Romatoid Artrit Hastalarının Mafsallar İzole fibroblast benzeri sinoviyosit kullanma Kaynaklı-pluripotent Kök Hücre Üretimi

Bu deneyin genel amacı, romatoid artrit iltihaplı bir eklemin sinovyal dokusundan izole edilen fibroblast benzeri sinoviyositlerden indüklenmiş pluripotent kök hücreler veya IPC'ler üretmektir. Şu anda, iPSC'ler çeşitli insan birincil hücrelerinden üretilebilir. Romatoid eklemlerin anahtar patolojik hücreleri olan insan fibroblast benzeri sinoviyositlerden iPSC'leri başarıyla ürettik.

Bu, romatoid artrit patolojisini araştırmaya yardımcı olabilir. Bu süreli yayın, RA-FLS'leri kullanarak IPSC'lerin dejenerasyonu ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Sinovyal dokuyu 100 milimetrelik bir tabağa yerleştirerek ve dokuyu antibiyotiklerle takviye edilmiş 5 mililitre PBS ile yıkayarak başlayın.

Sarımsı yağ dokusunu ve kemik kalıntısını çıkarın. Daha sonra kesilmiş dokuyu, FBS ile takviye edilmiş 5 mililitre DMEM içeren altı oyuklu bir plakanın bir oyuğuna aktarın ve parçalar tek kullanımlık bir pipet ucuna nüfuz edecek kadar küçük olana kadar dokuyu kıymak için makas kullanın. Ortamı 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın, daha sonra kalan dokuyu toplamak ve tüm kuyu içeriğini tüpe aktarmak için kuyuya 5 mililitre taze DMEM artı FBS ekleyin.

Daha sonra, tüpe% 0.01'lik bir nihai konsantrasyona buzla çözülmüş kollajenaz ekleyin ve tüpü 37 santigrat derece su banyosunda çalkalayarak inkübasyon için parafilm ile kapatın. Dört saat sonra, tüpü taze DMEM artı FBS ile 50 mililitrelik son hacme kadar doldurun ve doku parçalarını santrifüjleme ile toplayın. Peletleri bozmadan süpernatanı çıkarın, ardından hücreleri başka bir santrifüjleme için 40 mililitre taze ortamda yeniden süspanse edin.

İkinci peleti 25 miillitre taze DMEM artı FBS'de yeniden süspanse edin ve büyük doku kümelerinin çökelmesine izin verin. Daha sonra süpernatanı 100 milimetrelik yeni bir tabağa aktarın ve sinoviyositleri 14 gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Sinoviyosit kültürünü genişletmek için kullanılan ortamı atın ve hücreleri 5 mililitre PBS'de yıkayın.

PBS'yi çıkarın ve hücreleri hücre kültürü inkübatöründe 1 mililitre EDTA ile 2 dakika boyunca ayırın. İnkübasyonun sonunda, kalan yapışkan hücreleri ayırmak için tabağa hafifçe vurun ve elde edilen hücre süspansiyonunu santrifüjleme için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Peletleri 30 mililitre DMEM ve FBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri 3 yeni 100 milimetrelik tabağa bölün.

Sinoviyositleri her 3 günde bir taze ortamla besleyin ve hücreleri az önce gösterildiği gibi% 80 birleşme ile 3 yeni kültüre bölün. Transdüksiyon Sıfırıncı Günde,% 5 CO2'de 37 santigrat derecede bir gece inkübasyonu için taze büyüme ortamında 6 oyuklu bir plaka üzerine kuyu başına 3 x 10 ila 4. FLS'ye bakın. Ertesi gün, 4 santigrat derecede 4 Yamanaka faktörü içeren 1 şişe Lenti-virüsü çözün ve FLS kültür ortamını heksadimetrin bromür ve askorbik asit ile desteklenmiş FLS büyüme ortamı ile değiştirin.

Flakon içeriği çözüldüğünde, hücrelere 30 mikrolitre lenti-virüs ekleyin ve virüsü homojen bir şekilde dağıtmak için hafifçe karıştırın. Enfeksiyonu iyileştirmek için, plakayı santrifüjleyin ve hücreleri inkübatöre geri koyun, ortamı her gün 3 gün boyunca sodyum bütirat ve askorbik asit içeren taze FLS büyüme ortamı ile değiştirin. 4. günde, ortamı sodyum bütirat ve askorbik asit içeren bir FLS büyümesi ve iPSC ortamı karışımı ile değiştirin.

5. günde, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 6 mililitre PBS'ye 60 mikrolitre vitronektin ekleyin ve oda sıcaklığında en az bir saat boyunca her biri 2 mililitre çözelti ile 6 oyuklu bir plakanın 3 kuyusunu kaplayın. Vitronektin sertleşirken, dönüştürülen hücreleri PBS ile yıkayın ve gösterildiği gibi EDTA ile ayırın. Ayrışmış hücreleri santrifüjleme ile topladıktan sonra, peleti 900 mikrolitre taze ortamda yeniden süspanse edin.

Fazla vitronektini kuyucuklardan çıkarın ve ayrı ayrı kuyucuklara 300, 150 ve 100 mikrolitre hücre ekleyin. Daha sonra hücreleri inkübatöre geri koyun, koloniler görünene kadar ortamı günlük olarak taze iPSC ortamı ile değiştirin. Kolonileri toplamak için, önce vitronektin kaplı 48 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş 500 mikrolitre iPCS ortamı ekleyin.

Daha sonra, FLS kültürlerini temiz bir tezgah üzerinde diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve ilgilenilen bir koloniyi kesmek için 10 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak, toplanan koloniyi 48 oyuklu plakanın 1 oyuğuna aktarın. Tüm koloniler toplandığında, koloniler transfer için yeterince büyük olana kadar plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

100X büyütmede görüldüğü gibi, koloniler mikroskobun görünür alanının dışına çıktığında hücrelerin bölünmesi. Bu görüntüde, ilk 14 günlük kültürden sonra izole edilen FLS'nin morfolojisi gözlemlenebilir. Hücreler genel olarak fibroblastların özelliklerini sergiler fibrotik belirteçler vimentin ve fibronektinin benzer bir ekspresyonu ve makrofaj benzeri sinoviyosit markörü CD-68.8'in düşük ekspresyonu ile Yamanaka faktörü lenti-viral transdüksiyonundan 11 gün sonra, 5 ila 10 geçiş için toplanabilen ve çoğaltılabilen küçük koloniler ortaya çıkmaya başlar.

Bu romatoid artrit iPSC'ler eksprese alkalen fosfatazları farklılaşmamış kaldıklarını gösterir. Hücreler ayrıca RT-PCR ve immünofloresan analizi ile onaylanan pluripotent belirteçleri de eksprese eder. Romatoid artrit iPCS'ler, karyotipleme ile belirlendiği gibi 44 + XY'lik normal bir kromozomal patern sergiler.

Furthur, SCID farelerine enjeksiyonlarından 12 hafta sonra, romatoid artrit iPSC, çeşitli doku fenotipleri gösteren teratomu oluşturdu. İmmünofloresan boyama ile onaylanan germ tabakası farklılaşması ile. Bir kez ustalaştıktan sonra, iPSC'ler sinovyumlu FLS'lerden oluşturulabilir.

Videoyu izledikten sonra, sinovyal dokudan nasıl izole edileceğini ve bunları kullanarak yeniden programlamayı nasıl indükleyeceğinizi daha iyi anlamalısınız. Bu RAF-FLS'den türetilen iPSC'ler, romatolojide rejenerasyon veya ilaç taraması çalışmak için yararlı olabilir. Bu iPSC'ler kurulduktan sonra, çeşitli türlerde hedef hücreler veya organlar oluşturulabilir.

Bu, hastalığı veya gen düzenleme ve benzeri gibi gelecekteki diğer uygulamaları incelemek için yararlı olabilir.