Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Bu protokolün genel amacı, statik, önceden gerilmiş bir hücre kültürü sistemi kullanarak dorsal kök ganglion nöronlarının akson hizalamasını ve miyelinasyonunu arttırmaktır. Bu yöntem, akson hizalaması ve kalınlık büyümesi gibi sinir dokusu mühendisliği alanındaki kilit soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bu önceden gerilmiş yöntemin sadece akson hizalamasını arttırmakla kalmayıp aynı zamanda miyelinasyonu da teşvik etmesidir.

Bu işleme başlamak için, baz ve sertleştirici madde karışımını bir doku kültürü kabına dökün. Hava kabarcıklarını gidermek için jel karışımını 20 dakika vakum altında tutun. Daha sonra jel karışımını gece boyunca kürlemek için 60 santigrat derecede fırına koyun.

PDMS membranı sertleştikten sonra, yüzeye plazma temizleme ve aşındırma sisteminde üç dakika boyunca oksijen plazması uygulayın. Daha sonra, tabaktan bir parça dikdörtgen zar kesin. Oksijenle tedavi edilen tarafı yukarı bakacak şekilde gerici bir çerçeveye sabitleyin.

Ardından çerçeveyi bir germe aşamasına yerleştirin ve daha uzun eksende %10 uzamaya ulaşana kadar sahne üzerindeki düğmeyi çevirerek eşit şekilde gerin. Ardından, çerçevedeki vidaları sıkarak gerginliği sabitleyin. Bundan sonra, çerçeveyi sahneden çıkarın.

Membranın üzerine bir silikon hazne yerleştirmeden önce membran yüzeyinin kuru ve tozsuz olduğundan emin olun. Haznenin yapışkan tarafının zara sıkıca yapışmasına izin verin. Daha sonra yüzeyi 10 dakika UV ile sterilize edin.

Daha sonra, plazma işleminden sonraki altı saat içinde haznedeki PDMS yüzeyine bir mililitre PLL ekleyin. Daha sonra, hücre bağlanmasını artırmak için DRG nöronlarını tohumlamadan önce 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Bu adımda, DRG nöronları için standart büyüme ortamını hazırlayın.

İzolasyondan önce, izolasyon ekipmanını ve filtre reaktiflerini otoklavlayın. Altı oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna beş mililitre izolasyon tamponu ekleyin ve plakayı buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra dokuz mililitre% 0.05 Tripsin-EDTA'ya bir mililitre kollajenaz A ekleyerek 10 mililitre ayrışma ortamı hazırlayın.

Çözeltiyi 0.22 mikrometre filtre ile filtreleyin ve buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, 10 ila 12 beş ila yedi günlük SD sıçanları kurban edin ve her birinin arkasından omuriliğin üzerindeki cildi kesin. Omurga etrafındaki fazla dokuyu çıkarın.

Cerrahi bir büyüteç altında, boyundan ilk kesiyi yapın, ardından her iki tarafta omurga boyunca makasla bir kesik yapın. Omurgayı yavrunun vücudundan ayırın ve fazla kasları çıkarın. Daha sonra omurganın uzun ekseni boyunca kesin ve omuriliği çıkarmak için omurgayı tamamen açmak için cımbız kullanın.

Sonra, ganglionu kemik cebinden çıkarın. Sinir köklerini kesin ve gangliyonları buz gibi soğuk izolasyon tamponuna aktarın. Her iki taraftan yaklaşık 10 ila 16 DRG toplayın.

Yavruların geri kalanı için diseksiyon prosedürünü tekrarlayın. Şimdi, izolasyon tamponlu DRG'leri steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Dokunun tüpün dibine çökmesine izin verin ve üstteki izolasyon tamponunu nazikçe çıkarın.

Daha sonra tüpe 10 mililitre ayrışma ortamı ekleyin. Diseke edilen dokuları ayrışma ortamında 37 derecelik bir su banyosunda bir saat boyunca inkübe edin ve tüpü her beş ila 10 dakikada bir sallayın. Kimyasal ayrışmadan sonra, gangliyonları beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Beş dakika sonra, süpernatanı çıkarın, peleti 10 mililitre standart büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve girdaplayın. Daha sonra, ayrışmış hücreleri bir kez daha santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı çıkarın, peleti 12 mililitre standart büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve girdaplayın.

Hücreleri tohumlamadan önce, PLL çözeltisini hazneden çıkarın. PDMS yüzeyini steril suyla durulayın ve havayla kurutun. Hücreleri yeniden askıya aldıktan sonra, döküntülerin tüpün dibine çökmesini sağlamak için süspansiyonun bir ila iki dakika oturmasına izin verin.

Daha sonra, gerilmiş her odaya 1,5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Glial hücreleri bir günde in vitro olarak ortadan kaldırmak için, her oyuğa 10 mikrolitre veya 15 mikrolitre FDU-U karışım stoğu çözeltisi ekleyin. Yedi saat sonra, bu ortamı taze standart büyüme ortamı ile değiştirin ve önceden gerilmiş kültür cihazını% 5 CO2'de 37 derecelik bir santigrat derece inkübatöre yerleştirin.

Hücre kültürü periyodu boyunca, harcanan ortamın yarısını taze ortamla değiştirerek ortamı her iki günde bir değiştirin. Bu prosedürde, kültür ortamını Schwann hücrelerinden çıkarın ve şişeye beş mililitre% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 CO2'de iki ila üç dakika inkübe edin.

Şişeden yukarı kalkıp kalkmadıklarını görmek için 10X objektif kullanarak hücreleri optik mikroskop altında kontrol edin. Daha sonra şişedeki hücrelere beş mililitre kültür ortamı ekleyin ve karıştırın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne ekleyin ve beş dakika boyunca 20 santigrat derecede santrifüjleyin.

Daha sonra süpernatanı çıkarın ve peleti yedi mililitre standart DRG büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Bunu takiben, 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 0.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 10 mikrolitre Tripan mavisi ile karıştırın ve ardından 10X objektif kullanarak bir hemositometre ile hücre sayısını sayın.

Hücre süspansiyonunu mililitre başına 5.000 hücreye seyreltmek için DRG büyüme ortamını ekleyin. Daha sonra, gerilmiş odadaki DRG kültüründen 0.5 mililitre ortamı çıkarın ve DRG kültürüne 0.5 mililitre Schwann hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri bir hafta boyunca 37 santigrat derecede% 5 CO2'de kültürleyin.

Harcanan ortamın yarısını taze standart büyüme ortamıyla değiştirerek ortamı iki günde bir değiştirin. Gerilmiş ve gerilmemiş yüzeylerde iki hafta boyunca kültürlendikten sonra, saflaştırılmış Schwann hücreleri odaya eklendi ve bir hafta daha kültürlendi. Burada gösterilen, gerilmiş yüzeydeki aksonlar için beta-III tübülin boyamasıdır.

Ve bu, gerilmiş yüzey üzerinde beta-III tübülin ve P0 boyamasının üst üste binmesidir, bu da Schwann hücrelerinin aksonlara bağlı olduğunu ve muhtemelen miyelinleştiğini düşündürür. Bu görüntü, gerilmemiş yüzeydeki aksonlar için beta-III tübülin boyamasını göstermektedir. Ve gerilmemiş yüzey üzerindeki beta-III tübülin ve P0 boyamasının üst üste binmesi, Schwann hücrelerinin aksonlara bağlı olmadığını göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç ila dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, PDMS membranını düz ve homojen kalınlıkta tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, akson lensi ve Schwann hücrelerinin göçü gibi ek soruları yanıtlamak için önceden gerilmiş mikrokanallar gibi atomizörler gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların, omurilik ve siyatik sinirde sinir rejenerasyonu üzerindeki yüzey anizotropisinin rolünü keşfetmelerinin önünü açacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, önceden gerilmiş cihaz kullanarak akson hizalamasını ve miyelinasyonu nasıl indükleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.