Mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve Kemik İliği Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Hücresel Fenotiplendirme

Bu prosedürün genel amacı, rejenerasyon ve immünomodülasyon çalışmalarında kullanılacak mezenkimal kök hücreleri toplamak amacıyla minipiglerden sinovyal sıvı ve kemik iliğinin non-invaziv yöntemlerle toplanmasıdır. Bu yöntem, sinovyal sıvıda MSC'lerin nasıl kurulacağı ve kemik iliği MSC'leri ile karşılaştırmalı olarak nasıl karakterize edileceği gibi otolog MSC tedavisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hastalarda uygulanması için faydalı olacak şekilde, minipiglerden elde edilen sinovyal sıvı ve kemik iliği kaynaklı MSC'lerin temel özelliklerinin etkili bir şekilde belirlenmesini sağlamaktır.

Bu tekniğin etkileri çeşitli eklem hastalıklarının tedavisine kadar uzanmaktadır, çünkü atletik hastalarda sinovyal boşluktaki sinovyal sıvı kaynaklı MSC popülasyonu önemli ölçüde artmaktadır. Bu yöntem rejeneratif tıp hakkında bilgiler sağlayabilmenin yanı sıra, otoimmün hastalık araştırmaları gibi diğer çalışmalara da uygulanabilir. Minipig MSC'ler otolog olduğu için, immünsupresyon insanlar için ilgi çekici olabilir.

Diğer bilim insanlarının yanı sıra, prosedürü üçüncü seviyemden Hyeon-Jeong Lee ve Won-Jae Leele gösterecektir. Başlamak için, iliak kanada erişmek amacıyla anestezi uygulanmış bir minipig'i konumlandırın. Ardından, bir jilet veya tıraş makinesi kullanarak iliak kanatta 15 santimetrekarelik bir bölgeyi tüysüz hale getirin.

Ardından, açığa çıkan cildi sırasıyla üç kez povidon-iyot ve %70 etanol ile fırçalayarak temizleyin. Tamamen kuruduktan sonra steril örtüleri uygulayın. Şimdi, on mililitrelik bir şırıngayı üç ila dört mililitrelik bir durulama kullanarak heparin ile ön kaplamadan geçirin.

Bu işlem, kemik iliğinin çıkarılma sırasında pıhtılaşmasını önleyecektir. Ardından, tam olarak iliak kemik kristasına, heparin kaplı şırıngaya bir kemik iliği ekstraktörü sıkıca takın ve en az beş mililitre kemik iliği çıkarın. Çıkarılan kemik iliğinden hücreleri izole etmek için, öncelikle kemik iliğini oda sıcaklığında 15 mililitrelik konik bir tüp içerisinde eşit hacimde DPBS ile seyreltin.

Ardından, ikinci bir 15 ml'lik konik tüpe üç mililitre yoğunluk santrifüj ortamı yükleyin. Daha sonra, iki çözelti katmanı oluşturmak için seyreltilmiş kemik iliğinin dört mililitresini dikkatlice yoğunluk santrifüj ortamının üzerine aktarın. Şimdi, tüpü oda sıcaklığında 400 G'de 40 dakika boyunca santrifüjleyin.

İstenen MNC'ler merkezi beyaz tabakada toplanır. Sadece bu tabakayı aspire edin. MNC tabakasını 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve yedi ila sekiz mililitre DPBS ile seyreltin.

Ardından, hücreleri oda sıcaklığında on dakika boyunca 500 Gs ile santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve peletlenmiş hücreleri, önceki santrifüj döngüsünü tekrarlayarak on mililitre DPBS ile iki kez yıkayın. İki yıkamanın ardından, MNC'leri iki mililitre ADMEM içinde süspande ediyoruz.

Ardından, hücreleri 35 mm'lik bir doku kültürü plağına aktarın ve nemlendirilmiş %5 karbon dioksitli bir inkübatörde 38,5 °C'de inkübe edin. 48 saat sonra, yapışmamış MNC'ler ile birlikte besiyerini aspire edin. Daha sonra, iki mililitre taze ADMEM ekleyin ve besiyerini her üç günde bir değiştirerek inkübasyona devam edin.

Hücreler %70 ila %80 konfluense ulaştığında, kültürü taze DPBS ile yıkayın. Ardından, 37 °C'de üç ila beş dakika boyunca bir mililitre %0,25 Trypsin-EDTA kullanarak hücreleri disosiye edin. Hücreleri on mililitre ADMEM içinde toplayın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Ardından, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 Gs'de santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Şimdi, toplanan MNC'leri bir mililitre taze ADMEM içinde süspande edin ve yoğunluklarını ölçün. İşlemi, T25 flasklara dört mililitre ADMEM ile 1/2 ile üç çeyrek milyon arasında hücre ekerek tamamlayın.

Flaskları tıpkı plaklar gibi inkübe edin ve besiyerini her üç günde bir değiştirin. Kemik iliği toplama hazırlığında yapıldığı gibi, femoral eklem üzerinde 15x10 santimetrelik bir deri kesisi hazırlayın. Ardından, sinovyal eklemi belirlemek için deri altındaki patella ve tibia kretlerini palpe edin ve 23-gauge iğneli, üç mililitrelik bir şırıngayı tam eklem içine yerleştirin.

Hafif bir vakum kullanarak 1/2 ile bir mililitre arasında sıvı ekstrakte edin ve iğneyi hemen geri çekin. Sinoviyal sıvı hacmi çok düşükse, DPBS ile sinoviyal sıvı toplamak için boşluğu DPBS ile yıkayın. Kullanılacak DPBS hacmi, sinoviyal boşluğun boyutuna göre değişir.

Sağlıklı eklemlerde optimal sinovyal sıvı hacmi sınırlıdır. Hacim, eklemin boyutuna ve patolojik durumuna göre değişiklik gösterir. Sinovyal sıvıdan hücreleri izole etmek için, sıvıyı oda sıcaklığında 15 ml'lik konik bir tüp içerisinde eşit hacimdeki DPBS ile seyreltin.

Sırada, seyreltmeyi 40 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden geçirerek kalıntıları temizliyoruz. Ardından, on mililitre daha DPBS ekleyin ve süspansiyonu oda sıcaklığında on dakika boyunca 400 Gs'de santrifüjleyin. Sonrasında, süpernatantı atın ve hücreleri DPBS kullanarak iki kez yıkayın.

Yıkanmış hücre peletini iki mililitre ADMEM içinde süspande ediyoruz. Ardından, MSC'lerde gösterildiği şekilde hücrelerin kültüre edilmesine geçiyoruz. MSC'ler, minipiglerin kemik iliğinden ve eklem sinovyal eklemlerinden başarıyla izole edilmiş ve in vitro ortamda genişletilmiştir.

Sinovyal sıvı kaynaklı MSC'lerin morfolojisi, kemik iliği kaynaklı MSC'lerin morfolojisine benzerdir: her ikisi de fibroblastik iğ şeklinde bir yapıya sahiptir ve homojen şekilde yapışıklardır. MSC'ler, üçüncü alt kültür tamamlandıktan sonra alkalen-fosfataz boyaması için pozitif ekspresyon göstermiştir. Ardından, her iki kültürde yüzey markerları analiz edilmiştir.

Beklendiği üzere, her iki MSC tipi de CD29, CD44 ve Vimentin'i anlamlı düzeyde eksprese etmiştir. Buna karşılık, CD34 ve CD45 ekspresyonları negatif ve düşük seyretmiştir. Bu sonuçlar, sinovyal sıvıdan izole edilen hücreler de dahil olmak üzere farklı MSC'ler aracılığıyla elde edilen sonuçlarla aynıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, minipiglerden MSC'lerini izole etmek amacıyla sinovyal sıvı ve kemik iliğinin invaziv olmayan yollarla nasıl aspire edileceğini, ayrıca bu MSC'lerin karşılaştırmasının ve fenotiplemesinin nasıl yapılacağını iyi bir şekilde kavramış olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, iliak kanat üzerindeki hedef noktanın ve sinovyal eklemin dikkatli palpasyonla belirlenerek konumlandırıldığından emin olmak önemlidir. Bu prosedürün ardından, sadece kemik iliği MSC'lerinin değil, sinovyal sıvı MSC'lerinin de kıkırdak veya kemik oluşumu ile immünosüpresyon için benzer kapasiteye sahip olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, osteoartrit veya romatoid artrit modellerindeki gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu teknik, geliştirilmesinin ardından, artrit hastalarında etkilenmiş veya iltihaplanmış eklemlerden türetilen MSC'lerin karakterize edilmesine yardımcı olarak eklem hastalıklarının otolog tedavisini ilerletmiştir.