Mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve Kemik İliği Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Hücresel Fenotiplendirme

Bu prosedürün genel amacı, rejenerasyon ve immünomodülasyon çalışmalarında kullanılmak üzere mezenkimal kök hücreleri toplamak için minipiglerden non-invaziv sinovyal sıvı ve kemik iliği toplanmasıdır. Bu yöntem, MSC'de sinovyal sıvının nasıl oluşturulacağı ve bunların kemik iliği MSC'ye kıyasla nasıl karakterize edileceği gibi otolog MSC tedavisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hastalarda uygulama için yararlı olacak olan minipiglerden elde edilen sinovyal sıvı ve kemik iliği kaynaklı MSC'lerin temel özelliklerini etkili bir şekilde oluşturmaktır.

Bu tekniğin etkileri, çeşitli eklem hastalıklarının tedavisine kadar uzanır, çünkü sinoviyal boşluktaki sinovyal sıvı kaynaklı MSC'nin popülasyonu atletik hastalarda önemli ölçüde artmıştır. Bu yöntem rejeneratif tıp hakkında bilgi sağlayabilse de, otoimmün hastalık araştırmaları gibi diğer çalışmalara da uygulanabilir. Minipig MSC'ler otolog olduğundan, immünosupresyon insanları ilgilendirebilir.

Diğer bilim adamlarına ek olarak, prosedürü gösterenler benim üçüncü seviyemden Hyeon-Jeong Lee ve Won-Jae Lee olacak. Başlamak için, iliak kreste erişmek için anestezi uygulanmış bir minipig'i yönlendirin. Daha sonra, bir jilet veya makas kullanarak iliak tepe üzerinde 15 santimetre karelik bir bölgeyi epilasyon yapın.

Ardından, açıkta kalan cildi dönüşümlü olarak povidon-iyot ve% 70 etanol ile üç kez ovalayın. Tamamen kuruduktan sonra steril örtüler uygulayın. Şimdi, üç ila dört mililitrelik bir durulama kullanarak on mililitrelik bir şırıngayı heparin ile önceden kaplayın.

Bu, kemik iliğinin çıkarılırken pıhtılaşmasını önleyecektir. Daha sonra, tam olarak iliak kemik tepesinde, heparin kaplı şırıngaya bir kemik iliği çıkarıcıyı sıkıca takın ve en az beş mililitre kemik iliği çıkarın. Hücreleri ekstrakte edilen kemik iliğinden izole etmek için, önce oda sıcaklığında 15 mililitrelik konik bir tüpte eşit miktarda DPBS ile seyreltin.

Ardından, üç mililitre yoğunluk santrifüj ortamını ikinci bir 15 mililitrelik konik tüpe yükleyin. Daha sonra, iki çözeltili katmanlar oluşturmak için seyreltilmiş kemik iliğinin dört mililitresini yoğunluk santrifüjleme ortamına dikkatlice aktarın. Şimdi, tüpü oda sıcaklığında 40 dakika boyunca 400 Gs'de santrifüjleyin.

İstenilen ÇUŞ'lar merkezi beyaz tabakada toplanır. Sadece bu katmanı aspire edin. MNC katmanını 15 mililitrelik konik bir tüpe çıkarın ve yedi ila sekiz mililitre DPBS ile seyreltin.

Ardından, hücreleri oda sıcaklığında on dakika boyunca 500 Gs'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve paletli hücreleri önceki santrifüjleme döngüsünü tekrarlayarak on mililitre DPBS ile iki kez yıkayın. İki yıkamadan sonra, MNC'leri iki mililitre ADMEM'de askıya alıyoruz.

Daha sonra, hücreleri 35 milimetrelik bir doku kültürü kabına yükleyin ve nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatöründe 38,5 santigrat derecede inkübe edin. 48 saat sonra, besiyerini bağlanmamış ÇUŞ'larla birlikte aspire edin. Daha sonra, iki mililitre taze ADMEM'i geri ekleyin ve ortamı her üç günde bir değiştirerek inkübasyona devam edin.

Hücreler% 70 ila 80 birleşmeye ulaştığında, kültürü taze DPBS ile yıkayın. Daha sonra, 37 santigrat derecede üç ila beş dakika boyunca bir mililitre% 0.25 Tripsin-EDTA kullanarak hücreleri ayırın. Hücreleri on mililitre ADMEM'de toplayın ve bunları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 Gs'de döndürün ve süpernatanı atın. Şimdi, hasat edilen ÇUŞ'ları bir mililitre taze ADMEM'de askıya alın ve yoğunluklarını ölçün. Dört mililitre ADMEM ile T25 şişelerine 1/2 ile dörtte üç milyon hücre arasında kaplama ile bitirin.

Şişeleri plakalar gibi inkübe edin ve ortamı her üç günde bir değiştirin. Kemik iliği toplamaya hazırlanırken yapıldığı gibi, femur eklemi üzerinde 15x10 santimetrelik bir cilt bölümü hazırlayın. Daha sonra, sinovyal eklemi tanımlamak için derinin altındaki patella ve tibia tepeleri için palpe edin ve 23 gauge iğne ile üç mililitrelik bir şırıngayı tam olarak eklemin içine yerleştirin.

Nazik emme kullanarak, 1/2 ila bir mililitre sıvı çıkarın ve iğneyi hemen geri çekin. Sinovyal sıvı hacmi çok küçükse, DPBS ile sinovyal sıvıyı toplamak için boşluğu DPBS ile yıkayın. Kullanılacak DPBS'nin hacmi, sinovyal boşluğun boyutuna göre değişir.

Sağlıklı eklemde optimal sinovyal sıvı hacmi sınırlıdır. Hacim, ekleminin büyüklüğüne ve patolojik durumuna göre değişir. Hücreleri sinovyal sıvıdan izole etmek için, sıvıyı oda sıcaklığında 15 mililitrelik konik bir tüpte eşit miktarda DPBS ile seyreltin.

Daha sonra, seyreltmeyi 40 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden geçirerek kalıntıları hareket ettiriyoruz. Ardından, on mililitre daha DPBS ekleyin ve süspansiyonu oda sıcaklığında on dakika boyunca 400 Gs'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı atın ve DPBS kullanarak hücreleri iki kez yıkayın.

Yıkanmış hücre paletini iki mililitre ADMEM'de askıya alıyoruz. Daha sonra, MSC'lerde gösterildiği gibi hücrelerin kültürlenmesine devam edin. MSC'ler, minipiglerin kemik iliği ve eklem sinovyal eklemlerinden başarıyla izole edildi ve in vitro olarak genişletildi.

Sinovyal sıvıdan türetilmiş MSC'lerin morfolojisi, kemik iliğinden türetilmiş MSC'lerinkine benzer: her ikisi de fibroblastik bir iğ şekline sahiptir ve homojen olarak yapışır. MSC'ler, üçüncü alt kültür tamamlandıktan sonra alkalin-fosfataz boyaması için pozitif ekspresyon gösterdi. Daha sonra, her iki kültürde de yüzey belirteçleri analiz edildi.

Beklendiği gibi, her iki MSC tipi de CD29, CD44 ve Vimentin'i önemli ölçüde eksprese etti. Buna karşılık, CD34 ve CD45'in ekspresyonu negatif ve düşüktü. Bu sonuçlar, sinovyal sıvıdan izole edilen hücreler de dahil olmak üzere farklı MSC'ler yoluyla elde edilenlerle aynıydı.

Bu videoyu izledikten sonra, MSC'lerini minipiglerden izole etmek için sinovyal sıvıyı ve kemik iliğini non-invaziv olarak nasıl aspire edeceğinizi ve bu MSC'nin karşılaştırmasını ve fenotiplemesini nasıl yapacağınızı iyi anlamalısınız. Bu prosedürü denerken, dikkatli bir palpasyonla belirlenen iliak kret ve sinovyal üzerindeki objektif noktayı bulmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, osteoartrit veya romatoid artrit modellerinde olduğu gibi, sadece kemik iliğinden değil, aynı zamanda sinovyal sıvı MSC'lerinin de kıkırdak veya kemik başlatma ve immünosupresyonlar için aynı tür kapasiteye sahip olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için başka yöntemler de uygulanabilir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, artrit hastalarında saldırıya uğramış veya iltihaplı eklemden türetilen MSC'leri karakterize etmeye yardımcı olarak eklem hastalıklarının otolog tedavisini ilerletmiştir.