Name: C2C12 Miyoblast Hücrelerde Myotonik Distrofi 1 Modelleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Keşfedin C2C12 miyoblast hücrelerinde gen transfeksiyonu ve transdüksiyon teknikleri kullanarak miyotonik distrofi 1 hücre modeli oluşturma yöntemlerini. Bu protokol kas hastalıklarının mekanizmalarını araştırmak için etkili bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Baylor Tıp Fakültesi'nden Dr. Tom Cooper'a, Wisconsin-Madison Üniversitesi'nden Mani S. Mahadevan'a ve Cenevre Üniversitesi'nden Didier Trono'ya reaktifler için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Houston Üniversitesi başlangıç fonu (YL), Amerikan Kalp Derneği hibesi (YL, 11SDG5260033) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (XP, 81460047) tarafından desteklenmektedir.

1. C2C12 Hücre Kültürü <ol><li> büyüme ortamında 100 mm plaka C2C12 fare miyoblastlar muhafaza (Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM)),% 20 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 2 mM L-glutamin. % 60 konfluent - C2C12 pasajlı hücreler yaklaşık 50 olmak izin verin. </li><li> büyüme ortamı atılır ve 3 mi oda sıcaklığında fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) ile C2C12 hücreleri yıkayın. PBS çıkarın ve hücreleri ayırmak için 500 ul% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. 5 dakika - 3 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde plaka koyun. </li><li> 3 ml büyüme ortamı ekleyerek tripsin nötralize. Hücreleri askıya 8 kez - 6 Pipet. Yeni bir 100 mm&#39;lik plaka süspansiyon hücre 1 ml ilave edilir ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe edilir. </li></ol> 2. C2C12 HÜCRE NAKLİ / transdüksiyon ve Seçimi <ol><li> C2C12 plazmid transfeksiyon <ol><li> 24 saat önce transfeksiyon, sHer transfeksiyon için altı oyuklu plakanın bir kuyuya sonunda 7.0 X 10 5 C2C12 hücreleri. Not: Bu 50 yol açar - transfeksiyon zaman% 60 izdiham. </li><li> transfeksiyon reaktifi, kullanımdan önce, oda sıcaklığına kadar çıkmasına izin verin. </li><li> Kısaca önceden ısıtılmış serum barındırmayan ortam ve vorteks 200 ul plazmit DNA (GFP CUG5 veya GFP-CUG200) 2 ug ekleyin. orta 6 ul transfeksiyon reaktif ekleyin ve bir girdap kullanarak 30 saniye boyunca hemen karıştırın. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> 2.5 ml serum serbest büyüme ortamına C2C12 hücrelerinin ortamı değiştirmek. inkübasyondan sonra hücrelere transfeksiyon karışımı ekleyin. % 5 CO 2, 37 ° C inkübatör plakaları dönün. </li><li> 4 saat veya gece kadar transfeksiyon karışımı / serum serbest büyüme ortamı hücreleri tutun. Ertesi gün geri büyüme ortamına ortamı değiştirmek veya sitotoksisite belirgin olduğunda. Not: Sitotoksisite ce mikroskobik muayene ile değerlendirilirrf. hücre morfolojisi ve hücre dekolmanı değişiklikleri gözlemleyin. Sürece hiçbir açık sitotoksisite olduğu gibi, serumsuz büyüme ortamı içinde bir gece boyunca inkübasyon transfeksiyon artırır. </li><li> (Plazmidler olmadan transfekte) kontrol kültürü canlı hücreler yok dek 10 gün ~ 1.6 mg / ml G418 - 1.2 ekleyerek hücreleri transfeksiyondan sonra 48 saat seçin. G418 ile desteklenmiş büyüme medya ile her iki günde bir ortamı değiştirmek. </li><li> Daha sonraki deneyler için, 37 ° C&#39;de büyüme ortamı ve% 5 CO2 içinde G418 dirençli hücrelerin bakımı. </li></ol></li><li> Retrovirüs hazırlanması ve C2C12 Retroviral transdüksiyon, <ol><li> % 10 cenin sığır serumu, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 2 mM L-glutamin ile DMEM yüksek glukoz ilave tarafından HEK 293 kültür ortamı hazırlayın. <ol><li> Yaklaşık 24 saatlik bir transfeksiyon önce, 100 mm levha (transfeksiyon% 80 izdiham) 4.0 x 10 6 ekotropik HEK 293 tabanlı paket hücreleri plaka Cıiçeren gruptur hücre kültürü ortamı. </li></ol></li><li> transfeksiyon reaktifi, kullanımdan önce, oda sıcaklığına kadar çıkmasına izin verin. </li><li> 1 mi serumsuz büyüme ortamı içinde 15 ug DNA (pMSCV-Puro ya pMSCV-Celf1Flag-puro) karıştırın. Vortex kısa. DNA / serum serbest büyüme ortamı tüpüne adım 2.2.2 30 ul transfeksiyon reaktif ekleyin ve vorteks kullanılarak iyice karıştırın. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> ekotropik HEK 293 bazlı ambalaj hücrelere transfeksiyon karışımı damla damla ekleyin. Yavaşça girdap plakalar ve% 5 CO 2, 37 ° C inkübatör onları geri dönün. 24 saat sonra, 10 ml önceden ısıtılmış taze büyüme ortamına bir ortam. </li><li> süpernatan içeren (retrovirüs), bir pipet kullanılarak transfeksiyondan sonra 48 saat hasat ve 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne süpernatant aktarın. plaka yeni sıcak ortam 10 ml ekleyin ve inkübatör geri. 4 ° C&#39;de süpernatan tutun. Not: Medya t yavaşça ilave ediliro kuyunun yan hücre tek tabaka bozmak şekilde değil. </li><li> transfeksiyondan sonra süpernatant 60 saat ikinci parti hasat ve 2.2.5 süpernatant ile havuz. 500 xg, 7 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj selüler artığın ayrılması için. </li><li> Yeni bir 50 ml&#39;lik santrifüj tüpüne süpernatant aktarın. 2.2.9 ya da kısım adım ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de süpernatan depolamak için işlem, bu noktada C2C12 hücreleri nakletmek için retrovirüs kullanın. </li><li> dondurulmuş bir stok Burada kullanıldığında, oda sıcaklığında 2.2.7 retrovirüs çözülme. Not: Birden fazla donma-çözülme döngüleri kaçının. </li><li> izdiham% 40 - 30 amaçlayan iletimi aynı gün C2C12 hücreleri Plate. <ol><li> büyüme ortamı atın ve 3 ml oda sıcaklığında PBS ile C2C12 hücreleri yıkayın. PBS kaldır 500 ul% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve 3 için 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde inkübe levhasını - 5 dak. </li><li> 3 ml büyüme med ekleyerek tripsin nötralizeyum. Hücreleri askıya 8 kez - 6 Pipet. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 60 mm plakaya 8.0 x 10 5 C2C12 hücreleri ekleyin. </li></ol></li><li> 3 mi büyüme ortamı içinde hücrelerin bir 60 mm plaka enfekte etmek için 0.5 ml retrovirüs ekleyin. inkübatör plaka dönün. </li><li> enfeksiyondan sonra 48 saat - seçme antibiyotik (3 ug / ml puromisin 1) ile desteklenmiş 3 mi taze ortam ile değiştirin. untransduced C2C12 kontrol kültürü dışarı ölene kadar 5 ~ gün için her gün antibiyotik ile 3 ml orta yerine. </li></ol></li><li> Lentivirüs hazırlanması ve C2C12 lentiviral transdüksiyon Not: Biyogüvenlik Seviye 2 kabine tüm lentivirüs ilgili prosedürleri uygulayın ve biyolojik güvenlik kurallarına uyun. virüs içeren sıvı atık bertaraf öncesinde dezenfekte edilmelidir. <ol><li> % 10 fetal ile takviye edilmiş HEK 293 hücre kültürü ortamı (DMEM yüksek glukoz ile 100 mm plaka (~ transfeksiyon günde% 80 izdiham) &#39;de Plaka 4.0 x 10 6 293T hücreleri,sığır serumu, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 2 mM L-glutamin) transfeksiyondan önce 24 saat. </li><li> Oda sıcaklığına kadar transfeksiyon reaktifi ısıtın. 8 ug lentiviral transfer vektörü ile birlikte lentiviral ambalaj vektörler (4 ug pMD2.G 6 ug psPAX2) karışımı (Celf1 shRNA veya kontrol shRNA karıştırılmış) 1 mi serumsuz hücre kültürü ortamı içinde. Vortex kısa. </li><li> DNA / DMEM tüpüne 36 ul önceden ısıtılmış transfeksiyon reaktif ekleyin ve vorteks ile iyice karıştırın. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> inkübatör 293T hücreleri çıkarmak ve plaka transfeksiyon karışımı ekleyin. Yavaşça plaka girdap ve geri% 5 CO 2, 37 ° C inkübatör iade. 24 saat sonra, 10 mi taze kültür ortamı ile transfeksiyon karışımı değiştirin. </li><li> transfeksiyondan sonra süpernatan ihtiva eden lentivirüs 48 saat toplamak ve 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine aktarın. plaka 10 ml yeni sıcak ortam ekleyin ve geriinkübatör için. 4 ° C&#39;de süpernatan saklayın. </li><li> transfeksiyondan sonra süpernatant 60 saat ikinci parti toplayın ve 2.3.5 süpernatant ile birleştirmek. 500 xg, 7 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüje kısa. </li><li> yeni bir 50 ml&#39;lik santrifüj tüpüne süpernatant aktarın. Taze virüs kullanıyorsanız, 2.3.9 adıma geçin. daha sonra kullanmak için, mağaza 10 ml&#39;lik alikolar içinde -20 ° C&#39;de süpernatan virüs içeren. </li><li> dondurulmuş bir stok kullanılırsa, kullanılmadan önce oda sıcaklığında 2.3.7 virüs çözülme. Not: Birden fazla donma-çözülme döngüleri kaçının. </li><li> transdüksiyon aynı gün 2.2.9 tarif edildiği gibi (Bölüm 2.1&#39;de elde edilen) Levha C2C12-CUG200 hücreleri. Not: 30 Amaç - izdiham% 40. </li><li> C2C12-CUG200 bir 60 mm plaka enfekte ve inkübatör plaka dönüş 0.5 mi virüs ekleyin. </li><li> transdüksiyon sonra 72 saat - seçim antibiyotik (3 ug / ml puromisin 1) ile desteklenmiş taze medya ile kültür ortamı değiştirin.tüm untransduced C2C12-CUG200 kontrol kültürü dışarı ölene kadar 5 ~ gün için seçim antibiyotik ile kültür ortamı her gün yenileyin. </li><li> GFP-CUG200 transfekte hücrelerde Celf1 demonte doğrulamak için Western blot kullanın. </li></ol></li></ol> 3. C2C12 Hücre Farklılaşması <ol><li> Levha farklılaşma başlamadan önce 2.5 ml büyüme ortamı, 24 saat içinde 6 oyuklu plakanın bir oyuk 2 x 10 6 hücre. Not: Tüm izdiham 24 saat içinde ulaşılır, böylece kaplama yoğunluğu ayarlanabilir. <ol><li> PBS ile konfluent hücreler durulanır ve düşük serum farklılaştırma ortamının 2.5 mL (Dulbecco Eagle ortamı,% 2 at serumu ile desteklenmiş, modifiye 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin ve 1 uM insülin) ekleyin . iki günde orta yerine. Not: Dondurulmuş stok insülin tutun ve her orta değişiminde medyaya ekleyin. </li></ol></li><li> C2C12 farklılaşması sırasında, Quan için numune toplamaktitative aşağıdaki zaman noktalarında RT-PCR (bakınız bölüm 4): 0 Gün, 1, 2, 4, ve 6. günde immün kültür 6. Süreci - 8 (bölüm 5). </li></ol> 4. RNA İzolasyonu ve Nicel RT-PCR <ol><li> RNA izolasyonu için imalatçının protokolü kullanarak. İzolasyondan sonra, 30 mL RNaz içermeyen su içinde RNA pelletini aşağı birkaç kez pipetleyin vb. Not: Örnekler Nicel RT-PCR için devam edebilir ya da -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Kantitatif RT-PCR 10 için RT qPCR kiti kullanın ve üreticinin talimatlarını izleyin. Tablo 1 &#39;e göre, reaksiyon karışımı hazırlayın. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim (ul) </td><td> nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> 2x reaksiyon tamponu </td><td> 10 </td><td> 1x </td&gt; </tr><tr><td> İleri primer </td><td> 0.5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Ters astar </td><td> 0.5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> sonda </td><td> 0.5 </td><td> 200 nM </td></tr><tr><td> Transkriptaz ve RNaz inhibitörü Ters </td><td> 0.1 </td><td> 0.25 U / ml </td></tr><tr><td> şablon </td><td> 1 </td><td> 100 ng toplam RNA, </td></tr><tr><td> RNaz ücretsiz su </td><td> 7.4 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Toplam Mix </td><td> 20 </td><td></td></tr></tbody></table> TABLO 1. nicel RT-PCR Master Mix hazırlanması <ol start="3"><li> Termal profili Tablo 2 kullanılarak 20 ul RT-qPCR reaksiyonu çalıştırın. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Ters transkripsiyon adımı </td><td> 30 dakika, 48 ° C </td></tr><tr><td> DNA polimeriase aktivasyon / Reverse Transcriptase inaktivasyonu </td><td> 10 dakika, 95 ° C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 40 devir </td><td> 15 sn, 95 ° C </td></tr><tr><td> 1 dakika, 60 ° C </td></tr></tbody></table> Tablo 2. nicel RT-PCR termal profili 5. immün <ol><li> 2,5 tek tabakalı kültürü saptamak taze, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 paraformaldehid / PBS hazırlanabilir ml. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 2.5 ml% 0.1 Triton X-100 / PBS içinde örnekleri geçirgenliği. </li><li> nemlendirilmiş bir odasında örnekleri aktarın. 37 ° C&#39;de 30 dakika süre ile tampon (% 0.1 noniyonik yüzey aktif cismi / PBS,% 10 normal keçi serumu) 2.5 ml örnekleri bloke eder. </li><li> bloke tamponu atılır ve tampon (1: 100) engelleme seyreltilmiş miyozin ağır zincir karşı 800 ul primer antikor uygulayın. Oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada gece boyunca inkübe edin. </li><li> plaka 3 tim yıkayınes 2.5 ml yıkama tamponu günde 2 (% 0.1 polisorbat 20 / PBS) ile (10 dk). </li><li> Yıkama tamponunu çıkarın ve 800 ul ikincil antikor (keçi anti-fare IgG, PBS içerisinde 1: seyreltildi 500) uygulanır. 1 saat süre ile, oda sıcaklığında, bir nemlendirilmiş oda içinde inkübe edin. </li><li> 2.5 ml yıkama tamponu ile iki kez (10 dk) yıkayın. </li><li> 5 dakika boyunca (damıtılmış iyonu giderilmiş H2 O içerisinde seyreltilmiş 1 ug / ml), 800 ul DAPI ile inkübe edin. </li><li> 10 dakika süre ile tekrar 2.5 ml yıkama tamponu ile yıkayın. </li><li> 2.5 ml PBS ile yıkama tamponu değiştirmek ve görüntüler yakalamak için bir floresan mikroskop kullanın. </li></ol>

<ol><li>Harper, P. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarper%2C+PS+%22Myotonic+dystrophy.+3rd+edn%22">Myotonic dystrophy. 3rd edn</a>. , W. B. Saunders. (2001).</li>
<li>Timchenko, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+muscle+atrophy+in+myotonic+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).</li>
<li>Brook, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+myotonic+dystrophy%3A+expansion+of+a+trinucleotide+%28CTG%29+repeat+at+the+3%27+end+of+a+transcript+encoding+a+protein+kinase+family+member%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member.</a> Cell. 68 (4), 799-808 (1992).</li>
<li>Chau, A., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+insights+into+the+pathology+of+and+therapeutic+strategies+for+DM1%3A+Back+to+the+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics.</a> Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).</li>
<li>Ho, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscleblind+proteins+regulate+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Muscleblind proteins regulate alternative splicing.</a> EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).</li>
<li>Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+steady-state+levels+of+CUGBP1+in+myotonic+dystrophy+1+are+due+to+PKC-mediated+hyperphosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation.</a> Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).</li>
<li>Kalsotra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mef2+transcription+network+is+disrupted+in+myotonic+dystrophy+heart+tissue%2C+dramatically+altering+miRNA+and+mRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression.</a> Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).</li>
<li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li>
<li>Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+stable+heterocaryons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons.</a> Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).</li>
<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celf1+regulates+cell+cycle+and+is+partially+responsible+for+defective+myoblast+differentiation+in+myotonic+dystrophy+RNA+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myotonic+dystrophy+expanded+CUG+repeat+tract+is+necessary+but+not+sufficient+to+disrupt+C2C12+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation.</a> Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).</li>
<li>Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis+and+trans+effects+of+the+myotonic+dystrophy+%28DM%29+mutation+in+a+cell+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model.</a> Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).</li>
<li>Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28CTG%29n+repeats+markedly+inhibit+differentiation+of+the+C2C12+myoblast+cell+line%3A+implications+for+congenital+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">(CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy.</a> Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).</li>
<li>Emerson, C. P., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEmerson%2C+CP+%22Methods+in+muscle+biology%22">Methods in muscle biology</a>. 52, Academic Press. (1997).</li>
<li>Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUGBP1+overexpression+in+mouse+skeletal+muscle+reproduces+features+of+myotonic+dystrophy+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).</li>
<li>Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-specific+overexpression+of+CUGBP1+reproduces+functional+and+molecular+abnormalities+of+myotonic+dystrophy+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

C2C12 hücre hattı Miyogenesis 11-14 incelemek için bir model olarak kullanılmıştır. Bu hücreler, bir fibroblast-benzeri bir görünüm korumak,% 20 fetal inek serumu ihtiva eden ortamda hızla çoğalan ve hali hazırda% 2 at serumu 15 ihtiva eden ortam içinde farklılık gösterir. Hızlı büyüme ve farklılaşma bir Miyogenesis hücre modelinde avantajlı özellikleridir. Burada, C2C12 hücrelerine cDNA, 3&#39;-UTR ve shRNA tanıtmak plazmid retroviral ve lentiviral vektörleri kullanımını göstermektedir. transfeksi...

Miyotonik distrofi (DM) birden fazla sistemi, en önemlisi kalp ve iskelet kasları 1 etkileyen otozomal dominant bir hastalıktır. Bu hastalıkta, DM1 ve DM2 iki alt tipi vardır. DM1 daha sık görülür ve DM2 2 daha ciddi bir tezahürü vardır. DM1 yatan genetik mutasyon 3 &#39;çevrilmemiş bölge DM protein kinaz geni (DMPK) 3 (UTR) bulunan KKG üçüz tekrarlarının bir açılımıdır. Etkilenmemiş kişilerde KKG tekrar sayısı aksine 37&#39;ye 5 ila, daha fazla 50 artar ve bazen DM1 hastalarının 4&#39;te binlerce değişir. Bunun bir sonucu olarak, bu gibi RNA bağlayıcı proteinler,-kas benzeri 1 (MBNL1) CUGBP ve Elav benzeri Aile 1 (Celf1), düzeni bozulmuş bulunmaktadır. Nedeniyle genişletilmiş KKG tekrarlarda haciz, MBNL1 alternatif yapıştırma 5 düzenleyen yeteneğini kaybeder. Celf1, diğer taraftan, 6,7 yukarı düzenlenir. Celf1 aşırı ekspresyonu kas kaybı ile ilişkilidirMBNL1 fonksiyon kaybına atfedilen değildir ve halsizlik. DMPK 3&#39;-UTR KKG genişleme, MBNL1 kaybı ve Celf1 aşırı ifadesi de dahil olmak üzere DM1 ile ilgili değişiklikleri, simüle Hayvan modelleri, kurulmuştur. Ancak, miyoblastların içinde DM1 modelleme özellikle DM1 ile ilgili hücresel ve moleküler olayları diseksiyon için, etkili bir alternatif sunuyor. C2C12 myoblast hücre hattı ilk yaralı C3H fare kas izole ve yaygın Miyojenik farklılaşma 8,9 incelemek için kullanılmıştır. C2C12 hücreleri hızla cenin sığır serumu (FBS) ortam ihtiva-eden prolifere ve kolayca FBS boşaldığında farklılaşma tabi tutulur. Oysa, bu myoblast farklılaşma modeli kullanılarak iki zorluğu beraberinde getirir: C2C12 hücreleri sıklıkla gen transfeksiyonu / viral transdüksiyon dirençlidir; ve hücre işleme ve farklılaşma prosedüründe küçük farklılıklar mihotüp oluşumunda belirgin değişikliklere yol açabilir. Bizim laboratuvar rutin ac olarak C2C12 miyoblastları kullanırell modeli ve etkili bir C2C12 hücre hattına 10 plazmid transfeksiyon, retroviral kalıt ve lentiviral transdüksiyonu ile genleri teslim protokolleri geliştirilmiştir. videoda, / transfekte C2C12 hücrelerini transduse ve DM1 myoblast modelleri kurulmasında farklılaşma tutarlılığını sağlamak için optimize prosedürleri göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>DMEM, yüksek glikoz</td> Kültür <td>ortamı için</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11965-084</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu - Kültür</td><td>ortamı için</td><td>Premium Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin-Glutamin (100x)</td>Kültür <td>ortamı için</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10378-016</td></tr><tr><td>Sığır pankreasından insülin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-100MG</td><td>için farklılaşma ortamı</td></tr><tr><td>at serumu Atlanta Biologicals</td><td>S12150</td><td>farklılaşma ortamı</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE&nbsp; HD Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Promega</td><td>E2311&nbsp;</td><td>transfeksiyon için</td></tr><tr><td>G418 sülfat ve nbsp;</td><td>Altın Biyoteknoloji&nbsp;</td><td>İlaca dirençli seçim için</td> <td>G-418-10</td> İlaca</tr><tr><td>dirençli seçim için</td><td>Puromisin dihidroklorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - %12 Bis-Tris Protein Jelleri, 1.0 mm, 15 kuyulu</td> Western <td>blot için</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NP0323BOX</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Tamponu (20x)</td><td>Western blot için</td> <td>Life Technologies</td><td>NP00061</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Çalıştırma Tamponu (20x)</td> Batı <td>lekesi için</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NP0002</td></tr><tr><td>Amersham Protran Destekli 0.2 NC, 300 mm x 4 m</td><td>GE sağlık yaşam bilimleri</td><td>10600015</td><td>western blot için</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>Gelişimsel Hibridoma Bankası</td><td>MF 20</td><td>primer Ab immün boyama için</td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, Texas Red-X konjugat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T-862</td><td>ikincil Ab için immün boyama</td></tr><tr><td>qRT-PCR</td>TriPure İzolasyon Reaktifi için<td>bir adım qRT-PCR MasterMix</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td></tr><tr><td></td><td>RNA izolasyonu için</td><td>Roche</td><td>11667165001</td></tr><tr><td>CUG-BP1 Antikoru (3B1)</td><td>santa cruz</td><td>sc-20003</td><td>primer Ab western blot</td></tr><tr><td>Aktin Antikoru</td><td>santa cruz</td><td>sc-1615</td><td>yükleme kontrolü için keçi poliklonal</td></tr><tr><td>IgG 293T Ecopack</td><td>Retrovirüs hazırlığı için</td> <td>Clontech</td><td>631507</td> hücreleri</tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>Clontech</td><td>,</td><td>retrovirüs hazırlığı için boş retroviral vektör</td></tr><tr><td>634401 pMSCV-Celf1Flag-puro</td><td>ev yapımı</td><td>mevcut değil</td><td>retroviral vektör kodlaması Celf1Flag, retrovirüs hazırlığında kullanılır</td></tr><tr><td>Didier Trono'dan</td><td>psPAX2</td> hediyesi <td>lentivirüs hazırlığı için</td> <td>mevcut değil</td></tr><tr><td>Didier Trono'dan</td> <td>pMD2.G</td> hediyesi <td>lentivirüs hazırlığı için</td><td>mevcut değil</td></tr><tr><td>M.S. Mahadevan'dan</td><td>GFP-CUG5</td> hediyesi <td>mevcut değil</td><td>Referans 10&nbsp;</td></tr><tr><td>M.S. Mahadevan'dan</td><td></td> <td>GFP- CUG200</td> hediyesi <td>referansta mevcut değil detaylar 10&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>immün boyama için</td></tr><tr><td>paraformaldehit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>immün boyama için</td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp; İmmün</td><td>boyama için</td>20 <td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td></tr><tr><td>İmmün boyama için</td> <td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td></tr></tbody></table>

c2c12 miyoblast hücrelerde myotonik distrofi 1 modelleme

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Miyotonik distrofi 1 (DM1) müsküler distrofi yaygın bir şeklidir. çeşitli hayvan modelleri DM1 için kurulmuş olmasına rağmen onlar hücresel ve moleküler olayları incelemek için etkili bir hücresel alternatif sunmak, çünkü myoblast hücre modelleri hala önemlidir. C2C12 miyoblast hücreleri yaygın gene ya da viral transdüksiyon ile Miyogenesis direnç incelemek için kullanılmıştır olmasına rağmen, C2C12 hücre araştırma engellemektedir. Burada, C2C12 iskelet hücreleri ve miyosit farklılaşmanın başlaması içine genleri tanıtmak için günlük bakım, transfeksiyon ve transdüksiyon prosedürleri içerir optimize edilmiş bir protokol açıklar. Toplu olarak, bu işlemler iyi transfeksiyon / transdüksiyon verimliliği, hem de uyumlu farklılaşma sonuçlarını verir. miyotonik distrofi çalışma, hem de diğer kas hastalıkları yararlanacak DM1 miyoblast hücre modellerinin oluşturulması açıklanan protokol.

C2C12 hücreleri GFP CUG5 veya GFP-CUG200 ile transfekte edilmiştir. Ilaç direnci seçimi yapıldıktan sonra, sabit havuzları GFP (Şekil 1A) ile görünür edilebilir, kurulmuştur. Farklılaşmış miyoblastların içinde mihotüp formasyonu 10 (Şekil 1B) immün ağır zinciri miyozin tarafından tespit edildi. Mihotüp oluşumu ölçümü füzyon endeksleri 2.6 ± 1.1% 35,4 ± 4,1 den% azalmış ve mihotüp alanları GFP-CUG200 (Şekil 1C) anormal KKG geni...

Bu protokol, biz optimize C2C12 hücre bakım, gen transfeksiyon / transdüksiyon ve miyosit farklılaşma dahil miyotonik distrofi 1 myoblast modelleri, kurulması prosedürleri sunuyoruz.

C2C12 Miyoblast Hücrelerde Myotonik Distrofi 1 Modelleme

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Bu miyoblast bakımı, transfeksiyon ve transduksiyon prosedürlerinin genel amacı, miyotonik distrofi ve diğer kas hastalıklarının incelenmesi için bir miyotonik distrofi tek hücre modeli oluşturmaktır. Bu yöntem, M1 patogenezinin detaylı mekanizmasının araştırılmasında faydalı olacak M1 miyoblast hücre modellerinin kurulmasına yardımcı olabilir. C2C12 miyoblastlarının bu çok aşamalı gen manipülasyonu, M1'deki ardışık ve genetik patolojik olayların modellenmesine olanak tanır. Transfeksiyondan 24 saat önce, altı kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa yedi kez 10⁵ C2C12 hücresi ekleyin.Ertesi gün, oda sıcaklığında, serumsuz besiyerinin 200 µL'sine ilgili plazmid DNA'sından 2 µg ekleyin ve çözeltiyi kısa süreliğine vorteksleyin. Ardından, besiyerine oda sıcaklığında 6 µL transfeksiyon reaktifi ekleyin ve çözeltiyi hemen 30 saniye boyunca vorteksleyin. Daha sonra besiyerini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun son beş dakikasında, her kuyucuktaki besiyerini 2,5 mL taze serumsuz büyüme besiyeri ile değiştirin ve her kuyucuğa 200 µL transfeksiyon karışımı ekleyin. Plakayı dört saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin.Ardından, hücrelerin morfolojisinde

modeling-myotonic-dystrophy-1-in-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kültür kas hücreleri innerve kas özetlemek için yetersiz bir modeli...

Kültür Bulaşık A Fonksiyonel Motor Birim: Omurilik Eksplantlarından ve Kas Hücrelerinin Co-kültür

Miyoblast ekiminin başarısını değerlendirmek için bir non-invaziv yollarla açıklanmıştır. Yöntemi olan ifade farklı görüntüleme yöntemleri ile görüntülenebilir genlerin oluşan birleşik bir füzyon muhabiri gen yararlanır. Burada, bir...

Nakledilen Muscle Progenitör Hücreler Hedefleyecek Moleküler Görüntüleme

Bu protokol, kas veya cilt dokusundan miyojenik ve fibroblast hücre hatlarının canlı hücre izolasyonu ve birincil kültürü için teknikleri açıklar.  Bu hücre dizilerinin ölümsüzleştirilmesi için bir teknik de tarif edilmiştir.  Toplamda, bu protokoller, aşağı akış uygulamaları için hastadan türetilen hücreleri oluşturmak ve korumak için güvenilir bir araç sağlar.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

Bu protokol, fare kas liflerinde floresan olarak işaretlenmiş proteinleri tanıtmak ve eksprese etmek için elektroporasyonu kullanır. Elektroporasyondan sonra geri kazanımın ardından lifler izole edilir. Tek tek lifler daha sonra kas yapısını görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir.

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Kas hücreleri en karmaşık ökaryotik hücreler arasındadır. Tüm gelişim aşamalarında genetik manipülasyon ve net görüntülemeye izin veren yüksek derecede olgun miyofiberlerin in vitro farklılaşması için bir protokol sunuyoruz.

Canlı Görüntüleme Olgun Myofibers İn Vitro Farklılaşma içinde

Bu teknik amacı birincil motoneurons (MNs) fare omurilik üzerinden zenginleştirilmiş kültürünün hazırlamaktır. Tarif MN hastalıklar neden mutasyonlar sonuçlarını değerlendirmek için biz burada bu yalıtım MNs ve onların transfection magnetofection tarafından izole.

Fare birincil Motoneurons Transfecting tarafından Charcot Marie Tooth hastalığı Vitro modelleme

C2C12 miyoblastlarında küçük saç tokası (sh) RNA kullanarak hücre dışı matriks (ECM) proteinlerini kodlayan genleri yere sermek için bir protokol sağlıyoruz. ADAMTSL2'yi örnek olarak hedefleyerek, C2C12 miyoblastı sırasında mRNA, protein ve hücresel düzeydeki nakavt etkinliğinin doğrulanması ve miyotube farklılaşması na yönelik yöntemleri tanımlıyoruz.

C2C12 Myoblast Hücre Hattında Ki Ekstrasellüler Matriks Proteinlerini Kodlayan Genlerin Kararlı Nakavtı Küçük Saç Tokası (sh)RNA

Bu makalede, distropin mRNA ve protein düzeylerinin ekson atlama dan sonra restorasyon değerlendirmek için MYOD1-dönüştürülmüş idrar türetilmiş hücreleri kullanarak Duchenne musküler distrofi kasının verimli modelleme için ayrıntılı bir protokol açıklanır.

İnsan İdrar Türemiş Hücrelerden Elde Edilen Doğrudan Yeniden Programlanmış Miyotüplerde Ekson Atlama

Burada, homozigot mutant Lamin Δ8-11 fare modeli, Emery-Dreifuss kas distrofisi (EDMD) için çok ciddi bir model erken doğum sonrası gelişim aşamalarında verimli bir şekilde tek kas lifleri elde etmek için bir yöntem öneriyoruz.

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Bu protokol, cilt fibroblastlarının miyoblastlara dönüşümünü ve farklılaşmalarını miyotüplere açıklar. Hücre hatları nöromüsküler bozukluğu olan hastalardan türetilmiştir ve patolojik mekanizmaları araştırmak ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılabilir.

Nöromüsküler Bozukluklar için Tedavileri Araştırmak için İnsan Fibroblastlarının Myoblastlara Doğrudan Yeniden Programlanması

İnsan mühendisliği iskelet kası dokusu ve optogenetik motonöronlar kullanarak nöromüsküler kavşak fonksiyonunu karakterize etmek için tekrarlanabilir, otomatik ve tarafsız bir görüntüleme sistemi tanımladık. Bu sistem, zaman içinde nöromüsküler bağlantının fonksiyonel olarak ölçülmesine izin verir ve nörotoksinlerin ve myastenia gravis hasta serumunun neden olduğu azalmış nöromüsküler fonksiyonu tespit eder.

İnsan Nöromüsküler Kavşağının Optogenetik Modelinin Mühendisliği ve Karakterizasyonu

Keşfedin C2C12 miyoblast hücrelerinde gen transfeksiyonu ve transdüksiyon teknikleri kullanarak miyotonik distrofi 1 hücre modeli oluşturma yöntemlerini. Bu protokol kas hastalıklarının mekanizmalarını araştırmak için etkili bir model sunar.

C2C12 Miyoblast Hücrelerde Myotonik Distrofi 1 Modelleme

Daha fazla video keşfet