisini analiz ediyoruz. Genin işlevi, delesyon veya nokta mutasyonları kullanılarak dizisinin belirli bir bölgesine daha fazla araştırılır.

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

Büyük ölçekli gRNA kitaplıkları oluşturmak için yöntemleri basit, verimli ve maliyet-etkin olmalıdır. Biz gRNA kütüphaneler hedef DNA Enzimatik sindirim üzerinde dayalı üretim için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu yöntem CORALINA (kapsamlı gRNA Kütüphane üretimi kontrollü nükleaz faaliyetleri ile) pahalı özel Oligonükleotid sentezi için bir alternatif sunuyor.

Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

Burada, i) CyanoGate modüler klonlama araç kiti kullanarak kendi kendini çoğaltan bir vektör monte etmek açıklayan bir protokol sokulması, ii) konjugasyon ile bir siyanobakteriyel konak içine vektör tanıtmak ve iii) transgenik siyanobakteri suşları karakterize bir plaka okuyucu veya akış sitometri.

CyanoGate Modüler Klonlama Araç Kiti Kullanılarak Konjugasyon ile Siyanobakterilerin Genetik Modifikasyonu

Gram-negatif bakterilerde doymak üzere transpozon mutant kütüphaneleri oluşturmak ve daha sonra yüksek işlemli sıralama için DNA amplicon kütüphanelerinin hazırlanmasını tanımlayan bir yöntem. Örnek olarak, biz ESKAPE patojen, Acinetobacter baumanniiodaklanmak , ama bu protokol Gram-negatif organizmaların geniş bir yelpazede için münasip olduğunu.

Yüksek İşlem Likör Sıralaması Için Gram-Negatif Bakterilerde Transposon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma

Bu protokolün amacı, Golden Gate klonlamaya dayalı modüler klonlama sistemini kullanarak çok genli yapıların montajı için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Ayrıca, deneyimlerimize göre en iyi montajı sağlamak için kritik adımlar hakkında önerilerde bulunmaktadır.

Modüler Altın Kapı Klonlama Kullanılarak Çok Genli Yapıların Hızlı Montajı

CRISPR-Cas sistemleri ve anti-CRISPR proteinleri, Saccharomyces cerevisiae'deki Boole kapılarının şemasına entegre edildi. Yeni küçük mantık devreleri iyi performans gösterdi ve hem dCas9 / dCas12a tabanlı transkripsiyon faktörlerinin hem de anti-CRISPR proteinlerinin özelliklerinin anlaşılmasını derinleştirdi.

CRISPR-Cas Sistemlerine ve Anti-CRISPR Proteinlerine Dayalı Gen Dijital Devreleri

Keşfedin Golden Gate Assembly kullanarak biyo-bilgisayar yöntemleriyle belirlenen terminatörlerin hızlı doğrulamasını. Bu yöntem, sentetik biyoloji araştırmalarında gen ifadesi düzenlemesini hızlandırır ve verimliliği artırır.

PGR-Mavi Plasmitlerinin ve Golden Gate Meclis kullanma Terminatör Hızlı Doğrulama

Daha fazla video keşfet