Name: IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Keşfedin canlı hayvanlarda nötrofil hazırlama sürecini intravital görüntüleme ve floresan muhabirler kullanarak. Bu yöntem, nadir hastalıkların bağışıklık mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların teşekkür hakkı yok.

Tüm hayvan deneyleri Sağlık kurallar National Institutes göre yapılan ve Toledo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. pIL1-DsRed 1. Farelerin fenotipleme Not: Yavrular, vahşi tip (WT) C57BL6 fare ile heterozigot pIL1-DsRed fareler üreme tarafından oluşturulur. Üç hafta, dört eski yavrular fenotipleme hazır olarak kabul edilir. Farelerin Submandibuler kanama küçük değişiklikler 23 ile kurulmuş bir protokol izler. <ol><li> Fare Pups Whole Kan Beyaz kan hücrelerinin izolasyonu <ol><li> Her 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne heparin 20 ul ekleyin. </li><li> kafesten bir yavru kazanır. yavru kimlik etiketi kaydetmek. Submandibuler venden kan toplama önce yavrular uyutmak için gerekli değildir. </li><li> Boyun berduş tarafından yavru tutun ve th submandibuler ven delmek5 mm neşter kullanarak e yanak kese. Kan damlaları penetrasyon açısından terlemek, böylece küçük bir delik oluşturmak için yeterli kuvvet uygulamayın. Her yavru için yeni bir iğne kullanın. </li><li> Bir heparin içeren mikrosantrifüj tüp yavru başına kan 5 damla - 3 toplayın. Delinen bölgeyi temizleyin ve hemostaz kolaylaştırmak için basınç uygulayın. </li><li> Yeni kafese yavru koyun ve hayvan tesis kafesi dönmeden önce 30 dakika boyunca gözlemleyin. </li><li> Pozitif ve negatif kontroller olarak, bilinen bir fenotip yetişkin farelerden kan toplamak. </li><li> Her bir tüp, girdap tüplerine kırmızı kan hücresi lize tampon 500 ul ekle ve 5 inkübe edin - buz üzerinde 10 dakika. </li><li> Her bir tüp içinde hücre süspansiyonları altında fetal sığır serumu (FBS), 500 ul - yavaş yavaş 400 ekleyin. Net bir arayüz üst katman hücre süspansiyonu ve FBS alt tabaka arasında gözlemlenebilir. </li><li> Cap tüpleri ve santrifüj örnekleri 5 dakika boyunca 1,500 x g&#39;de. </li><li> kürk 1.1.9 - Tekrar 1.1.7 adımlarıther kırmızı kan hücreleri çıkarmak. lizis ilk kez yeterli olup olmadığını tekrar etmeyin. taneleri santrifüjleme sonrası ayırt etmek zor olması gerekir. </li></ol></li><li> Lipopolisakarid (LPS) uyarılması ve Kültür <ol><li> Tam Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamı içinde 200 ul içinde süspanse hücreleri. </li><li> tüp sitometri bir akış hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> tam RPMI 1640 ortamı içinde 990 ul LPS stok çözeltisinin 10 ul (1 mg / ml) karıştırarak çalışma çözeltisi LPS sağlayın. </li><li> Hücre süspansiyonunun 200 ul çalışma çözeltisi 10 ug / ml LPS 20 ul ekle. </li><li> Kapak borular gevşek ve% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 4 saat örnekleri inkübe edin. </li></ol></li><li> Akım Sitometri Analizi <ol><li> flow sitometri için veri toplama programını açın. edinimi örnek öncesinde satın alma şablonu ayarlayın. </li><li> araç paletinde Dot-Plot aracını tıklatın. Bir fo çizinyan dağılım (SSC) arsa vs rward dağılım (FSC). Doğrusal ölçeğine FSC ve SSC gerilim parametreleri ayarlayın. </li><li> sitometresinin izin FSC ve SSC düşük eşik seçin. sırasıyla, FSC ve SSC için barajı 200 ve 50 uygulayın. </li><li> SSC arsa vs FSC içinde, enkaz, kırmızı kan hücreleri ve lenfositler monositler, granülositler ve dendritik hücreleri içerir ve dışlayan bir kapı G1 çizin. </li><li> araç paletinde Histogram aracını tıklatın. Bir FL2 (kırmızı floresan kanalı) histogram çizin. Tüm DsRed pozitif olayları kapsar bir kapı çizmek için FL2 sinyallerinin taban çizgisi ve pozitif kontrol örneği ayarlamak için bir negatif kontrol örneği kullanın. </li><li> sitometresinin ve Sıvıları Kontrol panelinde, sıvı moduna &quot;RUN&quot; ve akış hızını &quot;HI&quot; (yaklaşık 60 ul / dak) olarak ayarlayın. Her numune için 10.000 olayları edinin. </li><li> G1 kapısından DsRed pozitif hücrelerin yüzdesi ölçerek yavru fenotip belirleyin. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. pIL1-DsRed Farelerde Cilt iltihap İndüksiyon <ol><li> 100 mg / kg ketamin 10 mg / kg ksilazin ve 1 mg / kg asepromazin ihtiva eden bir anestezik kokteyl intraperitonal (İP) enjeksiyon ile fare anestezisi. Yeterli anestezi fareler ayak tutam arka pençe çekme görünmüyor. </li><li> Farenin her iki kulağın arka yüzeyine saç kaldırma krem ​​uygulayın. 1 dakika 30 saniye bekleyin. Su-ıslatılmış pamuk ile kulak yüzeyini silin ve kurumaya bırakın. </li><li> mikrometre ile kulak kalınlığını ölçmek ve ayrı bir kafes içinde fare değiştirin. (- 30 dakika ~ 15) anestezi kurtarma kadar gözlemleyin. Epilasyon ürünün neden olduğu deri iltihabı gidermek için daha fazla deney yapılmadan önce fare 3 gün dinlenmeye bırakın. </li><li> 1 ml aseton içinde OX 16.7 mg eritilmesi ve zeytin yağı 250 ul OX / aseton çözeltisi 750 ul karıştırarak 1.25% (w / v) oks hazırlayın. 250 &amp; ile aseton 750 ul karıştırılarak araç çözüm hazırlayın# 181; zeytinyağı l. </li><li> anestezik kokteyl (2.1) ip enjeksiyon yoluyla fare yeniden uyutmak. daha önce olduğu gibi kulak kalınlığını ölçün. </li><li> sağ kulak her iki yüzüne% 1.25 OX 12.5 ul uygulayın. sol kulak her iki yüzüne aseton / zeytin yağı araç solüsyonu 12.5 ul uygulayın. </li><li> Tam o, diğer farelerin tarafından kulakları hakaret önlemek orijinal kafeste fare yerini ve hayvan barınağı tesisi dönmek için iyileşene kadar fare kafes arkadaşları ayrı tutun. NOT: Epilasyon kulak kalınlığı değişikliği aşağıdaki küçük deri iltihabı neden olabilir. Bu küçük inflamasyon 3 gün sonra çözüldü, normal kulak kalınlığı tarafından teyit edilecektir. 24 saat süre ile topikal uygulama sonrası, OX-muamele edilmiş kulaklar önemli (p &lt;0.01) kıyasla araç çözeltisi, tek başına tedavi edilen kulakları şişme göstermektedir. </li></ol> pIL1-DsRed Farelerde nötrofil 3. Etiketleme Not: düşük doz f nötrofillerin in vivo etiketlenmesindeluorescence-konjuge nötrofil özgü mAb yeni geliştirilmiş bir protokol 19 izler. Retro-orbital enjeksiyonları birkaç modifikasyon 24 ile kurulmuş bir protokole göre gerçekleştirilir. <ol><li> fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 90 ul, 0.5 mg / ml ve Alexa Fluor 647-bağlı anti-Ly6G mAb (klon 1A8) 10 ul seyreltilmesi anti-Ly6G mAb çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> 28 ölçü bir iğne ile, U-100 insülin şırıngaya anti-Ly6G mAb çalışma çözeltisi (50 ug / ml) 100 ul aktarın. </li><li> daha önce tarif edilen anestezi kokteyl (2.1) IP enjeksiyonu ile bir yetişkin pIL1-DsRed fare anestezisi. Temiz bir çalışma gemide anestezi fare karın aşağı gelecek şekilde yerleştirin. </li><li> Kısmen soketten göz küresinin çıkıntı bir fare göze hafifçe aşağı doğru cilt dorsal basınç ve ventral uygulayın. </li><li> Dikkatle retroorbital medial kantus yaklaşık 30 ° &#39;lik bir açı ile aşağı konik, iğne yersinüs. NOT: Operatör sinüse iğne ekler kez baskı, nüfuz ve rahatlamış direnci hissedebilirsiniz. </li><li> Yavaş ve yumuşak fare içine solüsyonu (5 ug mAb / fare / enjeksiyon) çalışan anti-Ly6G mAb 100 ul enjekte edilir. iğneyi hızla sökün. kanama az miktarda başarılı bir enjeksiyon göstermektedir. </li><li> Hemen sağ ve sol fare kulakları üzerine% 1.25 OX ve araç çözümü uygulayın. </li><li> 8 saat sonra, aynı fareye retroorbital enjeksiyon yoluyla taze hazırlanmış anti-Ly6G mAb çalışma çözeltisi (5 ug mAb / fare / enjeksiyon) 100 ul yönetmek. </li><li> Hemen görüntüleme önce, kan damarları görselleştirmek 30 mg / ml flöresin izotiyosiyanat (FITC) ile 100 ul yönetmek için retroorbital enjeksiyon yoluyla dekstran (150 kDa) ile konjüge edilmiş. </li></ol> pIL-1 DsRed Farelerde Nötrofil Hazırlama 4. intravital Görüntüleme <ol><li> anestezik kokteyl (2.1) ip enjeksiyonu ile fare anestezisi.0; iken görüntüleme için anestezi altında kuruluğunu önlemek için fare gözlerine veteriner merhem sürün. <ol><li> PBS eşit hacimde orijinal anestezi kokteyl 500 ul seyreltilmesi ile 1 ml yarım doz anestezi kokteyli hazırlanır. </li><li> Bir kelebek 27 gauge iğne ile 1 ml şırınga yarım doz anestezik kokteyl aktarın. </li><li> intraperitoneal fare karın içine kelebeğin iğne takın ve bantlama ile karın kelebek kanat düzeltmek. </li></ol></li><li> Görüntüleme aşamasında merkezinde bir cam lamel. yerinde tutmak için lamel kenarlarında bantlayın. </li><li> Fare kulağı ventral yüzeyi üzerinde hem de lamel PBS damla yerleştirin. </li><li> Pozisyon lamel üzerindeki kulak ile fare anestezi. Ayrıca bant aracılığıyla yerinde tutulan lamel ve bir cam slayt arasındaki kulak sandviç ile, aşağı kulak ucu, dorsal yüzü monte edin. </li><li> Çok lazer floresan konfokal mikroskop ve ilgili tüm e-açmaquipment. Ortam ışığı maruziyeti en aza indirmek için oda ışıkları kapatın. </li><li> görüntü elde etme yazılımını açın. Boya Listesi menüsünde floresan boyaların tespiti için lazer kanalları seçin. </li><li> Mercek aracılığıyla DsRed + hücrelerden kan damarları ve kırmızı sinyaller yeşil sinyallerin gözlem iltihaplı kulak cilt üzerinde odağı ayarlayın. </li><li> Tarama 2 us / piksel hızı ve 512 × 512 piksel çözünürlüğe sahip bir hızlı tarama gerçekleştirin. Canlı Görünüm menüsünde her kanal için bir Pseudocolor seçin. sonunu ayarlamak ve tarama konumunu başlatmak için odak düğmesini ayarlayın. </li><li> 8 mikro-sn / piksel ve 800 × 800 veya 1024 × 1024 piksel çözünürlük - tarama 4 hızı yavaş taramalar yapar. , Yüksek gerilim ayarlayın kazanç ve doygunluk (kırmızı piksel) kaçınarak sinyallerin yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için her kanalda ofset. Her bir kanalda, sadece birkaç kırmızı piksel olmalıdır. </li><li> th tarayarak üç boyutlu görüntü kümeleri oluşturmae kulak cilt, 635 mikron x 635 mikron × 30 mikron (20X objektif), ya da 1270 mikron × stratum korneum yüzeysel başlayan ve x, y, 317 mikron × 30 mikron (40X objektif) × 317 mikron z hacimleri ile aşağıya doğru ilerliyor 2 mikron z-adımlarda 1270 mikron × 50 mikron (10X objektif). NOT: stratum korneum epidermisin en dış tabakası olan ve hali hazırda güçlü otofloresan sinyaline göre lokalize edilebilir. </li><li> zaman atlamalı görüntüleme deneylerde, kayıt üç boyutlu görüntüler en fazla 8 saat süre ile, her 2 ya da 4 dak. </li><li> kelebek iğne ile yarım doz anestezi kokteyl 10 ul - fare anestezi kurtarmak için başlar Aralıklı, seğirmesi bıyıkları gözleme dayalı kaydetti, 5 yönetmek. NOT: Anestezi doz dikkatli olun - aşırı doz fare ölüme neden olabilir. Seçenek olarak ise, bir kavanoza inhalasyon anestezisi kısa süreli anestezi ve farenin tatbik edilebilirburun konisi, uzun vadeli görüntüleme için kullanılabilir. </li><li> görüntüleme tamamlandığında aşamasından anestezi fareyi çıkarın. Kaseti çıkarın ve farenin karın kelebek iğne çıkarılır. hayvan barınağı tesisi ayrı bir kafes fare dönün. NOT: - 3 saat kısa süreli görüntüleme (&lt;1 saat), fareler tamamen 1 hızlı anestezi kurtarmak. 16 saat - Uzun süreli görüntüleme (~ 8 saat), fareler 12 tipik geri kazanım süresi ile yavaşça iyileşir. Böylece, oral su idaresi şiddetli su kaybını önlemek için iyileşme döneminde en az birkaç kez tavsiye edilir. </li><li> Süreç görüntüleme veri setleri, tek tek hücrelerin izlemek göç yolları üretmek ve görüntü analiz yazılımı 25 kullanılarak hücre göçü yönünü ve hızını hesaplar. </li></ol>

<ol><li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at work.</a> Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).</li>
<li>Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Immunol.+Ther.+Exp.+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the innate immune response.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).</li>
<li>Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+priming%3A+pathophysiological+consequences+and+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Sci.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms.</a> Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).</li>
<li>El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+the+neutrophil+NADPH+oxidase+activation%3A+role+of+p47phox+phosphorylation+and+NOX2+mobilization+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane.</a> Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).</li>
<li>Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+imaging+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Cellular imaging in rheumatic diseases.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).</li>
<li>Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+microbial+immunity+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues.</a> Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).</li>
<li>Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immunoimaging--deeper%2C+bigger%2C+more+precise%2C+and+definitively+more+colorful%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).</li>
<li>Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+biology+in+live+animals%3A+ready+for+prime+time%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cell biology in live animals: ready for prime time.</a> J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+recruited+by+chemoattractants+in+vivo+induce+microvascular+plasma+protein+leakage+through+secretion+of+TNF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF.</a> J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).</li>
<li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+S+inhibits+neutrophil+recruitment+during+the+early+stages+of+Streptococcus+pyogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-modal+imaging+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+transgenic+reporter+mice+reveals+the+dynamic+nature+of+inflammatory+changes+during+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression.</a> J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).</li>
<li>Slaba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+Dynamic+Platelet-Neutrophil+Response+in+Sterile+Liver+Injury+and+Repair+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice.</a> Hepatology. , (2015).</li>
<li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li>
<li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catchup%3A+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li>
<li>Matsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+IL-1beta+production+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of IL-1beta production in skin.</a> J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li>
<li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci. Rep. 3, (1913).</li>
<li>Sreeramkumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+scan+for+activated+platelets+to+initiate+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation.</a> Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+priming+occurs+in+a+sequential+manner+and+can+be+visualized+in+living+animals+by+monitoring+IL-1beta+promoter+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation.</a> J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).</li>
<li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+simple%2C+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice).</a> Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration).</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Mizumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+immunostimulants+by+dendritic-cell-based+functional+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening.</a> Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).</li>
<li>Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+proteins%3A+selling+cytokines+by+the+pound%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound.</a> Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).</li>
<li>Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+ATP-+and+LPS-induced+IL-1beta+release+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).</li>
<li>Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+domoic+acid+differ+between+in+vivo+and+in+vitro+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice.</a> Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).</li>
<li>Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+role+of+G-CSF+in+the+production%2C+survival%2C+and+release+of+neutrophils+from+bone+marrow+into+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation.</a> Blood. 100 (3), 854-861 (2002).</li>
<li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).</li>
<li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assessment+of+confocal+microscopy+slide-based+systems%3A+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability.</a> Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).</li>
<li>Hogan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+on+the+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics.+Int%22%5BJournal%5D)">Focusing on the experiment.</a> Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).</li>
<li>Kabashima, K., Egawa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+cutaneous+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).</li>
<li>Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+epidermal+keratinocytes+and+dermal+vasculatures+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dermatol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy.</a> J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li>
</ol>

Yazarların herhangi bir finansal çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışmanın amacı, henüz mevcut tekniklerle yerine olmamıştır yaşayan hayvanların, nötrofil astarlama işlemi izlenmesi için bir teknoloji geliştirmektir. Bu amaca ulaşmak için, üç kurulan yöntemler gerçekleştirilir: deri iltihabı 1) İndüksiyon, IL-1β promotör-tahrikli DsRed raportör farelerde astarlama bir ölçüsü, flüoresan-konjuge anti-Ly6G düşük doz nötrofillerin 2) in vivo olarak etiketleme mAb, ve 3) intravital konfokal mikroskopi görüntüleme. Bu üç yöntemin kombine inflamatuar deri lezyonlarında prime nö...

Nötrofiller dolaşımda en bol ve kısa ömürlü lökositler bulunmaktadır. Onlar hızla de antimikrobiyal peptidler ve proteazlar 1 içeren granüller ile birlikte reaktif oksijen ve nitrojen ara serbest bırakılması yoluyla profesyonel fagositler hizmet enfeksiyon veya yaralanma sitelerine işe alınırlar. Onların işe sırasında, nötrofiller inflamasyon 2 bir yerinde girişte belirgin gelişmiş fagosit işlevselliği ile sonuçlanan mikrobiyal ürünler, chemoattractants ve inflamatuar sitokinler dahil olmak üzere çeşitli ajanlar tarafından &quot;prime&quot; vardır. Nötrofil hazırlığını mekanizmaları yoğun vitro 3,4 çalışılmıştır; Bununla birlikte, in vivo koşullarında işlemin dinamik kontrolü tarihi mümkün olmamıştır. Son zamanlarda, intravital görüntüleme görselleştirilmesi ve canlı organizmalarda biyolojik süreçlerin hücresel dinamiklerini miktarının belirlenmesi için önemli bir teknik haline gelmiştir. Intravital görüntüleme geleneksel tek foton uyarma mikroskobu ile (örneğin, konfokal) gerçekleştirilen veya multiphoton mikroskopi 5 yaklaşımlar olabilir. Zamanla, önemli gelişmeler artan görüntü çözünürlüğü, gelişmiş görüntüleme derinliği sağlayan bu teknikle elde edilmiştir, doku fotohasar ve gelişmiş görüntü sabitleme 6,7 azalmıştır. Zamanla hücresel göç ve etkileşim dinamik görselleştirme etkinleştirmek için eşsiz yeteneği göz önüne alındığında, intravital mikroskopi yoğun immünoloji 8 çalışmanın çeşitli alanlarda uygulanmıştır. Intravital görüntüleme daha iyi anlamak ve hayvan modelleri yaşayan hem hücresel ve moleküler düzeyde bağışıklık yanıtlarını contextualize İmmünologlar sağlar. Son transgenik gelişmeler de knock-in muhabiri fare gibi yaşayan hayvanlarda nötrofil dinamik davranışları izlemek için yararlı araçlar sağlamıştır. Lizozim M organizatörü odaklı gelişmiş yeşil floresan protein knock-infarenin genel ekstravazasyonu, bakteriyel enfeksiyon ve steril bir iltihap 9-15 de dahil olmak üzere çeşitli enflamatuvar süreçlerde nötrofiller, monositler ve makrofajlar hareketliliğini karakterize etmek için kullanılmaktadır. Bundan başka, bir sitoplazmik flüoresan rezonans enerji transferi biyosensör ifade eden transgenik fareler, iltihaplı bağırsak 16 içinde nötrofil hücre dışı düzenlenmiş bir mitojen kinaz ve protein kinaz A aktivitelerini inceleyerek içinde kullanılmaktadır. Nötrofillerde floresans ifadesi için yüksek bir özgüllüğü olan bir fare modeli kendisi lenfosit antijen 6G (Ly6G) 17 sentezlenmesi kuple edilir floresan protein tdTomato, hem de Cre rekombinazı üreten Catchup knock-in fare,. Bu modelde aracılığıyla Ly6G eksikliği nötrofil Görselleştirme bu hücrelerin steril ya da bulaşıcı in vivo enflamatuar bağlamlarda çeşitli normal işlevlerini uygulamak olduğunu göstermiştir. DsRed flüoresan s ifade eden transjenik fareninnötrofiller, iltihabik monositler ve aktive makrofajlar içerdiğine inanılmaktadır - - (IL-1β) promoteri (pIL1-DsRed), IL-1β üreten hücrelerin hareketsiz davranışları görselleştirmek için kullanılmıştır interleuikin-1 p fare kontrolü altında genin rotein çıkan iltihaplı cilt 18. İn vivo markalama iltihaplı dokuların nötrofil hücresel ve moleküler davranışları izlemek için alternatif bir yaklaşım olarak görev yapabilir. Anti-Gr-1 monoklonal antikoru (mAb) floresan etiketli düşük dozlarda intravenöz enjeksiyon, Gr-1 + nötrofillerin ilerlemesini kaskad sonra Staphylococcus aureus 19 ile enfekte edilmiş farenin deri lezyonlarında görselleştirilmiştir. Streptavidin içeren konjugatlarının in vivo uygulama konjuge 705 nm kuantum noktaları ve biyotinile anti-Ly6G mAb özellikle dolaşan nötrofillerin 20 etiket. neutroph bu tür konjugatların Ayrıca, endositozIL veziküller interstisyuma göç nötrofillerde yüksek hızlı vezikül taşıma izleme sağlar. in vivo P-selektin karşı floresans-konjuge antikor Branşman integrin ligand-1 (PSGL-1), L-selektin (CD62L) glikoproteini ile markalama (CD11b bir TNFa kaynaklı inflamatuar modelinde) ve kemokin (CXC motifi) reseptör 2 (CXCR2) erken inflamasyon 21 döneminde oynayan düzenleyici mekanizmalar açığa çıkartılmıştır. Polarize nötrofiller CD11b ve CXCR2, nötrofil göçünü sürücü ve inflamasyonu başlatan reseptörlerinin dağıtılması sonuçlanan aktive trombositler üzerinde CD62L mevcut ile etkileşim uropods PSGL-1-zenginleştirilmiş çıkıntı. IL-1β hazırlanmış nötrofillerin 22 yükselir imza genlerin biridir. PIL1-DsRed muhabiri farelerde, DsRed floresan sinyalleri (yani., IL-1β promotörünün aktivasyonu) olumlu mRNA ifadesi ve IL-1β protein üretimi, IL-1β ile bağlantılıdır. &lt;sup&gt; 18 nötrofil astarlama işlemi izlemek için, intravital mikroskopik bir yöntemi floresans konjuge edilmiş anti-Ly6G mAb ile nötrofillerin in vivo etiketlemeden sonra pIL1-DsRed fare modelinde oksazolon (OX) deri iltihabı indüksiyonu dahil geliştirilmiştir. Bu model ile, çeşitli hastalıkların ve rahatsızlıkların hayvan modellerinde astar nötrofillerin davranış ve işlevini incelemek mümkündür.

<table><tbody><tr><td>Heparin sodyum</td><td>APP İlaç</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>ACK parçalama tamponu</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisakkaritler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin hidroklorür</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>LLOYD Laboratuvarı</td><td>NADA # 139-236</td><td></td></tr><tr><td>Asepromazin</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>Tüy dökücü krem</td><td>Kilise & Dwight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>Oxazolone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-fare Ly6G antikoru</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>U-100 insülin şırıngası, 28 G iğne</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>Kelebek infüzyon seti (27 G iğne)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur sitometre</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro yazılımı</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorf Yazılımı</td><td>Evrensel Görüntüleme</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

il-1β promoter odaklı dsred muhabir fare kullanma nötrofil hazırlama intravital görüntüleme

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Nötrofiller, insan kan dolaşımında en bol lökositlerdir ve hızlı bir şekilde enflamatuar sitelere alınırlar. Astar nötrofillerin fagositik işlevselliğini artıran önemli bir olaydır. Kapsamlı çalışmalar, H. pylori ve yaralanma içinde mevcut ve nötrofil priming önemini meydana gelmiş olsa da, yok olmuştur, in vivo olarak bu işlemi görselleştirme anlamına gelir. Floresan-konjuge anti-limfosit antijen enjeksiyonu ile elde 2 -) &#39;de in vivo nötrofil etiketleme emişli bir ölçüsü olarak kullanılır - 1) DsRed reporter sinyalini: Resim protokolü üç yöntemleri birleştirerek yaşayan hayvanlarda priming nötrofil dinamik işlem izlenmesini sağlar 6G (Ly6G) monoklonal antikoru (mAb) ve 3) intravital konfokal görüntüleme. Birkaç kritik adımlar bu protokol katılmaktadırlar: oksazolon kaynaklı fare kulak deri iltihabı, hayvanların uygun sedasyon, anti-Ly6G mAb&#39;nin tekrarlanan enjeksiyonları ve prevgörüntüleme sırasında odak kayması ention. Bir kaç sınırlamalar gibi bir fare sürekli görüntüleme süresi (~ 8 saat) sınırı ve floresein izotiosiyanat-dekstran inflamatuar durumda kan damarlarından sızıntısı olarak, gözlenmemiş olmasına karşın, bu protokolü intravital görüntüleme için temel bir çerçeve sağlar kolayca fare inflamasyon modellerinde diğer bağışıklık hücrelerinin incelenmesi genişletilebilir prime nötrofil davranış ve işlev.

pIL1-DsRed farelerin tarama akış sitometrisi kullanılarak periferal kan lökositleri tarafından üretilen fenotipik DsRed floresan sinyali göre gerçekleştirilir. LPS uyarımı nötrofiller, monositler ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere 26-28 miyeloid hücrelerinde IL-1β üretimini indüklediği bilinmektedir. Bu durumda, izole edilmiş bir lökosit akış sitometri analizine önce 4 saat LPS ile inkübe edilir. Daha sonra, yolluk bu kapı popülasyonda ölçülür hücre boyutu (FSC) ve iç ...

Bu mevcut protokol, canlı hayvanlarda nötrofil hazırlamanın dinamik sürecinin izlenmesini sağlamak için floresan raportörler, in vivo etiketleme ve intravital görüntüleme teknikleri kullanır.

IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı hayvanlarda nötrofil hazırlama sürecini izlemek için bir teknoloji sunmaktır. Bu yöntem, davranışın görselleştirilmesi ve en nadir hastalık ve bozuklukların hayvan modellerinde nötrofillerin hazırlanmasının işlevi gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, viral etiketleme ve intravital görüntülemede floresan muhabirler dahil olmak üzere üç yerleşik metodolojiyi birleştirmesidir.Heterozigot pIL1-DsRed fareleri vahşi tip C57Black altı fare ile yetiştirin. Üç ila dört haftada, yavrularını fenotipleyin. Her yavru için 20 mikrolitre heparin içeren 1,5 mililitrelik bir tüp hazırlayın.Kan toplamak için, bir yavruyu boynundan tutun ve 5 milimetrelik bir neşter kullanarak yanak kesesi içindeki submandibular damarı delin. Sadece küçük bir delinme gereklidir. Tüp başına üç ila beş damla kan toplayın.Toplama işlemini yaptıktan sonra, kanamayı durdurduğunuzdan ve hayvanları hayvan tesisine geri göndermeden önce 30 dakika boyunca gözlemlediğinizden emin olun. Her numune tüpüne 500 mikrolitre kırmızı kan hücresi parçalama tamponu ekleyin. Daha sonra, tüpleri girdap haline getirin ve buz üzerinde beş ila 10 dakika inkübe edin.İnkübasyondan sonra, her tüpteki hücre süspansiyonlarının altına yavaşça 400 ila 500 mikrolitre fetal sığır serumu ekleyin. Katmanlar arasında net bir arayüz oluşmalıdır. Daha sonra, hücre peletlerini toplamak için numuneleri 1.500 Gs'de beş dakika santrifüjleyin.Süpernatanı atın ve hücreleri 200 mikrolitre tam RPMI-1640 ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, her süspansiyonu bir akış sitometri tüpüne aktarın ve her tüpe 20 mikrolitre yeni yapılmış LPS Çalışma Çözeltisi ekleyin. Akış sitometrisi yapmadan önce numuneleri dört saat inkübe edin.Başlamak için, fareyi intraparetoneal bir anestezik kokteyl enjeksiyonu ile uyuşturun ve bir ayak parmağı tutam testi ile yeterli sedasyonu onaylayın. Ardından, her iki kulağın sırt yüzeyine tüy dökücü krem sürün, bir dakika içinde silin ve cildi suyla yıkayın. Uygulamaların yapıldığı kulağın kalınlığını bir mikrometre kullanarak ölçün.Daha sonra, anesteziden kurtulduktan sonra fareyi kendi kafesine geri koyun ve daha fazla test yapmadan önce farenin en az üç gün dinlenmesine izin verin. Üç gün sonra, fareyi uyuşturun ve tahriş olmadığından emin olmak için kulak kalınlığını tekrar ölçün. Ardından, sağ kulağın her iki tarafına 12.5 mikrolitre% 1.25 oksazolon uygulayın ve sol kulağın her iki tarafına 12.5 mikrolitre aseton zeytinyağı araç solüsyonu uygulayın.Her zaman olduğu gibi, farenin anesteziden kurtulduğunu gözlemleyin. 24 saat sonra, oksazolonun neden olduğu cilt iltihabının meydana geldiğinden emin olmak için anestezi altında kulağın kalınlığını tekrar ölçün. Başlamak için, 100 mikrolitre anti-lizaz XG monokolonal antikorunu 28 gauge iğne ile bir U100 insülin şırıngasına aktarın.Daha sonra, daha önce tarif edildiği gibi tedavi edilmiş bir fareyi uyuşturun. Farenin karnı aşağıdayken, göz küresini kısmen dışarı çıkarmak için cilde, sırta ve ventrale bir göze hafif aşağı doğru basınç uygulayın. Daha sonra, iğneyi dikkatlice yerleştirin, eğim aşağı, medial kantusa yaklaşık 30 derece yerleştirin ve iğneyi dikkatlice retro orbital sinüse yerleştirin.İğne sinüse girdiğinde penetrasyon basıncı hafifleyecektir. Ardından içeriği çıkarın ve iğneyi hızlı bir şekilde çıkarın. Az miktarda kanama başarılı bir enjeksiyonu önerir.Şimdi, daha önce olduğu gibi sağ ve sol fare kulaklarına hemen% 1.25 oksazolon ve araç solüsyonu uygulayın. Sekiz saat sonra, her fareye aynı antikorun ikinci bir dozunu uygulayın. Ayrıca, kan damarlarını görselleştirmek için, retro orbital olarak 100 mikrolitre fitc dekstran uygulayın.Bu işlem için önce fareyi daha önce olduğu gibi uyuşturun. Ardından, görüntüleme sırasında kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi sürün. Ardından, bir görüntüleme aşamasının ortasına bir cam lamel yerleştirin ve lamel kenarlarını bantla sabitleyin.Ayrıca, lamel üzerine bir damla PVS ekleyin. Şimdi, farenin kulağını sırt tarafı aşağı bakacak şekilde lamel üzerine yerleştirin. Ardından, fare kulağının ventral yüzeyini bir damla PVS ile nemlendirin.Ardından, kulağın ucunu üstüne bir cam sürgü ile monte edin ve sürgüyü bantla sabitleyin. Şimdi, çoklu lazer floresan konfokal mikroskobu ve ilgili ekipmanı açın. Ortam ışığına maruz kalmayı en aza indirmek için oda ışıklarını kapatın.Ardından, konfokal mikroskobu kullanarak üç boyutlu görüntüleri kaydedin. Hızlandırılmış görüntüleme deneyleri için, sekiz saate kadar her iki ila dört dakikada bir üç boyutlu görüntüler kaydedin. Bu arada, farenin anesteziden kurtulmaya başladığını gösteren seğiren bıyıkları izleyin.Bu gibi durumlarda, bir kelebek iğnesi ile beş ila 10 mikrolitre yarım doz anestezik kokteyl uygulayın. pIL-1-DsRed fareleri, akış sitometrisi yoluyla periferik kan lökositlerinde üretilen fenotipik DsRed floresansı açısından tarandı. Yabani tip farelerden alınan dolaşımdaki miyeloid hücreler minimal olarak DsRed'i eksprese ederken, pIL1-DsRed farelerinden alınan aynı hücreler ayırt edilebilir DsRed sinyallerini eksprese eder.IL-1 beta promotör aktivasyonu, nötrofil hazırlamanın bir belirtecidir ve en iyi canlı pIL-1DsRed farelerinde görselleştirilebilir. Daha sonra, bir cilt hassaslaştırıcı olan oksazolon, sağ kulağa topikal olarak uygulandı. Daha sonra, nötrofiller, retro orbital enjeksiyon yoluyla oksazolon duyarlılaştırıcının ikinci bir uygulamasından önce ve sonra etiketlendi.Aynı şekilde, kan damarlarını bulmak için fitc dekstran enjekte edildi. Ekstravasküler boşlukta, astarlanmış nötrofilleri temsil eden birçok çift etiketli hücre bulundu. Az sayıda hücre, muhtemelen dinlenme nötrofilleri olan lizaz XG antikoru tarafından etiketlendi.Ayrıca, enflamatuar monositler ve aktive makrofaj içerebilen küçük bir DsRed pozitif hücre popülasyonu gözlenmiştir. İki nötrofil popülasyonunu karşılaştırmak için hücre göç yolları izlendi. Her iki nötrofil popülasyonu, hücre dışı boşluğa girildikten sonra rastgele bir göç gösterdi.İlginç bir şekilde, varsayılan olarak hazırlanmış nötrofiller, varsayılan olarak dinlenen muadillerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir hız sergiledi. Bu teknik geliştirildikten sonra immünoloji alanındaki araştırmacıların önünü açmıştır. İkisi, farklı T hücrelerini içeren çeşitli enflamatuar durumlarda birçok bağışıklık hücresinin davranışını ve işlevini araştırır.Bu videoyu izledikten sonra, canlı hayvanlarda nötrofil hazırlamanın dinamik sürecini nasıl izleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada, fare Kapkaççı lökosit homing çalışmada non-invaziv bir iki foton (2P) mikroskopi yaklaşımı açıklar. Biz, bizim doku görüntüleme hazırlık teknik yönlerini tartışmak ve yürütme ve veri toplama için kurulmuş ilk tipik bir deney yoluyla okuyucu yürümek.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Biz aydınlık intravital mikroskopi, in vivo olarak nötrofil kemoatraktan kaynak yanıt nötrofil göçünü sırasında dinamik nötrofil-endotel hücre etkileşimleri ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Nötrofil intraluminal tarama, fare Cremaster'ın kas dokusu transendoteliyal göç ve kemotaksis zaman lapsed video ImageJ ile fotoğraf ve takip ile görüntülendi.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

Bu video, GFP eksprese eden nötrofillere sahip bağışıklığı baskılanmış, transgenik bir farede bir enfeksiyon bölgesindeki nötrofil alım dinamiklerini incelemek için in vivo görüntülemeyi göstermektedir. Bir enfeksiyona neden olmak için ışıldayan bakterilerin enjekte edilmesini içerir. Bu, izlenmesi görüntüleme ile yapılan enfeksiyon bölgesine nötrofil alımına yol açar.

Bir Murin Modelinde Enfeksiyon Bölgesinde Nötrofil Alım Dinamiklerinin ve Bakteri Yükünün İzlenmesi

Bu video, bir fare modelinde cilt iltihabını indükleyerek bir test antijenini değerlendirmek için in vivo bir tekniği göstermektedir. Test antijeni - bir yağ / aseton çözeltisi içinde bir hapten - fare kulağının derisine topikal olarak uygulanır ve cildin iltihabı yeterli bir süre sonra değerlendirilir.

Cilt İltihabını İndükleyerek Bir Antijene Karşı Bağışıklık Tepkisini Değerlendirme Tekniği

Burada vasküler inflamasyon ve canlı farelerde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için floresan intravital mikroskobu deneysel bir tekniktir rapor. Bu mikroskobik teknoloji vasküler hastalığın moleküler mekanizmasını incelemek ve patofizyolojik durumlardaki farmakolojik ajanları test için değerli olacaktır.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Yetişkin farelerin lenf düğümlerinde 120 um derinliğe kadar kontrastlı sahip yüksek-çözünürlüklü intravital görüntüleme uzamsal bir multi-odak iki foton mikroskop uyarım modelini modüle edilmesi ile elde edilir. 100 mikron derinliğinde biz böylece saçılma ve difraksiyon sınırlarını engellemeyi, 487 nm çözünürlük (lateral) ve 551 nm (eksenel) ölçüldü.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Anestezi uygulanmış farelerde intravital konfokal mikroskopi kullanarak kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin davranışını izlemek için bir protokolü detaylandırıyoruz.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

enflamasyon bölgelerinde CD4 efektör T hücrelerinin geçiş motilite yöneten mekanizma nispeten bilinmemektedir. Biz görselleştirmek ve yerinde bu hücrelerin dinamik davranışının çalışması için izin iltihaplı kulak dermiş in vitro -astarlı CD4 T hücrelerinde işlemek için non-invaziv bir yaklaşım sunuyoruz.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

Burada açıklanan yöntem, non-invaziv biyolüminesans görüntüleme (BLI) yoluyla farelerin akciğerlerinde IL-8 promotöre bağlı inflamasyon aktivasyonunun görselleştirilmesine olanak tanır. Aynı hayvan lusiferaz muhabiri yapısının teslim edildiği andan itibaren iki aya kadar birden fazla kez BLI'ye tabi tutulabilir.

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em&gt; İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi

Burada, fare cremaster kasının post-kılcal venüzlerinde intravital mikroskopinin nasıl yapılacağını gösteriyoruz. Yaygın olarak farklı inflamasyon ve sepsis modellerine, özellikle kemokinler ve sitokinler tarafından indüklenenlere uygulanan, abartılı kas lökosit infiltrasyonu içeren muscolopatilerin çalışmasında önemini vurguluyoruz.

İntravital Mikroskopi Ile Değerlendirilen Farelerde Cremaster Kasın Lökosit İnfiltrasyonu

Nötrofil göçü, kemoatraktana ve hücre dışı mikro çevre ile etkileşimlerine yanıt olarak plazma zarının hızlı ve sürekli olarak yeniden şekillenmesine dayanır. Burada açıklanan, anestezi uygulanmış farelerin kulağına enjekte edilen nötrofillerde zar yeniden şekillenmesinin dinamiğini araştırmak için İntravital Hücre Altı Mikroskobuna dayalı bir prosedürdür.

Fizyolojik Koşullar Altında Hücre Altı Membran Yeniden Şekillenmesini Araştırmak için Fare Derisinde Nötrofil Migrasyonunun Görüntülenmesi

Keşfedin canlı hayvanlarda nötrofil hazırlama sürecini intravital görüntüleme ve floresan muhabirler kullanarak. Bu yöntem, nadir hastalıkların bağışıklık mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araç sunar.

IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme

Daha fazla video keşfet