Name: Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Öğrenin sırt kök ganglion nöronlarının statik ön germeli hücre kültürü sistemi kullanılarak akson hizalaması ve miyelinizasyonunun nasıl artırılacağını. Bu yöntem sinir doku mühendisliği araştırmaları için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar PDMS alt tabakaların hazırlanmasında yaptığı yardım için Eric Vasco teşekkür etmek istiyorum, yararlı öneriler ve DRG izolasyon eğitimi için Michigan Üniversitesi&#39;nden Dr. Marina Mata&#39;nın laboratuarında Dr. Shiyong Wang ve Dr. Mark Tuszynski ve Dr . UC San Diego W. Marie Campana SC izolasyonu için yararlı öneriler ve protokol için. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (CBET 0941055 ve CBET 1510895), Ulusal Sağlık Enstitüsü (R21CA176854, R01GM089866 ve R01EB014986) tarafından kısmen desteklenmiştir.

hücrelerin izolasyonu için tüm prosedürler, Michigan State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Önceden gerilmiş Anisotropik Yüzeyin hazırlanması 1. <ol><li> taban ve sertleştirme maddesinin 1 çözeltisi ve bir doku kültürü kabı (12 cm çapında) içine dökün: 10 karıştırın. 4900 mg tabanı ve toplam çapraz bağlama karışımı için sertleştirici 490 mg kullanın. </li><li> Hava kabarcıklarını uzaklaştırmak için 20 dakika süreyle vakum altında jel karışımı tutun. </li><li> 60 ° C de bir gece sertleştirme fırında jel karışımı yerleştirin. </li><li> PDMS membran tedavileri sonrasında, 165 mTor 3 dakika ve O 2 65 sccm akışı için bir plazma temizleme / aşındırma sistemi kullanılarak oksijen plazma ile yüzey davranın. </li><li> haberdar olmak hangi tarafı oksijen tedavi ise, çanak dikdörtgen membranın (5 × 3.5 cm) bir parça kesin emin oksijen tedavi tarafı karşı karşıya makyaj ve germe çerçeve üzerine sabitleyin. Bir çerçeveye yerleştirin<html> sahne germe ve eşit 10% uzama ulaşıncaya kadar sahnede düğmeyi çevirerek streç (ya da diğer bazı önceden belirlenmiş streç; uzama doğrudan germe aşamasından okunabilir) uzun eksen 9. çerçeve vidaları sıkarak streç sabitleyin. </li><li> aşamasından çerçeveyi çıkarın. membran yüzeyi kuru ve tozsuz olduğundan emin olun, sonra zara sıkıca bağlamak için odasının yapışkan tarafını sağlayan zar üzerine bir silikon odasına yerleştirin. Not: Silikon odası PDMS zarı üzerinde hücre orta tutmak için bir kuyu sağlar. Cihaz tasarımı Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> 10 dakika boyunca UV ile yüzey sterilize edin. </li><li> Ekle 1 ml poli-L-lizin plazma işlemi 6 saat içinde oda içinde PDMS yüzeyine (PLL) (fosfat tamponlu salin içinde% 0.01) ve 37 ° C de 2 saat inkübe DRG nöronlarını tohumlanmasından önce. Bu hücre eki artırır. </li></ol>DRG le &quot;&gt; 2. İzolasyon <ol><li> DRG nöronlar için standart büyüme ortamı hazırlayın. </li><li> izolasyon öncesinde, izolasyon ekipmanları ve filtre reaktifleri otoklav. 6 oyuklu plakanın bir kuyuya yalıtım tamponu 5 ml, ve buz üzerinde plaka koyun. 9 mi% 0.05 tripsin-EDTA (1 mg / ml), kolajenazın (500 U / ml), 1 ml ekleyerek ayrışma ortamı 10 ml hazırlamak buz üzerinde 0.22 um&#39;lik bir filtreden ve yer ile çözümler filtre. </li><li> izolasyonu için 7 gün &#39;Sprague-Dawley sıçanları - on 5 oniki kullanın. % 75 izopropanol ile yavrular Sprey ve boyunları vurularak kurban. </li><li> arka omurilik örten cilt kesip ve omurga etrafında herhangi bir aşırı doku kaldırmak. cerrahi spot ışıklandırma cerrahi büyüteç altında bir kesim makas ile her iki tarafta omurga boyunca, sonra boynundan ilk kesi yapmak ve. Yavruların vücuttan omurga ayırın ve aşırı kas çıkarın. Ardından, lon boyunca kesmek için makas kullanınomurga ve kullanımı cımbız g ekseni tam omurga açıp steril bir 15 ml tüp içine yalıtım tamponu DRG&#39;ler aktarımı için daha büyük bir açıklık oluşturmak için bir pipet spinal cord.Remove uç elde etmek için. </li><li> cımbız ince çifti kullanılarak, kemik cebinden ganglion kaldırmak ve yaklaşık 10 toplamak - Her iki taraftan 16 DRG. sinir kökleri Trim ve buz gibi soğuk izolasyon tampon ganglionlar aktarın. </li><li> steril bir 15 ml tüp içine yalıtım tamponu DRG&#39;ler aktarımı için daha büyük bir açıklık oluşturmak için bir pipetten ucu çıkarın. Kimyasal ayırmadan sonra, santrifüj 900 x g&#39;de 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de gangliyon. </li><li> dokular tüpün dibine çöker ve yavaşça üstüne izolasyon tampon kaldırmak ve tüp içine ayrışma ortamı 10 ml ekleyelim. </li><li> 10 dakika - tüp her 5 çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C su banyosu içinde ayrışma ortamı içinde parçalara dokuların inkübe edin. </li><li> SonraKimyasal ayrışma santrifüj 900 xg&#39;de gangliyon ve 5 dakika için 4 ° C. </li><li> Süpernatantı ve 10 ml standart büyüme ortamı ve vorteks pelet yeniden askıya. </li><li> bir kez daha bölüm 2.9 de belirtildiği gibi ayrışmış hücreleri Santrifüj. </li><li> Süpernatantı standart büyüme ortamı ve vorteks 12 ml pelet yeniden askıya. </li></ol> Önceden gergin Yüzeyde DRG 3. Kültür <ol><li> , Hücrelerin ekim odasından PLL çözümleri kaldırmak ve steril su ve kuru hava ile PDMS yüzeyin durulanması önce. </li><li> 2 dakika enkaz tüpün dibine yerleşmek için izin - hücrelerin yeniden askıya sonra, 1 için süspansiyon seti sağlar. Her streç odasına hücre süspansiyonu, 1.5 ml ilave edilir ve% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 10 ul (veya 15 ul) floro-2-deoksi-uridin ve üridin (FDU-U) stok soluti karışımı ekleyin, in vitro 1 gün (DIV) de, glial hücreleri ortadan kaldırmak için(Malzeme Tablo bakınız) de her birine. 7 saat sonra, taze, standart büyüme ortamı ile orta yerine ve% 5 CO2 ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde, önceden gerilmiş bir kültür Cihazı. </li><li> Hücre kültürü döneminde (2-3 hafta), taze ortam ile yarım harcanan orta değiştirerek her iki günde bir ortamı değiştirmek. Not: 2 hafta boyunca gerilmiş gerek gerilmemiş yüzeylerde kültürlendikten sonra arıtılmış, SC&#39;ler bölmeye ilave edilir ve bir hafta (aşama 4.7) kültürlendi. </li></ol> Önceden gergin Yüzey üzerinde DRG Nöronlar ile Schwann Hücreleri (SC&#39;ler) 4. Co-kültür <ol><li> Dr Campana&#39;nın grubuna daha önce 15 tarafından açıklandığı gibi SC&#39;ler izole eder. <ol><li> Kısaca, bir 1 gün eski yavru SC&#39;ler izole eder. Toplayın ve mekanik siyatik sinirleri kimyasal (Tripsin-EDTA ve kollajenaz A) hem de (18 gauge iğne / 10 ml şırınga) 15 ayırmak. </li><li> poli-D-lisin (PDL) co ayrışmış hücreleri Tohum% 5 CO2 37 ° C&#39;de ATED T25 şişesi ve kültür. 5. günde, anti-Thy 1.1 antikoru ve tavşan komplemanı kullanılarak antikor seçimi ile hücrelerin saflaştırılması ve geçişi ile 2 saflaştırılmış hücreleri alt-kültürü - Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM),% 10 fetal inek serumu ihtiva eden 4. kültür ortamı (FBS) ,% 1 Penisilin / Streptomisin (Penn / Strep), 21 ug / ml büyükbaş hayvan hipofız bezi (BPB) ayıklamak ve 4 uM Forskolin. </li></ol></li><li> SC&#39;ler kültür ortamının çıkarın ve şişeye 5 mi,% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin. 3 dakika - 2% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> bu şişeden kaldırın, ardından da, kültür ortamının 5 ml ilave edilir ve şişe hücreler ile karıştırmak için 10X objektif kullanılarak optik mikroskop altında Hücrelerden. </li><li> 200 xg, 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne ve santrifüj hücre süspansiyonu ilave edilir ve 5 dakika boyunca 20 ° C. </li><li> Süpernatantı ve 7 ml standart DRG büyüme med peletia. </li><li> Bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine hücre süspansiyonu 10 ul alır tripan mavisi 10 ul ile kanştınn, ve daha sonra bir 10X objektif kullanılarak optik mikroskopta hemasitometre kullanılarak hücre sayısı. DRG büyüme ortamı ekleyerek ml başına 5.000 hücreleri hücre süspansiyonu seyreltilir. </li><li> gerilmiş bölme DRG kültüründen 0.5 ml ortamda çıkarın ve DRG kültüre SC süspansiyon 0.5 ml ilave ediniz. </li><li> Kültür, 37 ° C&#39;de ve% 5 CO 2. değiştirme 1 hafta hücreler ortam DRG taze standart büyüme ortamı yarı harcanan ortamının değiştirilmesiyle her iki günde. 1 hafta ko-kültür sonrası işlem immünohistokimyasal 10, hücrelerin. </li></ol>

<ol><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+C+%22Layer-by-Layer+Films+for+Biomedical+Applications%22">Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications</a>. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).</li>
<li>Faweett, J. W., Keynes, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+Nerve+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral Nerve Regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).</li>
<li>Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+adult+rat+corticospinal+tract+by+transplants+of+olfactory+ensheathing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells.</a> Science. 277, 2000-2002 (1997).</li>
<li>Geller, H. M., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+bridge%3A+Engineering+spinal+cord+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Building a bridge: Engineering spinal cord repair.</a> Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).</li>
<li>Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury+is+accompanied+by+chronic+progressive+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination.</a> J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).</li>
<li>Chua, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+neurites+sense+the+depth+of+the+underlying+topography+during+neuronal+differentiation+and+contact+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance.</a> Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).</li>
<li>Dowell-Mesfin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographically+modified+surfaces+affect+orientation+and+growth+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons.</a> J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).</li>
<li>Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+small+on+large%3A+Potential+utility+in+computations+of+fluid-solid+interactions+in+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Method+Appl+M%22%5BJournal%5D)">Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries.</a> Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Static+Pre-stretch+Induced+Surface+Anisotropy+on+Orientation+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+pre-stretch+induced+surface+anisotropy+on+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration.</a> Tissue Eng Part C Methods. , (2015).</li>
<li>Berns, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+neurite+outgrowth+and+directed+cell+migration+in+self-assembled+monodomain+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels.</a> Biomaterials. 35, 185-195 (2014).</li>
<li>Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neuron%2Fastrocyte+co-culture+on+polyelectrolyte+multilayer+films%3A+A+template+for+studying+astrocyte-mediated+oxidative+stress+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons.</a> Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neurite+growth+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+and+increased+colocalization+with+Schwann+cells+on+aligned+poly%28methyl+methacrylate%29+electrospun+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers.</a> Brain Research. 1565, 18-27 (2014).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+Extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+Density+Lipoprotein+Receptor-related+Protein+%28LRP1%29+Regulates+Rac1+and+RhoA+Reciprocally+to+Control+Schwann+Cell+Adhesion+and+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).</li>
<li>Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stability+of+plasma+oxidized+PDMS+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).</li>
<li>Lopera, S., Mansano, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-Based+Surface+Modification+of+Polydimethylsiloxane+for+PDMS-PDMS+Molding%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding.</a> ISRN Polymer Science. 2012, (2012).</li>
<li>Chandra, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChandra%2C+G+%22Organosilicon+Materials%22">Organosilicon Materials</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).</li>
<li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+poly%28dimethylsiloxane%29+surface+modification+to+control+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Surf+Interface+Anal%22%5BJournal%5D)">Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion.</a> Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-channel+scaffolds+to+promote+spinal+cord+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration.</a> Biomaterials. 27, 419-429 (2006).</li>
<li>Clarke, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+methacrylate+polymers+direct+spiral+ganglion+neurite+and+Schwann+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth.</a> Hearing Res. 278, 96-105 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

önceden gerilmiş bir yüzeye akson hizalama teşvik etmek için, iki kritik adımlar vardır: 1) PDMS zarı ve homojen kalınlıkta düz olmalıdır; ve 2) glia hücreleri DRG uzaklaştırılmalıdır. PDMS ve çapraz bağlayıcı karıştırma ve bir fırında kür sonra, çapraz PDMS jel düz bir tezgah üstünde tutulur ve herhangi bir eğilmesini önlemek için dikkatle ele alınmalıdır. Plazma tedaviden sonra (hücre bağlanması için gerekli olan) sert yüzeye adsorbe zamanla azaltır çünkü PDMS dokunun oksijen plazma işleme PLL kaplama ile 6 saat içind...

Sinir yaralanmalarının ise, yakın ve uzak sinir kütükleri çoğu zaman lezyon yerinde 1-2 sinir liflerinin direkt yeniden düzenlenmesi engellenir. Normalde, akson yolları bağlantı karmaşık ağlar oluşturan aksonların çok düzenli ve uyumlu demetleri, oluşmaktadır. Ancak, sinir rejenerasyonu kötü organize akson hizalama 3-4 dolayı kaotik bir süreçtir. Bu nedenle, lezyon yerinin köprü aksonlar rejenere yeterli bir sayı üretmek için, iyi organize aksonal hizalanma yaratmak için de gereklidir. Ayrıca, demiyelinizasyon yaralanma yerinde myelinating hücrelerin ölümüne bağlı sinir yaralanmaları eşlik eder. Demiyelinizasyon kuvvetle aksonlar hayatta iletken kapasitesini bozar yana, demiyelinizasyon hedefleme veya yeniden miyelin oluşumunu teşvik tedaviler sinir hasarı 5 sonra fonksiyonel iyileşme için önemlidir. Dolayısıyla, bu protokolün amacı, bu iki konuyu ele alan bir mühendislik yaklaşımı göstermektirSinir rejenerasyon. Bir malzemenin fiziksel ve mekanik özellikleri, farklı eksenler boyunca ölçüldüğünde, bir fark olarak tanımlanan yüzey anizotropi, hücre hizalama, büyüme ve taşıma 6-7 etkilemek için uygulanmaktadır. topografya ek olarak, anizotropi indükleme için diğer yöntemler bulunmaktadır. Daha önce, poli-dimetil-siloksan (PDMS) membranın mekanik statik ön streç neden olduğu yüzey anizotropi incelenmiştir. &quot;Büyük uygulanan küçük deformasyon süper&quot; teorisi hücreleri gerilmiş yönde anlamda etkili bir sertliği dik yönde farklıdır tahmin ve etkin sertlikteki bu fark anizotropi 8 yüzey kaynaklanmaktadır. Önceden gerilmiş PDMS zar üzerinde kültürlenmiş mezenkimal kök hücreler (MSC&#39;ler) aktif yüzeyi çekerek ve bunun sonucu olarak anizotropiye duyu önceden gerilmiş yönde 9 hizalamak edebiliyoruz. Benzer şekilde, anizotropik yüzey armekanik ön-gerilmiş yüzeyinden ising sırt kök gangliyonu hizalamasını yanı sıra büyüme ve miyelinasyonun (DRG) 10 aksonlar etkiler. Burada akson rejenerasyonu 10 artırmak için statik bir önceden gerilmiş PDMS substrat yüzey anizotropi uyarılması için bir protokol sağlar. Akson hizalama, istenilen desenleri ile topolojik özellikleri ortaya çıkarmak için, hizalanmış lifleri ve kanallar 6,11-12 ile temas rehberlik sağlamak için rapor, akson hizalama 11,13 kolaylaştırmak için ortaya konmuştur. Ancak, bu tür lifleri, kanallar ve desen olarak topolojik özellikler aracılığıyla akson hizalama uyarılması için teknikler bildirdi uzatmak ve akson kalınlığını artırmak için koyamadık. Tersine, mekanik kademeli bir esneme 14 büyüklüğü arttı daha uzun ve daha kalın akson streç yönünde akson hizalama yol germe. Bununla birlikte, in vivo koşullarında, bir çalışan motorlu cihazı içeren değildirmümkün. Bunun aksine, statik önceden gerilmiş neden anizotropi daha az karmaşık ve daha kolay bir şekilde in vivo uygulamalar için gelecekteki iskele tasarımlar içine dahil edilebilir. Bu protokol, statik önceden gerilmiş hücre kültür sistemi topolojik özellikler olmadan yüzey anizotropi indüklemek için kullanılır. Membran çerçevesi üzerine sabitlenir ve önceden tespit edilmiş bir germe büyüklüğü germe aşaması uygulanır, bunun üzerine önceden gerilmiş kültür sistemi, PDMS zar, bir gerilebilir çerçeve ve bir germe aşamasında oluşmaktadır. 21 güne kadar önceden gerilmiş yüzünde kültür taze izole DRG nöronları akson hizalama ve kalınlık için izlenir. Daha sonra, Schwann hücreleri (SCS) miyelinasyon izlenir hizalanmış aksonlar ile birlikte kültürlendi. Ön streç kaynaklı yüzey anizotropi birleşmeyle biz MSC ve DRG nöronlarının sırasıyla 9-10, hücre hizalama farklılaşma ve akson hizalama büyümeyi artırmak başardık.

<table><tbody><tr><td>Nörobazal Orta 1x</td><td>GibcoBRL</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 Takviyesi 50x</td><td>GibcoBRL</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I 100x</td><td>GibcoBRL</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Albumax-I</td><td>GibcoBRL</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>Sinir Büyüme Faktörü-7S</td><td>Invitrogen</td><td>13290-010</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>GibcoBRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>%0,05 Tripsin-EDTA/1 mM EDTA</td><td>GibcoBRL</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin</td><td>Trevigen</td><td><a href="http://www.trevigen.com/item/2/7/64/220/Cultrex_PolyLLysine/">3438-100-01</a></td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizin</td><td>Sigma</td><td>p-6407</td><td></td></tr><tr><td>Floro-2 deoksi-üridin</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Üridin</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>Çile' s Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td> <td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td>İzolasyon Tamponu</td></tr><tr><td>Tip I Kollajenaz</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile İnaktive Fetal Sığır Serumu</td><td>Hiklonu</td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Klonları</td><td>CC-4009</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Calbiochem</td><td>344270</td><td></td></tr><tr><td>Silikon odası</td><td>Greiner bio-one</td><td>FlexiPERM ConA</td><td></td></tr><tr><td>Plazma temizleme/aşındırma sistemi</td><td>March Instruments</td><td>PX-250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Thy 1.1 antikoru</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>M7898</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan Kompleman</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S-7764</td><td></td></tr><tr><td>Standart büyüme ortamı</td><td></td><td></td><td>500 ml Nörobazal Ortam 1x için 10 ml B-27 50x, 5 ml Glutamax-I 100x, 2.5 ml Penisilin / Streptomisin (Penn / Strep), 1 ml Albumax-I ve 1 & mu ekleyin; l NGF-- 7S (50 &mu; g/ml).</td></tr><tr><td>FDU Üridin stok çözeltisi</td><td></td><td></td><td>FDU 10 mg 10 ml ddH2O (10 mg / ml) içinde 10 mg, davlumbazda süzün ve 500 & mu'ya bölünmüş; l alikotlar ve -20 &gtm;C'de saklayın. Uridine 5 g 166.7 ml ddH 2O (33 mg / ml) içinde, davlumbazda süzün, 200 & mu'ya bölün; l alikotlar ve -20 &gtm;C'de saklayın.
61.5 &mu alın; l FDU (10 mg / ml) ve 20.5 &mu; l Uridin (33 mg / ml) ve 4,918 &mu ekleyin; l ddH2O'yu nihai stok konsantrasyonuna getirin, ardından 1 ml alikotlara bölün ve -20 &gtm;C'de saklayın.</td></tr></tbody></table>

bir yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur artırma

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Akson rejenerasyonu, büyük ölçüde düzensiz akson hizalamasına bağlı kaotik bir süreçtir. Bu nedenle, yeterli sayıda rejenere aksonun lezyon bölgesini köprülemesi için, uygun şekilde organize edilmiş aksonal hizalama gereklidir. Sinir yaralanması sonrası demiyelinizasyon, hayatta kalan aksonların iletken kapasitesini güçlü bir şekilde bozduğundan, remiyelinizasyon, rejenere sinirlerin başarılı bir şekilde çalışması için kritik öneme sahiptir. Daha önce, mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) gerilme öncesi indüklenmiş anizotropik bir yüzey üzerinde hizalandığını gösterdik, çünkü hücreler gerilmiş yönde dikey yöne göre daha büyük bir etkili sertlik algılayabilir. Ayrıca, mekanik olarak önceden gerilmiş bir yüzeyden kaynaklanan anizotropik bir yüzeyin, aksonların hizalanmasını, büyümesini ve miyelinleşmesini benzer şekilde etkilediğini gösterdik. Burada, önceden gerilmiş bir anizotropik yüzeyin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol, önceden gerilmiş bir yüzey üzerinde dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının izolasyonu ve kültürü ve önceden gerilmiş bir yüzey üzerinde Schwann hücreleri (SC'ler) ile DRG nöronlarının bir ko-kültürünün miyelinleşme davranışını gösteriyoruz.

Önceden gerilmiş hücre kültür sistemi DRG akson hizalama 10 terfi. DRG nöronları için 12 gün önceden gerilmiş gerek gerilmemiş yüzeylerine kültürlenmiştir. Aksonlar hizalarını göstermek için β-III-tubulin boyandı. 2 Kültür 12 gün sonra önceden gerilmiş gerek gerilmemiş PDMS yüzeylerde akson yönünü karşılaştırır Şekil. rastgele uyum gösterdi ve gerilmemiş PDMS substrat üzerinde birbirine bağlı bir ağ kurdu ise DRG aksonlar, gergin doğrultusuna ...

Bu protokol, sıçanlardan izole edilen dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının izolasyonunu ve akson hizalamasını geliştirmek için statik önceden gerilmiş bir hücre kültürü sistemi üzerinde DRG nöronlarının kültürünü ve ardından miyelinasyonu teşvik etmek için Schwann Hücrelerinin (SC'ler) ko-kültürünü tanımlar.

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Bu protokolün genel amacı, statik ve önceden gerdirilmiş bir hücre kültürü sistemi kullanarak dorsal kök ganglion nöronlarının akson hizalanmasını ve miyelinasyonunu artırmaktır. Bu yöntem, sinir dokusu mühendisliği alanındaki akson hizalanması ve kalınlık artışı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, önceden gerdirme yönteminin yalnızca akson hizalanmasını geliştirmekle kalmayıp aynı zamanda miyelinasyonu da teşvik etmesidir.Bu prosedüre başlamak için, baz ve kürleme maddesi karışımını bir doku kültürü kabına dökün. Hava kabarcıklarını gidermek için jel karışımını 20 dakika boyunca vakum altında tutun. Ardından, jel karışımını gece boyunca kürlenmesi için 60 °C'deki fırına yerleştirin.PDMS membran kürlendikten sonra, yüzeyi plazma temizleme ve aşındırma sisteminde üç dakika boyunca oksijen plazması ile işleyin. Ardından, kaptan dikdörtgen şeklinde bir membran parçası kesin. Oksijenle işlem görmüş tarafı yukarı bakacak şekilde bir germe çerçevesine sabitleyin.Ardından çerçeveyi bir germe düzeneğine yerleştirin ve uzun eksende %10 uzamaya ulaşana kadar düzeneğin üzerindeki düğmeyi çevirerek eşit şekilde gerin. Sonra, çerçeve üzerindeki vid

an-approach-to-enhance-alignment-myelination-dorsal-root-ganglion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada dorsal kök gangliyon kültür duyusal nöronlar için kompartman odaları hazırlanması ve bakımı tekniği açıklar.

Kompartman Kültürleri Dorsal Kök Ganglia Nöronlar hazırlanması ve Bakım

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

Video, dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının Schwann hücreleri ile birlikte kültürlenmesini göstermektedir. DRG nöronları ilk olarak hizalanmış akson büyümesi için önceden gerilmiş bir zar üzerinde büyütülür. Daha sonra aksonlara bağlanan, onları izole eden ve nöral hücre sağkalımını ve işlevini destekleyen Schwann hücreleri tanıtılır.

Schwann Hücrelerinin Önceden Gerilmiş Bir Zar Üzerinde DRG Nöronları ile Ko-Kültürü

Bu video, dorsal kök gangliyonlarından nöronal kültürleri immünopanning yoluyla zenginleştirmek ve böylece saflıklarını ve nörolojik araştırmalar için faydalarını geliştirmek için bir protokol göstermektedir.

Dorsal Kök Gangliyonlarının İmmünopanning ile Nöronal Zenginleştirilmesi

Bu video, bir dorsal kök ganglion eksplant ve Schwann hücrelerinin kokülasyon modelini göstermektedir. Kokültür koşullarında, askorbik asit, Schwann hücrelerinin miyelinatör formlara farklılaşmasını teşvik eder. Miyelinizan Schwann hücreleri, sinir fonksiyonu için gerekli olan bir miyelin kılıfı oluşturmak için aksonları birden çok kez sarar.

Nöron Miyelinasyonu için Dorsal Kök Ganglion Eksplantının Schwann Hücreleri ile Birlikte Kültürlenmesi

Kaynak: Li, Q. et al. Memeli Akson Rejenerasyonunun Araştırılması: Yetişkin Fare Dorsal Kök Ganglionunun İn Vivo Elektroporasyonu. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, akson rejenerasyonunu incelemek için fare DRG nöronlarının elektroporasyon aracılı transfeksiyonunu göstermektedir. Nükleik asit yapılarını DRG nöronlarına iletmek, siyatik sinir hasarını indüklemek ve aksonal rejenerasyonu değerlendirmek için adımları ana hatlarıyla belirtir.

Duyusal Akson Rejenerasyonunu Teşvik Etmek için Fare Dorsal Kök Gangliyonlarının Elektroporasyon Aracılı Transfeksiyonu

Dorsal kök gangliyon (DRG), periferal sinir sisteminin duyusal nöronlar ihtiva eden yapılardır. Ayrışmış zaman, yaralanma yerinde in vivo ortamda taklit in vitro sinir rejenerasyonu ve miyelin incelemek için değerli bir model sağlayan, Güney Carolina gibi yağ elde edilen kök hücreleri (ASC) ile birlikte kültürlenebilir.

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Bu protokol, duyusal akson rejenerasyonunu incelemek için bir model olarak yetişkin bir sıçanda viral vektör ile bir dorsal kök ganglion (DRG) enjeksiyonunun ve eşzamanlı bir dorsal kök ezilme yaralanmasının kullanımını sunar. Bu model, duyusal akson rejenerasyonunu teşvik etmek için gen terapisinin kullanımını araştırmak için uygundur.

Sırt kök ganglion Enjeksiyon ve Dorsal Kök Duyusal Axon Rejenerasyon Modeli Olarak Ezilme Yaralanması

Tek lifli kayıt, merkezi ve periferik sinir sistemleri için geçerli olan etkili bir elektrofizyolojik tekniktir. Bağlı siyatik sinir ile bozulmamış DRG hazırlanması ile birlikte, iletim yetmezliği mekanizması incelenir. Her iki protokol de periferik sinir sisteminin ağrı ile ilişkisini geliştirmek.

İletim Yetmezliği Mekanizmasını İncelemek Için Bağlı Siyatik Sinir ile In Vivo Tek Lifli Kayıt ve Bozulmamış Dorsal Kök Ganglion Kullanımı

Dorsal kök gangliyonları ve Schwann hücrelerinin kokültür sisteminde, periferik sinir sisteminin miyelinasyonu incelenebilir. Bu model, periferik miyelinasyonu gözlemlemek ve ölçmek ve ilgilenilen bileşiklerin miyelin kılıfı üzerindeki etkilerini incelemek için deneysel fırsatlar sunmaktadır.

Sıçan dorsal kök ganglion eksplantları ve schwann hücrelerinin bir kokültüründe periferik aksonların in vitro miyelinasyonu

Bu protokol, fare Dorsal Kök Gangliyonlarının (DRG) tüm mount ve ayrışmış kültürlerinin oluşturulması için yöntemleri ve bunların tümör-sinir etkileşimlerini değerlendirmek için kullanımlarını açıklar.

Dorsal Kök Gangliyon Kültürünün İn Vitro Modellerinin Oluşturulması: Kanser-Sinir Karışmasının Araştırılmasında Tamamlayıcı Yaklaşımlar

Öğrenin sırt kök ganglion nöronlarının statik ön germeli hücre kültürü sistemi kullanılarak akson hizalaması ve miyelinizasyonunun nasıl artırılacağını. Bu yöntem sinir doku mühendisliği araştırmaları için değerli bir araç sunar.

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Daha fazla video keşfet