Gerçek zamanlı PCR ile Kıyı tortulları ve Niceleme 16S rRNA Genler ve Transkriptler eşzamanlı DNA-RNA Ekstraksiyon

Bu prosedürün genel amacı, kıyı deniz çökeltilerinden yüksek verimli ve kaliteli DNA ve RNA'yı çıkarmak ve ardından 16S ribozomal RNA genlerini ve transkriptlerini ölçmektir. Deniz çökeltilerinden DNA ve RNA ekstraksiyonunu ve ardından kantitatif PCR'yi tanımlayan bu yöntem, çevredeki mikrobiyal bolluk ve çeşitliliğin moleküler analizinde önemli bir adımdır. Bu tekniğin ana avantajı, aynı numuneden DNA ve RNA'yı birlikte çıkarmak için kullanılabilmesidir ve bu daha sonra kantitatif PCR gibi aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Prosedürü göstermek için NUI Galway'den Dr.Enrico Tatti ve Essex Üniversitesi'nden doktora öğrencisi Duncan Sweeney olacak. RNA içermeyen malzemeler hazırladıktan ve metin protokolüne göre kıyı tortusu örneklerini topladıktan sonra kıyı tortusundan DNA ve RNA'yı birlikte çıkarmak için, 0.5 gram tortuyu iki mililitrelik bir boncuk parçalama tüpüne aktarın. Tüpe 500 mikrolitre CTAB fosfat tamponu ve 500 mikrolitre fenol: kloroform: izoamil alkol ekleyin ve numuneyi homojenize etmek için beş ila 10 kez ters çevirin.

16.000 kez g ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede dönmeden önce 2,5 dakika tam hızda girdap. Daha sonra, bir çeker ocakta, üst sulu tabakayı çıkarın ve yeni bir steril 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, numuneleri buzun üzerine yerleştirin ve 500 mikrolitre buz gibi kloroform: izoamil alkol ekleyin.

Ardından, bir emülsiyon görünene kadar tüpü birkaç kez ters çevirin ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Bir davlumbazda, üst sulu tabakayı çıkarın ve yeni bir steril 1.5 mililitrelik tüpe yerleştirin. Daha sonra nükleik asitleri çökeltmek için iki hacim %30 PEG sodyum klorür çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın.

Buz üzerinde iki saat inkübe edin veya numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede bırakın. İnkübasyondan sonra, numuneleri 20 dakika boyunca dört santigrat derecede 16.000 kez g santrifüjleyin. Bir mikropipet kullanarak, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı nazikçe çıkarın.

Tüpte yaklaşık 10 mikrolitre PEG çözeltisi bırakın ve bir mililitre buz gibi% 70 etanol ekleyin. Numuneyi döndürdükten sonra, pelete dokunmamaya dikkat ederek etanolü yavaşça çıkarmak için bir mikropipet kullanın. Ardından beş saniye santrifüjleyin ve kalan etanolü çıkarın.

Yeniden süspanse etmek için 50 mikrolitre DEPC arıtılmış su kullanmadan önce peletin beş dakika kurumasını bekleyin. DNA için 15 mikrolitre ve RNA için 30 mikrolitre bir örnek alın. En kritik adım, süpernatan çıkarılırken DNA/RNA peletinin yerinden çıkmamasını ve aşağı akış moleküler reaksiyonunu inhibe ettiği için peleti suda yeniden süspanse etmeden önce artık etanol kalmamasını sağlamaktır.

RNA örneğindeki DNA'yı sindirmek için, 30 mikrolitrelik nükleik asit alikotuna üç mikrolitre DNaz I tamponu ve 1.5 mikrolitre DNaz I ekleyin. 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. DNaz inaktivasyon reaktifini 30 saniye girdaplayarak karıştırın.

Daha sonra numuneye 4.8 mikrolitre çözelti ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin, ara sıra çözeltiyi karıştırmak için tüplerin dibine vurun. Numuneyi döndürdükten sonra, çökelticiyi aktarmamaya dikkat ederek RNA içeren süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. RNA kalitesini kontrol etmek için, 18 mikrolitre steril RNaz içermeyen deiyonize su ekleyerek 10'da bir olmak üzere iki mikrolitre RNA'yı seyreltin.

Ayrı PCR reaksiyonlarında, steril 0.5 mililitrelik bir PCR tüpüne bir mikrolitre saf veya 10'da bir seyreltme RNA ekleyin. Metin protokolündeki tabloyu takip ederek, 16S ribozomal RNA genini amplifiye etmek için PCR reaksiyon bileşenlerini ekleyin. Bir pozitif kontrol, bir PCR inhibitör kontrolü ve bir negatif kontrol ekleyin.

Ardından aşağıdaki amplifikasyon parametrelerini kullanarak PCR reaksiyonlarını çalıştırın. RNA'dan ilk iplikçik cDNA'sını oluşturmak için, reaksiyon reaktiflerini metin protokolüne göre 0.2 mililitrelik bir PCR tüpüne ekleyin. Numuneleri 65 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Ardından, 25 santigrat derecede 10 dakika inkübe etmeden önce numuneleri en az bir dakika buz üzerine koyun. İnkübasyondan sonra, burada listelenen tablodaki reaktifleri metin protokolünden ekleyin ve 55 santigrat derecede 50 dakika inkübe edin. Ardından reaksiyonu 72 santigrat derecede 10 dakika boyunca etkisiz hale getirin.

Metin protokolüne göre qPCR için DNA ve RNA standartları oluşturulduktan sonra, çevresel DNA ve cDNA örneklerini, standartlarını ve qPCR reaktiflerini buz üzerinde çözün. Nükleik asit standartlarını seyreltin ve çevresel DNA ve cDNA'nın 10'da birini düzden 10'a eksi üçe kadar seyreltin. Toplam reaksiyon sayısı artı %10 için bir ana karışım yapın ve iyice karıştırın.

96 kuyulu bir optik qPCR plakasındaki her bir oyuğa üç nüsha halinde 19 mikrolitre ana karışım ve bir mikrolitre şablon ekleyin. Plakayı kapatmak için bir qPCR optik kapak kullanın. Ardından plakayı kısaca santrifüjleyin ve qPCR makinesinin ısıtma bloğuna yükleyin.

Ardından, qPCR yönetici yazılımını açın, ardından Protokol sekmesine tıklayın, Yeni Oluştur'a tıklayın ve aşağıdaki amplifikasyon koşullarını ekleyin. Örnek hacmini 20 mikrolitreye ayarlayın, Tamam'a tıklayın ve protokolü kaydedin. Şimdi Plaka sekmesini seçin.

Ardından, Seçileni Düzenle altında, Florofor Seç'i tıklatın. Uygun prob için muhabir boyasını ekleyin ve Tamam'a tıklayın. Standartları içeren kuyucukları vurgulayın, ardından Numune Türü menüsünden Standart'ı seçin. Çoğaltma Boyutu'nu üç olarak değiştirmek için Seriyi Çoğalt'ı seçin ve Uygula'ya tıklayın.

Standart olan için hesaplanan başlangıç konsantrasyonunu eklemek için Seyreltme Serisini seçin. Seyreltme faktörünü 10 olarak belirtin, standart eğrinin plakaya eklenme sırasına bağlı olarak Azalan veya Artır'ı seçin ve Uygula'ya tıklayın. Bilinmeyen örnekleri içeren kuyu konumlarını vurgulayın ve Örnek Türü açılır menüsünden Bilinmeyen'i seçin.

Seriyi Çoğalt'ı seçin ve Çoğaltma Boyutu'nu üç olarak değiştirin, ardından Uygula'ya tıklayın. Örnek Adı altında, örnek adlarını düzenleyin ve şablon kontrol kuyusu olmaması için yordamı yineleyin. Ardından, plaka düzenleyici kutusunda Tamam'a tıklayın ve dosyayı kaydedin.

Ardından Çalıştırmayı Başlat'ı tıklayın. Çalışma tamamlandığında, standart eğriyi, standart eğri tanımlayıcılarını ve yükseltme grafiklerini görüntülemek için Niceleme sekmesini seçin. Son olarak, Cp değerleri için Miktar Tayin Verileri sekmesini ve bilinmeyen örneklerin genleri için karşılık gelen başlangıç miktarını seçin.

Metin protokolüne göre ıslak ağırlık tortusunun gramı başına gen kopyalarının sayısını belirleyin. Bu jel görüntüsünde gösterildiği gibi, başarılı bir nükleik asit ekstraksiyonu, yüksek moleküler ağırlıklı bir genomik DNA bandının varlığına ek olarak keskin 23S ve 16S ribozomal RNA bantlarının görülebildiği berrak DNA ve RNA bantları verir. Bu şekil, qPCR reaksiyonu için kullanılacak standart bir eğri oluşturmak için on katlı bir seyreltme aralığı doğru bir şekilde hazırlandığında ve amplifiye edildiğinde, her standart seyreltme arasında 3.3 döngülük bir fark görüldüğünü göstermektedir.

Şablon yok denetiminden veya varsa NTC'den geçiş noktasını veya Cp değerlerini raporlamak önemlidir. Bu meydana gelirse, daha önce açıklandığı gibi, 3.3 döngülük standart ve bilinmeyen numuneler için bir Cp kesimi veya NTC'nin Cp değerinden daha yüksek bir kütük katlaması uygulanır. Burada, düzgün, 10'dan eksi bire, 10'dan eksi ikiye ve 10'dan eksi üçe kadar çevresel numune amplifikasyonu gerçekleştirildi.

Saf numune amplifiye edilmedi ve 10 ila eksi bir ila 10 ila eksi üç seyreltme arasındaki Cp değerleri sırasıyla 24.12, 26.02 ve 28.40 idi. Bu grafikte görüldüğü gibi, 0,99'luk R kare değerleri ve %90 ila %110 aralığında PCR verimlilikleri dahil olmak üzere standart eğri tanımlayıcıları istenmektedir. Bu deneyde, NTC Cp 30.5 idi ve 27.2'lik negatif bir Cp kesintisi uygulandı.

Gen bolluklarının gram ıslak ağırlık tortusu başına dönüştürülmesi, sırasıyla 2.5 kez 10 ila yedinci ve 7.1 kez 10 ila yedinci için 10 ila yedinci ve 10 ila eksi iki seyreltme ile sonuçlandı. 10 ila eksi üç seyreltme Cp, NTC sınırından daha büyüktü. Bu durumda, 10 ila negatif iki, en uygun şablon seyreltmesi olarak seçilmiştir.

Bu prosedürü denerken, RNA'nın hızla bozulabileceğini hatırlamak önemlidir, bu nedenle numuneyi buz üzerinde tutmak ve her zaman RNaz ile kontaminasyonu önlemek için eldiven kullanmak önemlidir. Fenol:kloroform ve izamil alkol ile çalıştığımızı ve bunun son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Ve bu işlem yapılırken laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük giymek ve kimyasal bir başlık altında çalışmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, DNA ve RNA'nın nasıl çıkarılacağını ve deniz kıyı çökeltilerindeki gen ve transkript bolluklarının nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Unutmayın, bu prosedür DNA ve RNA'yı çıkarmak ve toprak da dahil olmak üzere çoğu çevresel örnekten bir dizi gen hedefini ölçmek için kolayca kullanılabilir.