Name: Mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve Kemik İliği Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Hücresel Fenotiplendirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Öğrenin mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve kemik iliğinden mezenkimal kök hücre izolasyonu ve fenotiplendirme yöntemini. Bu protokol rejeneratif tıp ve immünomodülasyon çalışmaları için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yeni Nesil BioGreen 21 Programı tarafından sağlanan finansal desteği minnetle kabul ediyoruz (No. PJ007969), Kırsal Kalkınma İdaresi ve Ulusal Araştırma Vakfı (hibe no. NRF-2015R1D1A1A01056639) Kore Cumhuriyeti'nin.

Hayvan deneyleri Gyeongsang Ulusal Üniversitesi Biyomedikal Deney için hayvan Merkezi tarafından onaylanmıştır. Hayvan Prosedür 1. Hazırlıklar <ol><li> kemik iliği ve sinoviyal sıvıdan MKH non-invaziv toplama yetişkin dişi mini-domuzlarda hazırlayın. Anestezi ve örnek koleksiyonuna bir gün önce mini-domuzlarda klinik muayene gerçekleştirin. <ol><li> tam kan sayımı testleri kullanılarak vücut ısısı, solunum hızı ve kalp hızı ve domuz davranışları ve hematolojik durumların gözlenmesi için dahil fizik muayene, klinik olarak normal bir hayvan sağlayın. Not: klinik olarak sağlıklı mini-domuzlarda için parametre aralıkları 11 olan - solunum hızı 29 / dk, 68 - kalp hızı için 98 / dk ve 37 - vücut sıcaklığının 38 ° C. </li></ol></li><li> 12 saat prio - 6 ameliyat öncesi açlık süresi boyunca kafesinden tüm yenilebilir yatak kaldırGenç ve yetişkin mini-domuzlarda anestezi idaresine r açlık 3 saat yenidoğanlar için dikkat edilmelidir. Anestezi zamanına kadar içme suyu sağlamak. </li></ol> Anestezi için Animals 2. Hazırlık <ol><li> asepromazin (0.1 mg / kg), medetomidin (0.03 mg / kg) ve atropin (0,04 mg / kg) ile anestezi uygulanmadan önce mini-domuzlarda ilaçla tedavi. <ol><li> Yetişkin mini-domuzlarda için en az 30 mm bir uzunluğa sahip olan bir 21 G iğne kullanılarak tüm ilaçlar kas içinden (İM) enjekte edilir. Lateral servikal kas içine ya da uyluk kası içine IM enjeksiyonu kulak arkasında 1-3 cm gerçekleştirin. Not: Hayvanlarda korku ya da stres eliciting veya güvenli premedikasyon enjekte kaba işleme gerek kalmadan tüm işlemleri gerçekleştirin. </li></ol></li><li> dorsal yatar pozisyonda mini-domuzlarda yerleştirin. </li><li> Onbeş dakika premedikasyon verilmesinden sonra,% 1.5 izofluran yönetici kullanarak anestezi başlatmakTeneffüs yoluyla listesinde de¤ildir. <ol><li> Taşıyıcı gaz olarak oksijen ile% 2.5 konsantrasyonunda bir artışa ve ardından bir endotrakeal tüp aracılığıyla izofluran (% 1.5) ve inhalasyon, (1.5 L / dakika) devam edin. </li></ol></li><li> Sürekli anestezi sırasında mini-domuzlarda kalp hızı, vücut ısısı ve perkütan kan oksijen doygunluğu (SpO2) izler. vücut ısısını korumak için 39 ° C - 38 arasında bir sıcaklıkta bir dolaşım suyu battaniye kullanın. anestezi sırasında kurumasını gözleri korumak için bir göz merhemi sürün. </li><li> Anestezi 13 derinliğini değerlendirmek için guedel tasnifini izleyin. </li></ol> Hücre İzolasyonu ve Yetiştirme 3. Hazırlıklar <ol><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş, gelişmiş Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle ortamında (ADMEM),% 1 Glutamax 500 ml temel fibroblast büyüme fiili 10 ng / ml hazırlanması, kemik iliği ve sinoviyal sıvıdan alınan MKH&#39;lerin yetiştirmeyeR (bFGF) ve% 1.0 penisilin-streptomisin (sırasıyla 10,000 IU 10,000 ug / ml, Pen-Strep). <ol><li> CO2 inkübatör içerisindeki% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 38.5 ° C &#39;de ADMEM inkübe edin. </li></ol></li><li> Hücre İzolasyonu ve yıkama için imalatçının talimatlarına uygun olarak Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) 500 ml hazırlayın. </li></ol> 4. mini-domuzlarda Kemik İliği Toplama <ol><li> Bir alanı iliak (Şekil 1) boyutu yaklaşık 15 x 15 cm seçin ve sterilize güvenlik jilet veya elektrikli kesme makineleri kullanarak bu alandan saç kaldırmak. povidon iyot ve% 70 etanol: MiniPig yerleştirildikten sonra, alternatif olarak prosedürü site aşağıdaki sterilizasyon maddeleri ile üç kez bodur. Alan tamamen kuru sonra, steril örtüler uygulayın. </li><li> Ön kaplama 3 ile durulama ile, heparin, 100 U / ml, 10 ml şırınga - ejec önce heparin 4 mlting, anti-pıhtılaştırıcı ajan. Not: Kemik iliği aspirasyon sırasında şırınga pıhtılaşmayı önlemek için bu adımı gerçekleştirin. </li><li> sıkı heparin önceden kaplanmış 10 mi şırınga bağlı kemik iliği çıkarıcı (3.0 x 100 mm) kullanılarak, anestezi altında Minipig iliak kemikten kemik iliği, 5 ml, en az ekstrakte edin. </li></ol> Kemik İliği gelen ve In Vitro Tarımında olarak Çıkarılan Hücreler 5. İzolasyon <ol><li> çıkarılan kemik iliği hücreleri izole. <ol><li> Oda sıcaklığında 15 ml konik bir tüp içinde DPBS eşit hacimde ekstre kemik iliği seyreltilir. </li><li> 15 ml konik tüp yoğunluk santrifüj medya (Ficoll Paque) 3 ml ekleyin. </li><li> oda sıcaklığında 40 dakika boyunca 400 x g&#39;de 4 mi karıştırılmadan yoğunluk santrifüj ortama yerleştirilir DPBS ile kemik iliği, bir tabaka ve santrifüj seyreltik. </li><li> tek-çekirdekli hücre tabakasının HasatPlazma (üst katman) ve yoğunluk santrifüjleme ortamı (alt katman) içeren iki tabaka arasında ince beyaz kaplamadan (MNC) ve 15 ml konik bir tüp içine ÇUŞ&#39;larına aktarın. </li><li> 7 ile aktarılan ÇUŞ&#39;larına seyreltilir - DPBS 8 ml ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj. Süpernatantı atın ve DPBS ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> ADMEM 2 ml hücre pelletini askıya alma ve 35 mm doku kültürü çanağı aktarın. % 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 38.5 ° C &#39;de kültür çanağı inkübe edin. </li></ol></li><li> Kemik iliğinden izole edilmiş hücrelere in vitro kültivasyonu olarak. <ol><li> 48 saat sonra, çanak bağlı olan hücreler ile orta havalandırın, ve ADMEM 2 ml yerine ve% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 38.5 ° C &#39;de inkübe edilir. her üç günde orta değiştirin. </li><li> 70 &#39;de -% 80 birleşme,% 0.25 ile 1 ml çözünmelerini, DPBS ile yıkama hücreleriHücreler ayrılana kadar 5 dakika - tripsin / EDTA ve 3 37 ° C de inkübe. </li><li> ADMEM 10 ml kullanarak hücreleri hasat 15 ml konik bir tüp içine transfer edildi ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj. süpernatant atın. </li><li> Taze ADMEM 1 ml hasat hücreleri askıya alma ve bir hemasitometre kullanarak onları saymak. </li><li> 5 hücreleri yerleştirin - ADMEM 4 ml içeren 7.5 x 10 5 / 25T şişeye ve% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 38.5 ° C&#39;de inkübe. Her üç günde bir orta değiştirin. </li></ol></li></ol> Mini-domuzlarda gelen Akışkan SİNOVYAL 6. Koleksiyonu <ol><li> Kemik iliği aspirasyonu için prosedüre benzer, femoral eklem üzerinde yaklaşık 15 x 10 cm (uzunluk / genişlik) uygun bir alan seçin ve sterilize güvenlik jilet veya elektrikli kesme makineleri kullanarak tüylerden, sanitization prosedürleri (adım 4.1) ile izleyin. </li><li> 23 G ile 3 ml şırınga takınpalpasyon yerlerinden (patella ve tibia kret) sonra eklem içine iğne. <ol><li> eklemde sinoviyal sıvının aspirasyonu şırınga nazik vakum uygulayın. 1 mi, ancak bu Minipig veya eklem büyüklüğüne göre değişir - eklem toplanan sinoviyal sıvı, yaklaşık hacmi 0,5. sinoviyal sıvı toplanan hacmi çok küçük ise sinovyal boşluğunda DPBS ile yıkayın. </li><li> Hemen kanla kirlenmesini önlemek için şırınga geri çekin. </li></ol></li></ol> Toplanan Sinovyal Sıvı gelen ve In Vitro Tarımında 7. Hücre İzolasyonu <ol><li> Aspire sinoviyal sıvıdan hücreleri izole. <ol><li> Oda sıcaklığında 15 ml konik bir tüp içinde DPBS eşit hacimde aspire sinoviyal sıvı seyreltilir. </li><li> enkaz kaldırmak için, 40 mikron naylon hücre süzgeci kullanılarak seyreltilmiş sinoviyal sıvıyı filtre. </li><li> süzüldü sinovyal içeren tüp DPBS 10 mlSıvı ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj o. Süpernatantı atın ve DPBS ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> Bir 2 hücreleri yer, ADMEM 2 ml hücre pelletini Askıya - ADMEM 2 ml 3 x 10 5 hücre / 35 mm doku kültürü çanağı ve% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 38.5 ° C&#39;de inkübe . </li></ol></li><li> İzole eklem sıvısı kaynaklı MKH in vitro ekimi için yineleyin 5.2. </li></ol> Mini-domuzlarda 8. Sonrası prosedür Bakımı <ol><li> Gerekirse, kemik iliği toplandıktan sonra, bir deri zımba kullanarak tek bir sütür ile kemik iliği çıkarıcı enjeksiyon yerinde cilt kapatın. </li><li> Prosedür tamamlandıktan sonra, 3 gün boyunca, günde bir kez mini-domuzlarda için enrofloxacin (5 mg / kg) ve meloksikam (0.2 mg / kg) damar içi idare ederler. </li><li> Prosedür tamamlandıktan sonra, kemik iliği ve sinovyal sıvı toplama site dezenfekte% 0.1 povidon iyot kez 3 gün boyunca bir gün. Dikkatle komplikasyonların belirtileri (örneğin, şişme, iltihap veya kızarıklık) izlemek için her gün görmekteyiz. </li></ol> Akım Sitometri Kullanımı 9. Hücre Fenotiplendirme <ol><li> geçitler 3% 80 konfluent - 5 - DPBS hücreleri yıkayın ve% 0.25 (h / h) tripsin / EDTA, 1 ml ile tedavi MSC&#39;ler 70 olduğunda. Hücreler müstakil kadar 5 dakika - sonra, 3, 37 ° C&#39;de inkübe. </li><li> DPBS 10 ml kullanarak hücrelerin hasat, 15 ml konik tüp içine aktarmak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g santrifüj. süpernatant çözüm atın. </li><li> hücreleri düzeltmek için, bir% 3.7 formaldehid çözeltisi, 10 ml hücre pelletini askıya ve analiz bir gün önce, 4 ° C &#39;de muhafaza edin. <ol><li> Bir gün sabitleme sonra, DPBS kez 5 dakika her zaman için 300 × g santrifüj kullanılarak hücreleri yıkayın. süpernatant çözüm atın. </li><li> 4 ml hücre pelletini Askıya% 1 sığır serum albümini (ağ / hac) (BSA) ile desteklenmiş ve spesifik olmayan Fc ile aracılık edilen etkileşimi engellemek için 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca pelet inkübe edilir DPBS, bir. </li><li> 1.5 ml tüpler içine hücre süspansiyonu 500 ul alikotları dağıtın. </li><li> Birleştirilmiş-olmayan antikorları (CD29 ve Vimentin) için, 3 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler yıkayın. süpernatant çözüm atın. </li><li> 1 500 ul hücre pelletini askıya alınması: birincil antikor, 100 seyreltme ve 4 ° C sıcaklıkta 1 saat için kuluçkalayın. </li><li> 5 dakika, her seferinde 300 x g&#39;da santrifüjleme ile% 1 sığır serum albümini ile hücreler iki kez yıkanır. süpernatant çözüm atın. </li><li> İkincil antikor ile konjüge edilmiş flöresin izotiyosiyanat (FITC), 100 seyreltme ve 4 ° C de karanlıkta 1 saat süreyle inkübe bir 1: 500 ul hücre pelletini süspanse edin. </li></ol></li><li> FITC-konjuge antikor (İzotip, CD34, CD44 ve CD45) için, Santrifüj hücreleri yıkayın3 dakika boyunca 300 x g&#39;de gasyon. süpernatant çözüm atın. <ol><li> 1 500 ul hücre pelletini askıya alınması: 100 FITC ile konjüge edilmiş antikor ile 4 ° C de karanlıkta 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Her iki boyama koşulları için, 5 dakika, her seferinde 300 x g&#39;da santrifüjleme ile DPBS hücreler iki kez yıkayın. süpernatant çözüm atın. </li><li> , DPBS 500 ul hücreleri Askıya 5 ml yuvarlak tabanlı tüp aktarabilirsiniz ve 8 debi sitometresinde analiz sonuçları. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+and+human+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons.</a> J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).</li>
<li>Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+stem+cells+derived+from+various+mesenchymal+tissues%3A+Superiority+of+synovium+as+a+cell+source%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: Superiority of synovium as a cell source.</a> Arthritis Rheum. 52 (8), 2521-2529 (2005).</li>
<li>De Coppi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+fluid+and+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+can+be+converted+to+smooth+muscle+cells+in+the+cryo-injured+rat+bladder+and+prevent+compensatory+hypertrophy+of+surviving+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Amniotic fluid and bone marrow derived mesenchymal stem cells can be converted to smooth muscle cells in the cryo-injured rat bladder and prevent compensatory hypertrophy of surviving smooth muscle cells.</a> J Urol. 177 (1), 369-376 (2007).</li>
<li>Arufe, M. C., De la Fuente, A., Fuentes, I., de Toro, F. J., Blanco, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+potential+of+subpopulations+of+cells+expressing+mesenchymal+stem+cell+markers+derived+from+human+synovial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic potential of subpopulations of cells expressing mesenchymal stem cell markers derived from human synovial membranes.</a> J Cell Biochem. 111 (4), 834-845 (2010).</li>
<li>Patil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+and+proteomic+profiling+of+human+dental+stem+cells+derived+from+a+single+donor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential and proteomic profiling of human dental stem cells derived from a single donor.</a> Exp Cell Res. 320 (1), 92-107 (2013).</li>
<li>Hatsushika, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra+articular+injection+of+synovial+stem+cells+promotes+meniscal+regeneration+in+a+rabbit+massive+meniscal+defect+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Intra articular injection of synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit massive meniscal defect model.</a> J Orthop Res. 31 (9), 1354-1359 (2013).</li>
<li>Hagmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+bone+marrow-+and+synovium-derived+mesenchymal+stromal+cells+from+osteoarthritis+patients+on+regulatory+T+cells+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22ClinExpImmunol%22%5BJournal%5D)">The influence of bone marrow- and synovium-derived mesenchymal stromal cells from osteoarthritis patients on regulatory T cells in co-culture.</a> ClinExpImmunol. 73 (3), 454-462 (2013).</li>
<li>Lee, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+source-dependent+in+vivo+immunosuppressive+properties+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+the+bone+marrow+and+synovial+fluid+of+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell source-dependent in vivo immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs.</a> Exp Cell Res. 333 (2), 273-288 (2015).</li>
<li>Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+distinction+of+iNOS+and+IDO+function+in+mesenchymal+stem+cell-mediated+immunosuppression+in+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic distinction of iNOS and IDO function in mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression in mammalian species.</a> Cell Death Differ. 21 (3), 388-396 (2014).</li>
<li>Jones, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+mesenchymal+stem+cells+in+health+and+early+osteoarthritis%3A+Detection+and+functional+evaluation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: Detection and functional evaluation at the single-cell level.</a> Arthritis Rheum. 58 (6), 1731-1740 (2008).</li>
<li>Morito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+increase+after+intra-articular+ligament+injury+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans.</a> Rheumatology (Oxford). 47 (8), 1137-1143 (2008).</li>
<li>Sekiya, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+in+synovial+fluid+increase+in+the+knee+with+degenerated+cartilage+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis.</a> J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2011).</li>
<li>John, T., Lerche, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohn%2C+T+%22Anesthesia+and+analgesia+for+veterinary+technicians%22">Anesthesia and analgesia for veterinary technicians</a>. , Mosby Elsevier press. St. Louis, Missouri. (2011).</li>
<li>Cooper, D. K., Gollackner, B., Sachs, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Will+the+pig+solve+the+transplantation+backlog%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Will the pig solve the transplantation backlog.</a> Annu Rev Med. 53, 133-147 (2002).</li>
<li>Millard, A. L., Mueller, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+issues+related+to+porcine+xenograft+exposure+to+human+viruses%3A+Lessons+from+allotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22CurrOpin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Critical issues related to porcine xenograft exposure to human viruses: Lessons from allotransplantation.</a> CurrOpin Organ Transplant. 15 (2), 230-235 (2010).</li>
<li>Ringe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+mesenchymal+stem+cells.+Induction+of+distinct+mesenchymal+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct mesenchymal cell lineages.</a> Cell Tissue Res. 307 (3), 321-327 (2002).</li>
<li>Petersen, B., Carnwath, J. W., Niemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perspectives+for+porcine-to-human+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Micro+biol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The perspectives for porcine-to-human xenografts.</a> Comp Immunol Micro biol Infect Dis. 32 (2), 91-105 (2009).</li>
<li>Zeng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+adult+progenitor+cells+from+swine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow.</a> Stem Cells. 24 (11), 2355-2366 (2006).</li>
<li>Zeng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+and+functional+consequences+of+bone+marrow-derived+multipotent+progenitor+cell+transplantation+in+hearts+with+postinfarction+left+ventricular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling.</a> Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).</li>
<li>Sekiya, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+in+synovial+fluid+increase+in+the+knee+with+degenerated+cartilage+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis.</a> J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2012).</li>
<li>Mochizuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+chondrogenic+potential+of+fibrous+synovium-+and+adipose+synovium-derived+cells+compared+with+subcutaneous+fat-derived+cells%3A+Distinguishing+properties+of+mesenchymal+stem+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: Distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans.</a> Arthritis Rheum. 54 (3), 843-853 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Mini-domuzlarda, kemik iliği ve sinoviyal sıvıdan MSC&#39;ler izolasyonu oluşturmak için kullanıldı. yaş, cinsiyet ve hastalık gibi çeşitli fizyolojik koşullar, ortadan kaldırmak için, izogenik arka plan vericilerden mini-domuzlarda doğru hücre kaynağı bağımlı karakterizasyonu değerlendirmek için seçildi. Domuzlar olduğu bilinmektedir anatomik, fizyolojik ve genetik olarak insanlara benzer şekilde, ve özellikle de, boyut eşlemeli organları üretebilir mini-domuzlarda; Bu nedenle, ksenonaklinden 14,15 yerini ve...

Multipotent mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) mezenkimal hücre soyları olarak sınıflandırılabilir ve MSC'ler kemik iliği, göbek kordonları, plasentalar, yağ dokusu, dermal cilt, iskelet kası, kıl folikülleri, sinovyal membranlar ve dişler gibi çeşitli doku kaynaklarından oluşturulmuş ve izole edilmiştir1-5. Şu anda, sinovyal kaynaklı MSC'lere dikkat edilmiştir, çünkü bu hücreler kemik fraksiyonu, osteoartrit ve romatoid artrit (RA) gibi eklem hastalıklarının tedavisine yardımcı olabilir ve MSC'lerin hasarlı kıkırdak veya kemikteki rejeneratif potansiyeli nedeniyle, ayrıca bağışıklık modülasyonu veya otoimmün hastalıkların tedavisine yardımcı olabilirler6-8. Sinovyal kaynaklardan türetilen MSC'lerin araştırmalarının çoğu, sinovyal sıvıdan ziyade sinovyal zardan MSC'leri kullanmıştır2,9; bu nedenle, sinovyal sıvı kaynaklı MSC'lerin biyolojik anlayışı sınırlıdır.
Sinovyal sıvı, hastaların tanıları veya tedavileri sırasında ve osteoartrit veya RA gibi invaziv prosedürler gerektirmeyen çeşitli artrit durumlarının tanısal onayları sırasında aspire edilebilen, kolay erişilebilir bir MSC kaynağıdır. Sinovyal boşluktaki sinovyal sıvı kaynaklı MSC'lerin popülasyonu, artritik hastalarda artritik olmayan hastalara kıyasla önemli ölçüde artmıştır10-12. Bu nedenle, sinovyal sıvı, özellikle iltihaplı veya yaralı eklemleri olan hastalarda otolog kök hücre tedavisi için MSC'ler için mükemmel bir kaynak adayıdır. Ek olarak, sinovyal sıvı kaynaklı MSC'ler kondrojenik kapasiteye, immünomodülasyon yeteneklerine ve yüksek proliferasyon oranına sahiptir. Bu çalışma, non-invaziv yöntemler kullanılarak minipiglerden kemik iliği ekstraksiyonu ve sinovyal sıvı aspirasyonu ve izole hücrelerin in vitro genişlemesi ve hücre fenotiplerinin analizi için protokoller oluşturmuştur.

<table><tbody><tr><td>Gelişmiş Dulbecco' s modifiye Eagle ortamı (ADMEM)</td><td>Gibco</td><td>12491-023</td><td>MSC kültür ortamı</td></tr><tr><td>Dulbecco' s fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Hücre yıkama ortamı, Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>MSC ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>MSC ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>MSC ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)</td><td>Simga</td><td>F0291</td><td>MSC'lerin orta</td></tr><tr><td>bileşeni Sığır serum albümininin (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A6003</td><td>MSC'lerin orta</td></tr><tr><td>bileşeni Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>Hücre ayrışma reaktifi&nbsp;</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>MSC'lerin orta</td></tr><tr><td>İzotip antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 550616</td><td>İzotip Kontrolü</td></tr><tr><td>CD29 antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 552369</td><td>Integrin beta-1 MSC işaretleyicisi</td></tr><tr><td>CD44 antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 553133</td><td>Hücre yüzeyi glikoproteini MSC işaretleyici</td></tr><tr><td>CD45 antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 340664</td><td>Hematopoetik kök hücre belirteci</td></tr><tr><td>CD34 antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 555821</td><td>Hematopoetik kök hücre belirteci</td></tr><tr><td>CD90 antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 555595</td><td>Thy-1 membran glikoprotein MSC belirteci</td></tr><tr><td>MHC Sınıf II antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-32247</td><td>Antijen sunan hücreler belirteci</td></tr><tr><td>Vimentin antikoru</td><td>Sigma</td><td>Sigma-S6389</td><td>Tip III ara filament MSC işaretleyicisi</td></tr><tr><td>Alkalin fosfataz</td><td>Promega</td><td>S3841</td><td>5-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat (BCIP) ve nitro mavi tetrazolyum (NBT)</td> karışımıFicoll-Paque</tr> <tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Yoğunluk gradyan santrifüjleme</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>40 & M Naylon Hücre Süzgeci</td></tr><tr><td>15 ml polistiren konik tüp</td><td>BD Falcon</td><td>351095</td><td>Numune toplama ve hücre izolasyonu</td></tr><tr><td>35 mm tabaklar</td><td>Nunc</td><td>153066</td><td>Hücre kültürü kabı</td></tr><tr><td>Kemik iliği çıkarıcı</td><td>GmbH Medizintechnologie, Almanya</td><td>1145-1W010</td><td>TrokaBone, 3.0 x 100 mm</td></tr><tr><td>Hematokrit odası</td><td>Marinfeld</td><td>640130</td><td>Hücre sayma odası</td></tr><tr><td>Atropin</td><td>Jeil Pharmaceutical Co, Güney Kore</td><td></td><td>Atropin sülfat</td></tr><tr><td>Hidrat Asepromazin</td><td>Samu Median, Güney Kore</td><td></td><td>Anestezik öncesi yatıştırıcı ve antiemetik ilaç</td></tr><tr><td>Medetomidin</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Anestezik ve analjezik ilaç</td></tr><tr><td>Enrofloksasin</td><td>Bayer Healthcare, Almanya</td><td></td> Veterinerlik Tıbbı Üzerinde <td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>Meloksikam</td><td>, </td><td></td> Arjantin <td>Anti-enflamatuar ve analjezik ilaç</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Hana pharm, Güney Kore</td><td></td><td>İnhalasyon anestezisi</td></tr><tr><td>Povidone iyot ve nbsp;</td><td>Korea Pharma, Güney Kore</td><td></td><td>Sterilizasyon ajanı</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Sterilizasyon ajanı</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>Anti-pıhtılaştırıcı ajan</td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Hücre fiksasyon ajanı</td></tr><tr><td>Oftalmolojik merhem &nbsp;</td>Polimiksin B sülfatlı <td>Pfizer</td><td></td><td>Oksitetrasiklin HCl</td></tr><tr><td>Sirkülasyonlu su battaniyesi</td><td>Gaymar Industries</td><td></td><td>Anestezi sırasında ve sonrasında ısıtma sistemi</td></tr><tr><td>Cilt zımbalayıcı</td><td>Covidien, ABD</td><td></td><td>Sütür cilt kapanması</td></tr><tr><td>CO2 İnkübatör</td><td>Thermo Forma</td><td>3111</td><td>Hücre kültürü Ekipmanları</td></tr><tr><td>Akış sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Hücre analizörü</td></tr><tr><td>Minipig</td><td>PWG Genetics Korea, Ltd.</td><td>T tipi</td><td>Minyatür domuz</td></tr></tbody></table>

mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve kemik İliği elde edilen mezenkimal kök hücrelerin İzolasyonu ve hücresel fenotiplendirme

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), kemik iliği ve sinovyal sıvı dahil olmak üzere çeşitli doku kaynaklarından izole edildikten sonra oluşturulmuştur. Son zamanlarda, sinovyal sıvı kaynaklı MSC'lerin çok soylu farklılaşma potansiyeline ve immünomodülatör özelliklere sahip olduğu bildirilmiştir, bu da bu hücrelerin doku mühendisliği ve sistemik tedaviler için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu çalışma, hücre fenotiplemesi ve in vitro kültürleme için hücre yüzeyi belirteçlerini analiz etmek için minipiglerin kemik iliği ve sinovyal sıvısından türetilen MSC'lerin basit ve invaziv olmayan izolasyonu için bir protokol sunmaktadır. Cinsel olarak olgun altı aylık minipigler kullanılarak, bir kemik iliği çıkarıcı kullanılarak iliak kret kemiğinden kemik iliği çıkarıldı ve sinovyal sıvı femorotibial eklemden aspire edildi. Her iki kaynaktan da örnek toplama prosedürleri non-invazivdi. MSC'lerin hasat edilen hücre kaynaklarından etkili bir şekilde izole edilmesi ve minipiglerden stabil MSC'lerin genişletilmesi için in vitro kültür koşullarının oluşturulması ve sistemik otolog tedavilerin uygulanması için protokoller sağlanmaktadır. Hücre fenotiplemesi için, her iki hücrenin hücre yüzey belirteçleri akış sitometrisi kullanılarak analiz edildi. Sonuçlarda, MSC'ler minipiglerin sinovyal sıvısından izole edildi ve sinovyal sıvı kaynaklı MSC'lerin kemik iliği kaynaklı MSC'lere benzer bir morfolojiye ve hücre fenotipine sahip olduğunu gösterdi. Bu nedenle, non-invaziv olarak elde edilen sinovyal sıvı, değerli bir MSC kaynağıdır.

Kemik İliği ve mini-domuzlarda ve sinoviyal sıvıdan alınan MSC kurulması MSC&#39;ler olan (Şekil 2), kemik iliği ve mini-domuzlarda eklem sinoviyal eklem izole edilmiş ve in vitro olarak genişletilmiştir. Sinoviyal sıvı şırınga aspirasyon basit ve primer hücrelerinin in vitro kültivasyonu sırasında yeterli yapışmayan hücreler elde etmek mümkündür. sinoviyal sıvı türetilmiş MS...

Minipiglerin sinovyal sıvısı ve kemik iliğinden izole edilen ve şırınga aspirasyonu kullanılarak noninvaziv olarak toplanan mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler) kuran bir protokol sunulmuştur. Hücresel fenotipleme, hücre izolasyonu ve MSC'lerden türetilen kemik iliği ve sinovyal sıvıların in vitro kültivasyonu sonrası akış sitometrisi kullanılarak gerçekleştirildi.

Mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve Kemik İliği Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Hücresel Fenotiplendirme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Bu prosedürün genel amacı, rejenerasyon ve immünomodülasyon çalışmalarında kullanılacak mezenkimal kök hücreleri toplamak amacıyla minipiglerden sinovyal sıvı ve kemik iliğinin non-invaziv yöntemlerle toplanmasıdır. Bu yöntem, sinovyal sıvıda MSC'lerin nasıl kurulacağı ve kemik iliği MSC'leri ile karşılaştırmalı olarak nasıl karakterize edileceği gibi otolog MSC tedavisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hastalarda uygulanması için faydalı olacak şekilde, minipiglerden elde edilen sinovyal sıvı ve kemik iliği kaynaklı MSC'lerin temel özelliklerinin etkili bir şekilde belirlenmesini sağlamaktır.Bu tekniğin etkileri çeşitli eklem hastalıklarının tedavisine kadar uzanmaktadır, çünkü atletik hastalarda sinovyal boşluktaki sinovyal sıvı kaynaklı MSC popülasyonu önemli ölçüde artmaktadır. Bu yöntem rejeneratif tıp hakkında bilgiler sağlayabilmenin yanı sıra, otoimmün hastalık araştırmaları gibi diğer çalışmalara da uygulanabilir. Minipig MSC'ler otolog olduğu için, immünsupresyon insanlar için ilgi çekici olabilir.Diğer bilim insanlarının yanı sıra, prosedürü üçüncü seviyemden Hyeon-Jeong Lee ve Won-Jae Leele gösterecektir. Başlamak

isolation-cellular-phenotyping-mesenchymal-stem-cells-derived-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu protokol, domuz adipoz kaynaklı kök hücrelerin (pADSC) deri altı yağ dokularından izolasyonunu ve çoklu potansiyelin incelenmesini tanımlar. Multipotent pADSC, adiposit farklılaşma süreçlerini tanımlamak ve rejeneratif çalışmalar için mezodermal mezenşimin çoklu hücre soylarına veya ektoderm ve endodermin diğer soylarına transdiferansiyonu incelemek için kullanılır.

Domuz Subkutan yağ dokularındaki İzolasyonu ve Yağ-Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşması

Bu yazı basit yalıtım ve Yeni Zelanda beyaz tavşan synovial sıvı mezenkimal kök hücre arınma için basit ve ekonomik Protokolü sunar.

Manyetik aktif hücre stratejileri yalıtmak ve Sinovyal sıvı elde edilen mezenkimal kök hücre bir tavşan modelinden arındırmak için sıralama

İnfrapatellar yağ yastığı mezenkimal kök hücreleri (IFP-MSC'ler) diz ekleminin infrapatellar yağ pedinden kolayca izole edilebilir. İn vitro olarak iyi çoğalırlar, CFU-F kolonileri oluştururlar ve adipojenik, kondrojenik ve osteojenik soylara farklılaşırlar. Burada, IFP-MSC'lerin keçi boğucu ekleminden izolasyonu, genişlemesi ve farklılaşması için metodoloji sağlanmaktadır.

Mezenkimal Kök Hücrelerin Keçi Stifle Ekleminin İnfrapatellar Yağ Pedinden İzolasyonu, Genleşmesi ve Farklılaşması

Bu çalışma, sinovyal makrofajları ve fibroblastları murin inflamatuar artrit dokusundan izole etmek için modifiye edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Murin Artrit Dokusundan Primer Sinovyal Makrofaj ve Fibroblastların İzolasyonu ve Kültürü

Yağ dokusu mükemmel bir mezenkimal kök hücre kaynağıdır. Burada, İsviçre fareleri epididimal yağ dokusundan yağ dokusu türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) adım adım ekstraksiyonunu, yetiştirilmesini ve karakterizasyonunu getiriyoruz.

Fare Epididimal Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu, İn Vitro Genişletme ve Karakterizasyonu

Heterojen insan UC-MSC'lerini oluşturan üç ana alt gruptan biri olan BAMBIyüksekMFGE8yüksek MSC'lerin izolasyonu, belirli hastalıklarda klinik etkinliği artırmak için gelecekteki uygulaması için bu alt tipin özelliklerinin ve işlevlerinin tam olarak anlaşılmasına yardımcı olur. Burada, BAMBIyüksekMFGE8yüksek UC-MSC'leri sıralamak için bir yöntem sunuyoruz.

İnsan BAMBIyüksekMFGE8yüksek Göbek Kordonu Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücrelerin İzolasyonu

Yöntemi kullanarak insan dental pulpa kök hücrelerinin (hDPSCs) izolasyonu ve karakterizasyonu...

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Bu makale, birincil hücre kültürleri ve nasıl tümör hücrelerinden eritrositler ve fibroblastların kirlilikler çıkarmak için taze olarak elde edilen melanom doku hazırlanmasını tarif etmektedir. Son olarak, biz nasıl tarif...

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Reseptör tirozin kinazlar, ektopik bir çok kanser olarak ifade edilmiştir ve akut lösemi terapötik hedefler olarak tespit edilmiştir. Bu makale, akut lösemi tedavisinde tirosin kinaz inhibitörlerinin klinik öncesi değerlendirilmesi için etkin bir strateji tarif etmektedir.

Akut lösemi tedavisi için Tirosin Kinaz İnhibitörleri klinik öncesi değerlendirilmesi

Bu protokol, gama sintigrafisi kullanarak hücre sağkalımını ve doku dağılımını belirlemek için at mezenkimal kök hücrelerinin radyo-etiketlenmesini ve bunların attaki tendon yaralanmalarına implantasyonunu açıklar.

Atçılık tendinopatisinde Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücreler Etiketli Teknesyum- 99m Vivo Görüntüleme ve Takip

Öğrenin mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve kemik iliğinden mezenkimal kök hücre izolasyonu ve fenotiplendirme yöntemini. Bu protokol rejeneratif tıp ve immünomodülasyon çalışmaları için temel oluşturur.

Mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve Kemik İliği Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Hücresel Fenotiplendirme

Daha fazla video keşfet