Name: Romatoid Artrit Hastalarının Mafsallar İzole fibroblast benzeri sinoviyosit kullanma Kaynaklı-pluripotent Kök Hücre Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Keşfedin, romatoid artrit hastalarından izole edilen fibroblast benzeri sinoviyositlerden besleyici hücre kullanmadan iPSC üretim protokolünü. Lentiviral sistemle hücre yeniden programlama yöntemini öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kore Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (HI13D2188) tarafından finanse edilen Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Etik Beyanı: Bu çalışma protokolü Kore Katolik Üniversitesi (KC12TISI0861) kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Sinoviyosit İzolasyon ve Genişleme <ol><li> sinoviyosit İzolasyon <ol><li> cerrahi makas iki çift ve forseps bir çift sterilize edin. </li><li> 100 mm çanak sinoviyal doku transferi ve% 1 penisilin / streptomisin içeren fosfat tamponlu tuz, 5 ml (PBS) ile yıkanır. </li><li> sarımsı yağ dokusu ve kemik kalıntılarını kesti. Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı içinde% 20 Fetal büyükbaş hayvan serumu (DMEM) (FBS) 5 ml 6 yuvalı bir plaka iyi kesilmiş doku transferi ekleyin. </li><li> adet tek kullanımlık pipet nüfuz kadar küçük olana kadar makas ile dokuları doğrayın. </li><li> 50 ml&#39;lik bir konik tüp doku içeren medya aktarın. 6-çukurlu plaka% 20 FBS ile 5 ml DMEM ilave edilerek kalan malzemenin Hasat ve tüpe aktarın. &lt;/ Li&gt; <li> buz üzerinde Çözülme kollajenaz. % 0.01&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar kolajenaz ekleyin ve parafilm ile tüp mühür. 4 saat çalkalanarak 37 ° C&#39;de bir su banyosu içinde inkübe edin. </li><li> Toplam hacim, 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de 50 ml ve santrifüj RT kadar inkübe edildikten sonra,% 20 FBS DMEM ile tüp doldurun. </li><li> pelet bozmadan Süpernatantı ve pelet tekrar süspansiyon medya 40 ml ekleyin. </li><li> Yineleyin 1.1.10-1.1.11 adımları. </li><li> % 20 FBS DMEM, 25 ml pelet yeniden süspanse edin ve dibe çökmesi için doku büyük topaklar bekleyin. </li><li> 100 mm tabak süpernatantı aktarın ve 14 gün için% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Sinoviyosit Bakım ve Genişletme <ol><li> plaka kullanılan ortam atın ve 5 ml PBS ile yıkama hücreleri. </li><li> 1 ml PBS / 1 mM EDTA ekleyin ve 2 dakika için% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> yavaşça çanak ve transfe dokununR 15 ml konik bir tüp hücre. 2 dakika boyunca 250 xg&#39;de RT hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Pelet bozmadan süpernatantı ve% 20 FBS ile DMEM, 30 ml pelletini. </li><li> görünür bir artık materyal bırakmadan, 3 x 100 mm yemekleri hücreleri aktarmak. </li><li> taze medya her 3 d ile değiştirin. 1 ml PBS / 1 mM EDTA kullanılarak% 80 birleşme hücreleri Böl. Kullanmadan önce geçiş 3 kadar koruyun. Her bölünmüş 3 yemeklerin içine hücrelerin her yemeğin bölün. NOT: geçit 3 ulaştıktan sonra, hemen kullanılmalıdır gidiş değildir hücreler dondurularak muhafaza edilebilir. </li></ol></li></ol> Lentiviruses kodlayan Yamanaka Faktörler kullanma 2. yeniden programlanması FLSs <ol><li> İletimi (D0) <ol><li> Büyüme ortamı içinde bir 6-yuvalı plaka oyuk başına tohum 3 x 10 4 hücreleri (DMEM 500 mi,% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş). % 5 CO, 37 ° C&#39;de hücreler O / N inkübe2. </li><li> 4 ° C&#39;de derin dondurucu ve çözülme ile ilgili Oct4, Klf4 Sox2 ve c-Myc: Ertesi gün, 4 Yamanaka faktörleri içeren lentivirüs bir vial çıkarın. Not: lentivirüs önceki çalışmamızda 11&#39;de tarif edilen prosedüre göre hazırlanır. </li><li> virüs cozundururken, 10 ug / ml heksadimetrin bromür ve 50 ug / ml askorbik asit ihtiva eden (DMEM içinde% 20 FBS artı antibiyotikler) FLS büyüme ortamında bir ortam. </li><li> medya değiştirdikten sonra, hücrelere lentivirüs 30 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın. enfeksiyon geliştirmek için, 680 x g&#39;de, 30 dakika süre ile 35 ° C &#39;de plaka santrifüj. </li><li> Santrifüj işleminden sonra,% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li></ol></li><li> Yeniden programlanması kadar bakım Görünür olduğunu <ol><li> 3 gün için, 0.1 mM sodyum bütirat ve 50 ug / ml askorbik asit içeren FLS büyüme ortamı ile günlük olarak ortamı değiştirin. </li><li> Sonraki gün, FLS büyüme ortamı içeren bir karışım ile değiştirin ve0.1 mM sodyum bütirat ve 50 ug / ml askorbik asit içeren (1 oranında 1) iPSC ortam. Not: iPSC ortamının bileşenleri malzemeleri / ekipman listesi verilmiştir. </li></ol></li><li> Koloni Formasyonu için Yarma Hücreleri <ol><li> Bir vitronektin kaplı 6 oyuklu plaka hazırlanması. <ol><li> Ca 2+ ve Mg 2+ olmadan 6 ml PBS 60 ul vitronektini ekleyin. Her bir kuyu, karışımın 2 ml koyun ve en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe. Not: vitronektin çalışma konsantrasyonu 5 ug / mL&#39;dir. </li></ol></li><li> D5, hücrelerin PBS ile yıkayın. </li><li> Hücreleri ayırmak ve 2 dakika için 37 ° C,% 5 CO2 inkübe 1 ml PBS / 1 mM EDTA. </li><li> 2 dakika boyunca 250 xg&#39;de RT hücreleri ve santrifüj hasat edilir. </li><li> (9: 3, 1: 6 ve 1: 1), farklı confluencies elde etmek için, 3 farklı oranlarda hücreleri Böl. Hücre pelet ve tekrar süspansiyon Medyanın 900 ul ekleyin. Bir 6- oyuk başına hücre karışımı 300, 150, ve 100 ul eklesırasıyla 9: 3, 1: 6 ve 1 oyuklu plaka 1 oranının elde edilmesi için. </li><li> koloniler görünene kadar iPSC medya ile günlük medya değiştirin. Koloniler hakkında D18 sonra görünecektir. Not: Bu aşamada, iPSC koloniler olmayan yeniden programlanması FLSs ile birlikte bulunmaktadır. </li></ol></li><li> koloni toplama <ol><li> oyuklara 500 ul vitronektin ekleyerek 48 oyuklu vitronektin kaplı plaka hazırlanması ve en az 1 saat süre ile oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Temiz bir bankta mikroskop yerleştirin ve inkübatör 6-plaka çıkarın. </li><li> 48 oyuklu plaka vitronektin çözüm çıkarın ve 10 mM Rho-bağlantılı sarmal bobin ihtiva eden bir protein kinaz (rock) inhibitörü ile takviye edilmiş 500 ul iPSC ortamı eklenir. </li><li> Bir 10p pipet kullanarak, koloni çevresinde kesti. 48 oyuklu plakanın bir oyuğuna aldı koloni aktarın. </li><li> Birkaç koloniler seçmek sonra, 37 ° C,% 5 CO 2 inkübe hücreleri. </li><li> koloniler büyük eno kadar hücreleri korumakUh transferini. Not: koloni 100X büyütmede inceledi mikroskop görünür alanının, dışarı çıktığında genellikle hücrelerin döktü. </li></ol></li></ol> 3. İmmünofloresan Boyama <ol><li> Hücre hazırlanması <ol><li> 12 oyuklu bir plakaya steril 18 mm kapak camı. </li><li> serin ve cam kapak durulama PBS 1 ml ekleyin. </li><li> 10 ug / ml, vitronektin çözeltinin 1 ml&#39;si ile değiştirin. </li><li> en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe plakası. </li><li> Günlük ortamının değiştirilmesi, 37 ° C,% 5 CO2 seviyesinde 7 gün vitronektin kaplı 12 oyuklu plaka ve kültürde vitronektin çözeltisi ve plaka iPSCs atın. </li></ol></li><li> Hücre boyama <ol><li> Kültür ortamı atın ve bir kez PBS ile hücreleri yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile% 0.4 paraformaldehid (PFA) hücreleri saptamak. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 hücreleri geçirgenliği. </li><li> permeabilization kaldırPBS, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 2 sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden çözelti ve blok. </li><li> . PBS Tablo 1 &#39;e göre% 2 BSA içeren antikorlar seyreltilir, oda sıcaklığında 2 saat süre ile primer antikorlar ile inkübe hücreleri. </li><li> ikincil antikoru (1 seyreltilmiştir: 200) ilave edin ve ışık kaçınarak, oda sıcaklığında 1 saat inkübe hücreleri. </li><li> 1 ul / 10 dakika boyunca mL DAPI ile hücrelerin tedavi edin. </li><li> antifade reaktif ile kayıcı camın üst kapak camı ve ışığı kaçınarak 24 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Bir floresan mikroskop ile ifade edin. </li></ol></li></ol> 4. Gerçek zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) <ol><li> Guanidinyum tiosianat-fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemi 11 kullanılarak hücre pelletinden mRNA ekstrakte edin. </li><li> Ters transkripsiyon 11 kullanılarak toplam mRNA 2 ug cDNA yükseltmek. </li><li> cDNA tem 2 ul kullanılarak PCR için gerekli bileşenleri karıştırınPlaka 11. </li><li> RT-PCR gerçekleştirin ve jel elektroforezi 11 ile sonuçları doğrulayın. </li></ol> 5. Alkali Fosfataz (AP) Boyama <ol><li> 37 ° C&#39;de 5-7 gün süre ile kültür iPSCs, boyamadan önce% 5 CO2. </li><li> medya aspire ve 1 dakika boyunca% 4 PFA hücreleri saptamak. </li><li> fiksatif atın ve 1X durulama tamponu ile hücrelerin yıkayın. </li><li> AP lekelenmesi için reaktifler hazırlayın. Aşağıdaki oranda reaktifler karışımı: Fast Red Violet: naftol AS-BI fosfat çözeltisi: su = 2: 1: 1 arasındadır. </li><li> ışık kaçınarak 15 dakika boyunca oda sıcaklığında boyama solüsyonu ile inkübe hücreleri. </li><li> boyama çözüm atın ve durulama tamponu ile hücrelerin yıkayın. </li><li> kurumasını önlemek ve parlak alan mikroskop kullanılarak ifadesini doğrulamak için hücrelerin PBS ile örtün. </li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human blood.</a> Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li>
<li>Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).</li>
<li>Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes+in+inflammatory+arthritis+pathology%3A+the+emerging+role+of+cadherin-11%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11.</a> Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).</li>
<li>Bartok, B., Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes%3A+key+effector+cells+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis.</a> Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis.</a> Arthritis Res Ther. 16 (1), R41(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

iPSCs keşfinden önce, bilim adamları başta farklılaşma ile kök hücre biyolojisi ve diğer hücre soyları incelemek için EKH kullanılır. Ancak, EKH bir erken evre embriyo bir blastosist, iç kitle kaynaklanır. EKH izole etmek için, blastosist tahrip üstesinden gelinemez etik sorunlar yükselterek, kaçınılmazdır. EKH stemness özellikleri ve pluripotensini olsa Ayrıca, bu bireylerden elde edilemez ve bazen de kişisel analizleri ve hastalık taranması için ideal bir araç bulunmaktadır. 2007 yılında, ...

Pluripotent kök hücreler çeşitli klinik ve biyolojik alanlarda yeni nesil platform vardır. Bu hastalığın modelleme, ilaç tarama, ve rejeneratif tıbbi tedavide kullanılabilir gelecek vaat eden bir araçtır. İnsan Embriyonik Kök Hücreler (hESC) esas çalışma ve pluripotent hücreler anlamak için kullanıldı. Bununla birlikte, insan blastosist imha ile izole edilmiş, HESC çok etik kaygılar ile ilişkilidir. 2007 yılında, Dr. Shinya Yamanaka ve ekibi hücre programlama sürecini tersine insan yetişkin somatik hücre 1,2 kök hücre geliştirdi. Bu nedenle, HESC farklı olarak, indüklenen-kök hücreleri (iPSCs) etik engel kaçınarak olgun somatik hücrelerinden üretilebilir. Oct4, Sox2 Klf4 ve c-Myc: Genellikle, iPSCs dört ekzojen genlerin verilmesi ile elde edilir. Bunlar Yamanaka faktörleri aslında lentiviral ve retroviral sistemler kullanılarak teslim edilir. İlk iPSCs fare somatik C elde edilmiştirarşın 3. Daha sonra, bu teknik, insan dermal fibroblastlarında 1,2 uygulanmıştır. Daha sonraki çalışmalar başarıyla idrar 4 kan 5,6 gibi çeşitli kaynaklardan iPSCs üretilen 7 keratinositler, ve çeşitli diğer hücre türleri. Bununla birlikte, bazı somatik yeniden programlama kullanılan edilmemiş hücreler ve hastalık durumunda özel dokularda çeşitli hücre tiplerinin yeniden programlama yetenekleri tarama vardır hala gereklidir. Romatoid artrit (RA), tüm eklemleri grev ve diğer organlarda otoimmün koşullara yol açabilecek bir hastalıktır. RA gelişmiş dünyada erişkinlerin yaklaşık% 1&#39;ini etkiler. Bu oldukça yaygın bir hastalıktır ve görülme sıklığı her yıl 8 artar. Ancak, RA erken evrelerde tespit etmek zordur ve yıkım oncebone zarar kurtarabilirsiniz hiçbir tedavi yoktur oluşur. Ayrıca, ilacın yararını hastadan hastaya farklılık gösterir ve Medic tahmin etmek zorgereklidir ine. Bu nedenle, bir ilaç-tarama yönteminin geliştirilmesi gereklidir ve RA şartlarını yansıtacak bir hücre malzeme gereklidir. Fibroblast benzeri sinoviyosit (FLSs) RA 9,10 patogenezinde aktif bir hücresel katılımcı vardır. FLSs de sinovyumdaki olarak adlandırılır eklem kapsülü ve oyuk arasındaki eklem iç yüzeyi bulunmaktadır. eklem yapısını destekleyen ve çevreleyen kıkırdak besinleri sağlayarak, FLSs genellikle eklem fonksiyon ve bakım önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, RA&#39;da FLSs invaziv bir fenotip var. RA FLSs sonunda sonsuz çoğalması 10 çevreleyen kemik yok, bir kanser gibi fenotip vardır. Bu eşsiz özelliği ile FLSs RA patobiyolojisi yansıtabilir umut verici bir madde olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, bu hücreler nadiren üretilir, ve hücreler, in vitro çok geçitler geçmesi gibi hücre fenotipleri değiştirebilir </em&gt; durumlar. Nedenle, hastanın durumunu temsil edebilecek bir araç olarak RA FLSs kullanmak için karmaşık olabilir. Teorik olarak, RA hasta kaynaklı iPSCs (RA-iPSCs) ilaç tarama ve ileri araştırmalar için ideal bir araç haline gelebilir. Oluşturulan iPSCs kendini yenileme yeteneğine sahip ve tutulan ve in vitro genişletilebilir. Pluripotensin, bu hücreler, RA ve diğer kemik ile ilgili hastalıklar 11 özel araştırma için hücre materyalini katkıda olgun kondrosit ve osteosit soy, ayırt edilebilir. Bu çalışmada, biz izole etmek ve Yamanaka faktörleri içeren lentiviruses kullanarak FLSs RA-iPSCs oluşturmak için bir ameliyatla çıkarıldı sinovyum ve nasıl dan FLSs genişletmek için nasıl gösterilmektedir.

<table><tbody><tr><td>100 mm Çanak</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu Plaka</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Kornik Tüp</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mlL Kornikal Tüp</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Tek Kullanımlık Pipet</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Tek Kullanımlık Pipet</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12 Kuyulu Plaka</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>FLS İzolasyon Malzemeleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Forcep</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6885-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>54956</td><td></td></tr><tr><td>PBS / 1 mM EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > iPSC Üretim Malzemeleri< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi (100x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Polibren</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>iPSC besiyeri bileşeni (500 ml)</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>iPSC besiyeri bileşeni (Conc.: 543 &mu; g / ml)</td></tr> <tr><td>Sodyum Selenit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>iPSC medya bileşeni&nbsp; (Konsantrasyon: 14 ng/mL)</td></tr><tr><td>İnsan Transfferin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>iPSC medya bileşeni (Conc.: 10.7 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>Temel FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>iPSC medya bileşeni&nbsp; (Konsantrasyon: 100 ng/ml)</td></tr><tr><td>İnsan İnsülin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12585-014</td><td>iPSC ortam bileşeni (Conc.: 20 &mu; g / ml)</td></tr> <tr><td>İnsan TGF ve beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>iPSC medya bileşeni (Konsantrasyon: 2 ng/ml)</td></tr><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>iPSC medya bileşeni&nbsp; (Devamı: 64 &mu; g / ml)</td></tr> <tr><td>Polibren</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Butirat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Vitronektin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK İnhibitörü</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Kalite Kontrol Malzemeleri< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Kapak</td><td>Camı Üstün</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>%4 Paraformaldihit (PFA)</td> <td>Teknoloji ve Yenilik</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Vektör Laboratuvarı</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SSEA4 Antikoru</td><td>Milipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4 Antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Antikor</td><td>Milipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Anti-TRA-1-81 Antikor Millipore MAB4381 630801 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4 Antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG (H + L) antikoru</td><td>Moleküler Prob</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 keçi anti-tavşan IgG (H + L) antikoru</td><td>Moleküler Prob</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Moleküler Prob</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Uzatma altın antifade reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Sürgülü Cam, Kaplamalı</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>İzoprilalkol</td><td>Kırlangıç 109634</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Dükkan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Sentez kiti</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA Polimeraz</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Tampon Ömrü</td><td>Teknolojileri</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>yükleme yıldızı</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) DNA merdiven işaretleyicisi</td><td>Enzimomik</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Alkalin Fosfataz</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr></tbody></table>

romatoid artrit hastalarının mafsallar İzole fibroblast benzeri sinoviyosit kullanma kaynaklı-pluripotent kök hücre Üretimi

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Olgun somatik hücre yeniden programlama faktörleri tanımlanmış bir dizi kullanarak pluripotent kök hücre benzeri duruma ters çevrilebilir. Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc: Çeşitli çalışmalar, dört Yamanaka transkripsiyon faktörlerini transducing çeşitli somatik hücre tiplerinden kaynaklı-pluripotent kök hücreleri (iPSCs) yarattı. iPSCs çalışma, biyolojik ve klinik araştırmaların kesme kenarında kalır. iPSCs herhangi bir bireyin dokusundan indüklenebilir yana Özellikle, hastaya özel iPSCs, hastalık patobiyolojisi çalışma için öncü bir araç olarak kullanılabilir. Romatoid artrit (RA) eklem kıkırdak ve kemik yapısının bozulmasına sınıflandırılan kronik bir enflamatuar hastalığıdır. Sinovyal hiperplazi RA&#39;da bu sonuçlara yol önemli nedenlerinden veya belirtilerden biridir. Fibroblast benzeri sinoviyositler (FLSs) hiperplastik sinovyumda ana bileşeni hücrelerdir. eklemde FLSs limitlessly sonunda komşu cartil işgal prolifereyaş ve kemik. Şu anda, hiperplastik sinovyum, sadece cerrahi bir prosedür ile çıkarılabilir. Kaldırılan sinovya ortak inflamatuar durumunu yansıtan bir malzeme olarak RA araştırma için kullanılmıştır. RA patogenezinde önemli bir oyuncu olarak, FLSs oluşturmak ve RA hastalarının iPSCs araştırmak için bir malzeme olarak kullanılabilir. Bu çalışmada, iPSCs oluşturmak için bir RA hastanın FLSs kullanılır. lentiviral sistemi kullanarak, FLSs RA hastaya özgü IPSC oluşturabilir keşfetti. FLSs oluşturulan iPSCs gelecekte daha da RA patofizyolojisinin incelemek için bir araç olarak kullanılabilir.

Bu çalışmada, bir lentiviral sistemi kullanılarak FLSs gelen iPSCs oluşturmak için bir protokol açıklar. Şekil 1A FLS izolasyon protokolü basit bir şemasını gösterir. sinovyanın cerrahi olarak çıkarılması ardından, doku cerrahi makas kullanarak küçük parçalar halinde doğranmış edildi. Kollajenaz doku kümeleri hücreleri izole etmek için ilave edildi. Hücreler, daha sonraki işlemlerden önce 14 gün boyunca inkübe edilmiştir. Şekil 1B izole ...

Burada besleyici hücreler olmadan lentiviral sistemi kullanılarak, hastaya türetilmiş fibroblast benzeri sinoviyositler insan kaynaklı-pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Romatoid Artrit Hastalarının Mafsallar İzole fibroblast benzeri sinoviyosit kullanma Kaynaklı-pluripotent Kök Hücre Üretimi

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Bu deneyin genel amacı, romatoid artrit nedeniyle iltihaplanmış bir eklemin sinovyal dokusundan izole edilen fibroblast benzeri sinoviyositlerden indüklenmiş pluripotent kök hücreler veya iPSC'ler üretmektir. Günümüzde iPSC'ler, çeşitli insan primer hücrelerinden üretilebilmektedir. Romatoid eklemlerin temel patolojik hücreleri olan insan fibroblast benzeri sinoviyositlerden iPSC'leri başarıyla ürettik.Bu, romatoid artritin patolojisinin araştırılmasına yardımcı olabilir. Bu periyodik çalışma, RA-FLS'ler kullanılarak iPSC'lerin dejenerasyonuna ilişkin temel soruların yanıtlanmasına katkı sağlayabilir. Sinovyal dokuyu 100 mm'lik bir kaba yerleştirerek ve dokuyu antibiyotik eklenmiş 5 mL PBS ile yıkayarak başlayın.Sarımsı yağ dokusunu ve kemik kalıntılarını temizleyin. Ardından, temizlenmiş dokuyu FBS ile desteklenmiş 5 mililitre DMEM içeren altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın ve parçalar tek kullanımlık bir pipet ucuna girecek kadar küçülene kadar dokuyu makasla ince ince kıyın. Besiyerini 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın, ardından kalan tüm dokuyu toplamak için kuyucuğa 5 mililitre taze DMEM artı FBS ekleyin ve kuyucuğun tüm içeriğini tüpe aktarın.Ardından, tüpe buzda çözünmüş kollagenazı 0,01% son konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin ve tüpü parafilm ile kapatarak 37 °C sıcaklıktaki çalkalayıcı su banyosunda inkübe edin. Dört saat sonra, tüpü taze DMEM artı FBS ile 50 mL son hacme tamamlayın ve doku fragmanlarını santrifüjasyon yoluyla toplayın. Pellet'e zarar vermeden süpernatantı uzaklaştırın ve ardından hücreleri başka bir santrifüjasyon işlemi için 40 mL taze besiyerinde yeniden süspande edin.İkinci pellet'i 25 mililitre taze DMEM artı FBS içerisinde yeniden süspande edin ve büyük doku kümelerinin çökmesini bekleyin. Ardından süpernatantı yeni bir 100 milimetrelik kaba aktarın ve sinoviyositleri 37 °C ve %5 CO2 ortamında 14 gün boyunca inkübe edin. Sinoviyosit kültürünü genişletmek için kullanılmış besiyerini boşaltın ve hücreleri 5 mililitre PBS ile yıkayın.PBS'yi uzaklaştırın ve hücreleri 1 mililitre EDTA ile hücre kültürü inkübatöründe 2 dakika boyunca disosiye edin. İnkübasyonun sonunda, kalan yapışkan hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe vurun ve elde edilen hücre süspansiyonunu santrifüj için 15 mililitre konik tüpe aktarın. Peleti 30 mililitre DMEM ve FBS içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri 3 yeni 100 milimetrelik plaka arasında paylaştırın.Sinoviyositleri her 3 günde bir taze besiyeri ile besleyin ve hücreler %80 konfluense ulaştığında, az önce gösterildiği gibi hücreleri 3 yeni kültüre bölün. Transdüksiyonun sıfırıncı gününde, kuyu başına 3 x 10⁴ FLS'yi, taze büyüme besiyeri içeren 6 kuyucuklu bir plakaya ekleyerek 37 °C ve %5CO2 ortamında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, 4 Yamanaka faktörü içeren 1 viyal Lenti-virüsü 4 °C'de çözdürün ve FLS kültür besiyerini, heksadimetrin bromür ve askorbik asit ile desteklenmiş FLS büyüme besiyeri ile değiştirin.Flakon içeriği çözündüğünde, hücrelere 30 µL lenti-virüs ekleyin ve virüsün homojen şekilde dağılması için nazikçe karıştırın. Enfeksiyonu iyileştirmek için plakayı santrifüjleyin ve hücreleri inkübatöre geri yerleştirerek ortamı 3 gün boyunca her gün sodyum bütirat ve askorbik asit içeren taze FLS büyüme ortamı ile değiştirin. 4. günde, ortamı sodyum bütirat ve askorbik asit içeren FLS büyüme ve iPSC ortamı karışımı ile değiştirin.5. günde, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 6 mililitre PBS'ye 60 mikrolitre vitronektin ekleyin ve 6 kuyucuklu bir plakanın 3 kuyucuğunu, oda sıcaklığında en az bir saat boyunca her birine 2 mililitre çözelti dökerek kaplayın. Vitronektin yerleşirken, transduksiyon yapılmış hücreleri PBS ile yıkayın ve gösterildiği gibi EDTA ile ayırın. Santrifüjle ayrıştırılmış hücreleri topladıktan sonra, pelletini 900 mikrolitre taze besiyerinde yeniden süspande edin.Kuyucuklardaki fazla vitronektini uzaklaştırın ve ayrı kuyucuklara 300, 150 ve 100 mikrolitre hücre ekleyin. Ardından hücreleri inkübatöre geri koyun ve koloniler görünene kadar besiyerini her gün taze iPSC besiyeri ile değiştirin. Kolonileri seçmek için, önce vitronektin kaplı 48 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna, ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 500 mikrolitre iPCS besiyeri ekleyin.Ardından, FLS kültürlerini temiz bir bench üzerindeki diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve ilgilenilen bir koloninin etrafını kesmek için 10 µL pipet ucu kullanın. 200 µL pipet ucu kullanarak, seçilen koloniyi 48 kuyucuklu plakanın bir kuyuğuna aktarın. Tüm koloniler seçildiğinde, koloniler aktarım için yeterli büyüklüğe ulaşana kadar plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Koloniler, 100X büyütmede bakıldığında mikroskobun görünür alanı dışına çıktığında hücrelerin bölünmesi. Bu görüntüde, ilk 14 günlük kültürden sonra izole edilen FLS'lerin morfolojisi gözlemlenebilir. Hücreler genel olarak fibroblast özelliklerini sergilemekte olup, vimentin ve fibronectin fibrotik belirteçlerinin benzer ekspresyonuna ve makrofaj benzeri sinovyosit belirteci CD-68'in düşük ekspresyonuna sahiptir. Yamanaka faktörü lentiviral transdüksiyonundan 8 ila 11 gün sonra, seçilip 5 ila 10 pasaj boyunca amplifiye edilebilecek küçük koloniler belirmeye başlar.Bu romatoid artrit iPSC'leri, farklılaşmamış kaldıklarını gösteren alkalin fosfataz eksprese ederler. Hücreler ayrıca, RT-PCR ve immünofloresan analizle doğrulandığı üzere pluripotent belirteçler eksprese etmektedir. Romatoid artrit iPSC'leri, karyotipleme ile belirlendiği üzere 44+XY şeklinde normal bir kromozomal patern sergiler.Ayrıca, SCID farelerine enjekte edildikten 12 hafta sonra, romatoid artrit iPSC'leri, çeşitli doku fenotipleri sergileyen teratomlar oluşturmuştur. Germ tabakası farklılaşmaları immunofloresan boyama ile doğrulanmıştır. Bu yöntem ustalaştığında, sinovyumdaki FLS'lerden iPSC'ler üretilebilecektir.Videoyu izledikten sonra, sinovyal dokudan izolasyonun nasıl yapıldığını ve bunlar kullanılarak yeniden programlamanın nasıl tetiklendiğini daha iyi anlamış olmalısınız. RAF-FLS türevli bu iPSC'ler, romatolojide rejenerasyon çalışmalarında veya ilaç taramalarında faydalı olabilir. Bu iPSC'ler oluşturulduktan sonra, çeşitli hedef hücre türleri veya organlar üretilebilir.Hastalığın incelenmesinde veya gen düzenleme gibi diğer gelecekteki uygulamalarda faydalı olabilir.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-using-fibroblast-like

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Biz, insan faktörleri Oct4, Sox2, Nanog ve Lin28 lentivirüs aracılı teslim kullanarak insan somatik hücre alınan uyarılmış pluripotent kök hücreleri üretimi için protokol göstermektedir. Pluripotency morfolojisi ve embriyonik kök (ES) hücre-spesifik belirteçler varlığı teyit edilmiştir.

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

Biz retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan vektörler ve canlı boyama ile doğru yeniden programlanması hiPSC belirlenmesi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) Tra-içine insan somatik hücre verimli yeniden programlama için bir protokol sunmak 1-81 antikor.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Bu video, farelerde otoimmün artrit için hücre bazlı bir tedaviyi göstermektedir. Ovalbümin spesifik reseptörlerini eksprese eden iPSC'den türetilmiş T düzenleyici hücrelere, bir adjuvan içinde emülsifiye edilmiş metillenmiş sığır serum albümini (mBSA) enjekte edilir. Murin antijen sunan hücreler (APC'ler) mBSA'yı işler ve T hücrelerine sunar, bu da T hücresi aktivasyonunu ve diz ekleminin sinovyal zarına göçü tetikler. Sonraki enjeksiyonlar sol dizde tek başına mBSA'yı ve sağ dizde mBSA ve...

Bir Murin Modelinde Otoimmün Artrit için Hücre Bazlı Bir Tedavi

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Burada, bir murin modelinde otoimmün artritin immünoterapisi için indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) fonksiyonel antijene (Ag) özgü düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) geliştirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Gelecekteki hastalığı modelleme uygulamaları olan kimyasal olarak tanımlanan koşullarda, burada İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre farklılaşma içine her somite türev (myotome, sclerotome, dermatome ve syndetome) için bir iletişim kuralı mevcut ve Ortopedik cerrahi hücre tabanlı terapiler.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

Bu çalışma, sinovyal makrofajları ve fibroblastları murin inflamatuar artrit dokusundan izole etmek için modifiye edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Murin Artrit Dokusundan Primer Sinovyal Makrofaj ve Fibroblastların İzolasyonu ve Kültürü

Bu makale, bir lentiviral vektör ve bir 2D biyoreaktör aracılığıyla tek eksenli germe kullanarak Skleraxis'in kombine aşırı ekspresyonu ile iPSC'den türetilmiş mezenkimal stromal hücreler üreterek iTenositler üretme prosedürünü açıklamaktadır.

Kombine skleraksi aşırı ekspresyonu ve 2D tek eksenli gerilim yoluyla indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı iTenositlerin üretilmesi

Sinovyumda akut iltihap, bulaşıcı ve yapısal değişiklikleri değerlendirebilen insan ex vivo transwell sistemi geliştirdik.

Korunmuş fonksiyon ve mimariyle ex vivo insan sinovyal dokusu kullanılarak sinovitin klinik öncesi modeli

Keşfedin, romatoid artrit hastalarından izole edilen fibroblast benzeri sinoviyositlerden besleyici hücre kullanmadan iPSC üretim protokolünü. Lentiviral sistemle hücre yeniden programlama yöntemini öğrenin.

Romatoid Artrit Hastalarının Mafsallar İzole fibroblast benzeri sinoviyosit kullanma Kaynaklı-pluripotent Kök Hücre Üretimi

Daha fazla video keşfet