PGR-Mavi Plasmitlerinin ve Golden Gate Meclis kullanma Terminatör Hızlı Doğrulama

Sentetik biyoloji protokolünün genel amacı, altın kapı montajını kullanan bir in vitro sistemde sonlandırıcı işlevselliğini hızlı bir şekilde belirlemek ve sonlandırıcı gücünü ölçmektir. Bu protokol, bulduğumuz sonlandırıcıları biyo-informatik kullanarak in silico olarak test etmek ve biyolojik bir ortamda test etmek için kullanılır. Bu, biyo-informatik olarak tanımlanmış sonlandırıcıların bir laboratuvar tezgahı ortamında hızlı ve basit bir şekilde doğrulanmasına olanak tanır.

Bu protokolün en büyük avantajı hızıdır. Biyo-informatik tanımlamadan biyolojik doğrulamaya bir haftadan daha kısa bir sürede geçebiliriz. Ve bunu yaparken, bir terminatörün aslında bir terminatör olduğunu doğrulayabilir ve terminasyon gücünü ölçebiliriz.

Genel olarak, bireyler başlangıçta bu teknikle mücadele edeceklerdir, çünkü aynı tüpe bir ligaz ile kısıtlama enzimini eklemek mantıksız geliyor. Bununla birlikte, tip 2S kısıtlama endonükleazları kullanıyoruz ve enzim için tanıma bölgesi gerçek kesim bölgesinden ayrıdır. Sonlandırıcı pGR mavi plazmidine bağlandığında, bu kalıcı bir ligasyondur.

Bununla birlikte, restricton enzimi ve ligazın aynı tüpte bulunmasıyla, birden fazla döngüden geçerek, yüksek bir klonlama verimliliği elde edebiliriz. Bu prosedüre, tek tek oligonükleotidleri nükleaz içermeyen suda 100 mikromolar konsantrasyonda yeniden süspanse ederek başlayın, ardından 10x tavlama tamponu hazırlayın. Ardından, test edilecek her sonlandırıcı için 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünü etiketleyin.

Her tüpe 16 mikrolitre ultra saf su, 2 mikrolitre 10x tavlama tamponu ve istenen sonlandırıcılardan üst ve alt iplikçik oligonükleidlerinin her birine 1 mikro litre ekleyin. Sipariş ettiğiniz oligonükleidlerin doğru yapışkan uçlara sahip olduğundan emin olmak çok önemlidir. Çünkü bir kez birlikte tavlandıklarında, sonlandırıcının doğru yönde olduğundan emin olmak önemlidir.

Sonlandırıcı yanlış yöndeyse, pGR mavisi bunun çalışan bir sonlandırıcı olup olmadığını doğrulayamaz. Daha sonra mikro santrifüj tüplerini bir şamandıraya yerleştirin ve bir su banyosunda dört dakika kaynatın. Dört dakika sonra, ısı plakasını kapatın, ancak tüpü yavaşça soğuması için gece boyunca suda bırakın.

Tavlanmış sonlandırıcıları 20 santigrat derecede saklayın. Tavlanmış sonlandırıcıların 40 nanomolar seyreltmesini yapmak için, önce buz üzerinde çözdürün, daha sonra yeni bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünde, tavlanmış sonlandırıcıların 1 mikrolitresine 124 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Numuneleri 10.000x g'da 30 saniye

Döndürme işleminden sonra numuneleri buz üzerinde saklayın. Yeni bir termodöngüleyiciye uygun tüpe 6 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Daha sonra bir mikrolitre ticari DNA ligaz tamponu ekleyin.

Sonraki tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin. Daha sonra, pGR mavi hedef plazmidin mikrolitresi başına 35 ila 50 nanogram, 1 mikrolitre 40 nanomolar tavlanmış sonlandırıcı, 0.5 mikrolitre ticari yüksek kaliteli BSA1 kısıtlama endonükleazı ve 0.5 mikrolitre ticari DNA ligaz ekleyin. Reaksiyon karışımını 10.000x g'da 120 saniye santrifüjleyin.

Ardından tüpü doğrudan termocycler'a yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın. 37 santigrat derecede 1 dakikalık 20 döngü, ardından 16 santigrat derecede 1 dakika ve ardından 37 santigrat derecede 15 dakikalık bir döngü. Çalıştırmanın ardından, numuneleri dondurun ve 20 santigrat derecede saklayın veya hemen dönüşüme devam edin.

Herhangi bir uygun dönüşüm protokolünü kullanarak ligasyon reaksiyonlarını kimyasal olarak yetkin e. coli hücrelerine dönüştürün. Burada, JM109 hücreleri zippy dönüşümü kullanılarak dönüştürülür.

L şeklinde bir cam hokey sopası kullanarak, dönüştürülmüş hücrelerin 25 mikrolitresini 1 milimolar ampisilin ve 10 milimolar arabinoz içeren önceden ısıtılmış LB agar plakalarına yayın. Plakaları gece boyunca 37 derece Cantius'ta inkübe edin. Onları 24 saatten fazla kuluçkaya yatırmayın.

Ampisilin hızla bozulur. Ertesi gün kolonilerin rengini kontrol edin. Başarılı bir ligasyon görünür ışıkta beyaz veya sarı olmalıdır ve mavi veya UV ışığı altında yeşil renkte floresan olacaktır.

Başarısız bir ligasyon, görünür ışık altında mavi renkli bir koloni üretecektir. Sonlandırıcıların ve kontrollerin her biri için, 1 milimolar ampisilin ve 10 milimolar arabinoz içeren 5 mililitre steril LB suyu içeren bir test tüpü hazırlayın. Bu protokolü gerçekleştirirken, pGR ile uygun kontrollerin yerinde olduğundan emin olmak gerçekten önemlidir.

İlk kontrol sadece LB suyu olmalıdır. Bir sonraki kontrol, ampisilin'e dirençli olan ancak mavi ışık altında floresan olmayan hücreler olmalıdır. Bunlar boş olarak hizmet edecektir.

Bir sonraki kontrol, kesilmemiş bir pGR plazmididir, bu nedenle yerinde sonlandırıcı yoktur ve bu, sonlandırıcı gücü için temel olarak hizmet edecek ve tüplerinizin sonuncusu numuneniz için olacaktır. Görünür ışık altında, 2 ila 3 beyaz veya sarı koloni toplamak için steril bir halka kullanın ve bunları LB suyuna aktarın. Numunelerin 16 ila 18 saat boyunca 160 rpm'de 37 santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edilmesine izin verin.

Ertesi gün, her bir numunenin optik hücre yoğunluğunu 600 nanometrede belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. Genel olarak, bu süreden sonra, 0,8 ila 1,0 arasında bir OD 600 beklenir. Kaputun içine steril bir 96 kuyulu plaka yerleştirin.

Her numune veya kontrol için, ampisilin ve arabinoz içeren 199 mikrolitre steril LB suyu ile 3 kuyu hazırlayın. Daha sonra, gece boyunca et suyundan 1 mikrolitre hücre çözeltisini 96 oyuklu plakanın ayrı kuyucuklarına pipetleyin. Plakaları nefes alabilen bir kapakla doldurun ve ardından 37 santigrat derece ve 160 rpm'de 18 ila 20 saat çalkalayın.

Ertesi gün, yaklaşık 0,5 olması gereken OD 600'ü belirlemek için bir plaka okuyucu kullanın. Ayrıca, 395 nanometrelik bir uyarma dalga boyunda ve 509 nanometre emisyonda P floresansının G'sini ölçün. 575 nanometre uyarma dalga boyunda ve 605 nanometre emisyonunda RFP floresansını ölçün.

Excel'i kullanarak, çiçeklenmeyi OD 600'e bölerek büyümedeki değişimi normalleştirin. Normalleştirmeden sonra, GFP kontrol floresansı üzerinden GFP sonlandırıcı floresansını alarak ve bunu RFP kontrol floresansı üzerindeki RFP sonlandırıcı floresansına bölerek göreceli sonlandırıcı gücünü belirleyin. Mikrobakteriler faj bernal 13'te biyo-informatik olarak tanımlanan T1'den 6'ya kadar olan varsayılan sonlandırıcıları düzeltin, bu videoda anlatıldığı gibi analiz edildi.

Bu sonuçlar nispi floresan göstermektedir. Tüm sonuçlar, kontrol olarak kesilmemiş, değiştirilmemiş PGR içeren hücreler kullanılarak normalize edildi. T3'ün güçlü bir sonlandırıcı olduğu bulundu.

Tüm sonuçlar, üç nüsha halinde yetiştirilen ve görsel temsil için ortalaması alınan bireysel kolonileri temsil eder. Hata çubukları, ortalaması alınan veri noktaları arasındaki sapmaları temsil eder. Terminatör gücünü ölçmek için en iyi referans kontrolünü belirlemek için, terminatör içermeyen orijinal pGR plazmidi ve terminatör olmadığı bilinen bir dizi ile klonlanmış pGR mavisi kullanılarak ham veriler karşılaştırıldı.

Burada görülebileceği gibi, her iki kontrol de benzer seviyelerde GFP ve RFP ekspresyonu gösterdi ve daha da önemlisi, benzer GFP / RFP oranları üretti. Bu sonuçların tümü, üç nüsha halinde yetiştirilen ve görsel temsil için ortalaması alınan bireysel kolonileri temsil eder. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik nakliye ve sipariş süresi dahil olmak üzere 72 saat kadar kısa sürebilir.

pGR mavisinin yalnızca e.coli'de çalıştığına dikkat etmek önemlidir. Ek olarak, sonlandırıcının yalnızca küçük bir parçasına baktığımız için, transkripsiyonu kontrol edebilecek diğer düzenleyici unsurlar hakkında gerçekten hiçbir fikrimiz yok. pGR blue kullanarak bu protokolle elde ettiğiniz sonuçları doğrulamak için kantitatif PCR gibi ek yöntemler kullanılabilir.

Ek olarak, pGR eki kesilebilir ve seçtiğiniz bir plazmide bağlanabilir.