Name: RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Öğrenin, hedeflenen RNA sıralama yöntemiyle gen ifadesi, mutasyonlar ve gen füzyonlarını analiz etmeyi. Bu maliyet etkin teknik, moleküler biyolojide önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik destek için Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto ve Eric Samorodnitsky'ye özel teşekkürlerimizi sunarız. Ekibimize verdiği idari destek için Jenny Badillo'ya da teşekkür ederiz. Ohio Süper Bilgisayar Merkezi'ne (OSC) disk alanı, işlem kapasitesi ve analizlerimizi yürütmek için destek sağladığı için teşekkür ederiz. Ohio Eyalet Üniversitesi Wexner Tıp Merkezi'ndeki Kapsamlı Kanser Merkezi'ne (CCC) bu çalışmaya idari destekleri için teşekkür ederiz. SR ve Ekibi, Amerikan Kanser Derneği (MRSG-12-194-01-TBG), Prostat Kanseri Vakfı Genç Araştırmacı Ödülü, NHGRI (UM1HG006508-01A1), Fore Kanser Araştırma Vakfı, Amerikan Akciğer Derneği ve Pelotonia tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Mercer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequencing+for+gene+discovery+and+quantification+using+RNA+CaptureSeq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq.</a> Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).</li>
<li>Maher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+transcript+discovery+by+paired-end+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).</li>
<li>Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+identification+of+genomic+variants+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data.</a> Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).</li>
<li>Quinn, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+strategies+for+SNP+detection+in+RNA-seq+data%3A+application+to+lymphoblastoid+cell+lines+and+evaluation+using+1000+Genomes+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data.</a> PLoS One. 8, e58815(2013).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eSNV-detect%3A+a+computational+system+to+identify+expressed+single+nucleotide+variants+from+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data.</a> Nucleic Acids Res. 42, e172(2014).</li>
<li>Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf">http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf</a> (2010).</li>
<li>Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf">http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf</a> (2013).</li>
<li>Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf</a> (2013).</li>
<li>Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html">https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html</a> (2012).</li>
<li>Andrews, S. FastQC. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2015).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14, R36(2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>Broad Institute. Picard. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> (2014).</li>
<li>DeLuca, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-SeQC%3A+RNA-seq+metrics+for+quality+control+and+process+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization.</a> Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).</li>
<li>Van der Auwera, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+FastQ+data+to+high+confidence+variant+calls%3A+the+Genome+Analysis+Toolkit+best+practices+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline.</a> Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChimeraScan%3A+a+tool+for+identifying+chimeric+transcription+in+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data.</a> Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).</li>
<li>Kim, D., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat-Fusion%3A+an+algorithm+for+discovery+of+novel+fusion+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts.</a> Genome Biol. 12, R72(2011).</li>
<li>Fernandez-Cuesta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+fusion+genes+in+lung+cancer+using+breakpoint+assembly+of+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 7(2015).</li>
<li>Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncofuse%3A+a+computational+framework+for+the+prediction+of+the+oncogenic+potential+of+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions.</a> Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gene+profiling+of+long+noncoding+RNAs+with+targeted+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing.</a> Nat Methods. 12, 339-342 (2015).</li>
<li>Cieslik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exome+capture+RNA-seq+for+highly+degraded+RNA+with+application+to+clinical+cancer+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing.</a> Genome Res. , (2015).</li>
<li>Cabanski, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+hybrid+capture+improves+transcriptome+analysis+on+low-input+and+archived+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples.</a> J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).</li>
<li>Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+screening%3A+from+the+RT-PCR+to+the+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Lung+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq.</a> Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA-Seq+by+poly+%28A%29+capture%2C+ribosomal+RNA+depletion%2C+and+DNA+microarray+for+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling.</a> BMC Genomics. 15, 419(2014).</li>
</ol>

S.R., klinik deneylerin yürütülmesi için Novartis ve Ariad Pharmaceuticals'tan fon almaktadır. S.R. birinci dereceden aile üyelerinin Johnson and Johnson'da hisseleri var.

RNAseq Yakalama RNAseq ve mikroarray arasında bir ara stratejisi transcriptome bir bölümüne değerlendirmek için yaklaşımlarının. Yakalama avantajları genomik değişikliklerin bir masaüstü sequencer, yüksek verimlilik ve algılama maliyeti, hızlı gerçekleştirme süresi azaltılmış sayılabilir. Yöntem olup, kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar 23 karakterize tek bir nükleotidi tespit etmek için adapte edilebilir RNA bağlama incelemek ve genin füzyon ya da yapısal yeniden 24 tanımlamak için, 4-6 varya...

Tüm transkriptom veya RNA dizileme (RNAseq), tüm RNA ürünlerini değerlendirmek için tarafsız bir dizileme yöntemidir. Hedeflenen RNAseq'in (Yakalama) amacı, standart RNAseq'e kıyasla artan hassasiyet, dinamik aralık, düşük maliyet veya ölçek ve artan verim ile seçilen transkriptlerin odaklanmış bir değerlendirmesidir. Standart RNAseq'e benzer şekilde, gen ekspresyonu, mRNA, mikroRNA (miRNA), lncRNA1, diğer kodlamayan RNA'lar2, gen füzyonları3 ve mutasyonlar4-6 gibi çoklu RNA türlerini değerlendirmek için hedefli zenginleştirme yaklaşımları kullanılabilir.
Yakalama, dizileme için cDNA kitaplıklarını zenginleştirmek için tamamlayıcı oligonükleotidlerin hibridizasyonunu içerir. RNAseq Yakalamanın mantığı, tamamlayıcı oligonükleotidlerin veya probların numunelere hibritlendiği ve daha sonra nispi bolluk için ölçüldüğü mikrodizi yaklaşımlarına benzer. Mikrodizi teknolojileri için ifade, bu problara bağlanan transkriptler için ölçülen bağıl sinyale dayanır. Mikrodiziler bu nedenle aralık, spesifik olmayan bağlanmadan kaynaklanan potansiyel arka plan gürültüsü ve probların çapraz hibridizasyonu ile sınırlıdır. Ayrıca, diziler, RNAseq1'e kıyasla düşük ve yüksek oranda ifade edilen transkriptler için sınırlı dinamik aralığa sahiptir. Mikrodiziler, RNAseq'e kıyasla düşük maliyetleri ve yüksek verim kapasiteleri nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. 
Burada, transkriptomu değerlendirmek için RNAseq ve mikrodizi yaklaşımları arasında bir orta yol sunan RNAseq Yakalama için bir yöntem gösteriyoruz. RNAseq Capture, orta verime, daha yüksek dinamik aralığa ve hassasiyete sahiptir ve masaüstü sıralayıcılarda hızlı geri dönüş için ölçeklendirilmiştir. RNAseq Capture ayrıca depolama alanı ve veri işleme açısından daha az hesaplama kaynağı gerektirir.

<table><tbody><tr><td>Termomikser R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler Biyoloji Sınıfı Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Termoblok 24 x 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reaktif Kiti v2 (300- döngüler)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Masaüstü Sıralayıcı</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>RiboZero Altın Seti ile TruSeq Örgülü Toplam RNA Kiti</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2301</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Üniversal Blokaj Oligo - TS-p5</td><td>IDT</td><td>127040822</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Üniversal Blokaj Oligo - TS-p7(6nt)</td><td>IDT</td><td>127040823</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Üniversal Blokaj Oligo - TS-p7(8nt)</td><td>IDT</td><td>127040824</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&reg; AMPure&reg; XP - PCR Arıtma boncukları&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&reg; M-270 Streptavidin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>65305</td><td></td></tr><tr><td>COT İnsan DNA'sı, Florometrik Derece, 1 mg</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler</td><td>05480647001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; Tahlil Tüpleri&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; dsDNA HS Test Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap&reg; EZ Hibridizasyon ve Yıkama Kitleri&nbsp; (24 veya 96 reaksiyon)</td><td>Roche Çevik Gen&nbsp;</td><td>05634261001 veya 05634253001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kübit&reg; 2.0 Florometre&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Çözeltisi)</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su</td><td>Ömrü Teknolojileri</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Dokunma ve ticaret; 96&ndash ile Termal Döngüleyici; Kuyu Hızlı Reksiyon Modülü</td><td>Biorad</td><td>185-1196</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ Hibridizasyon ve Yıkama Kitleri</td><td>Roche Uygulamalı Bilim</td><td>05634253001</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Ters Transkripsiyon 200 U/&#956; l</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP - 40 ml</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNA Ekran Bandı</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Merdiven</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5578</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Örnek Tamponu</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Sigma</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>DYNAMAG -96 YAN HER YAŞAM</td><td>Teknolojileri</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart ReadyMix</td><td>KAPA Biyosistemler</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektrofotometre</td><td>Thermo Scientific</td> My Block <td></td><td></td></tr><tr><td>Mini Kuru Banyo</td><td>Benchmark</td><td>BSH200</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reaktifler</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067- 5583</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>022829861&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

rna sıralama deneyi gen İfade ve genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA dizi (RNAseq) gen ekspresyonunu, mutasyon, gen füzyonlarının ve kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar algılamak ve karakterize etmek için kullanılabilir çok yönlü bir yöntemdir. 100,000,000 dizi okuma ve mRNA ve kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar gibi birden fazla RNA ürünlerini içerebilir - Standart RNAseq 30 gerektirir. Biz hedefli RNAseq (yakalama) bir masaüstü sequencer kullanarak seçilen RNA ürünlerde odaklanmış bir çalışma izin nasıl gösterilmektedir. RNAseq yakalama aksi geleneksel RNAseq yöntemleri kullanılarak atlanabilir, Açıklama içermeyen düşük, ya da geçici olarak ifade transkript karakterize edilebilir. Burada hücre hatları, ribozomal RNA tükenmesi, cDNA sentezi, barkodlu kütüphane, bir masaüstü sequencer üzerinde melezleme ve hedeflenen transkript yakalanması ve multipleks sıralama hazırlanması RNA çıkarma açıklar. Biz de kalite kontrol değerlendirme, hizalama, füzyon algılama, gen ifadesi miktarının ve tek MBK tanımlanmasını içeren hesaplama analiz boru hattı, anahatleotide varyantları. Bu deney, gen ekspresyonunu, gen füzyonlarının ve mutasyonları tanımlamak için hedeflenmiş transkript dizilemesi için izin verir.

RNAseq Yakalama şematik bir vurgulama temel adım, Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir. Bilinen mutasyonlar ile dört kanseri hücre RNAseq yakalama tekniği etkinliğini göstermek için kullanılmıştır (K562 ABL1 füzyon RET füzyon LC2 ile EOL1 PDGFRalpha füzyon ve oranda RT- ile 4 FGFR3 füzyon). Dört numune bir araya toplanmış ve 100 bp fastq dosyaları oluşturan bir masaüstü sıralayıcı, okur 2x ile sekanslandı. İnsan transcriptome 1) kalite kon...

Gen ekspresyonu, mutasyonlar ve gen füzyonları için seçilen transkriptleri sorgulamak için indekslenmiş cDNA kütüphanelerinin hazırlanmasını, özel problarla hibridizasyon ve yakalama ve veri analizini içeren hedefli RNA dizileme tabanlı bir yöntemi tanımlıyoruz. Hedeflenen RNAseq, seçilen transkriptlerin bir masaüstü sıralayıcıda uygun maliyetli, hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verir.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Bu analizin genel amacı, yeni nesil dizileme için hedef transkriptleri zenginleştirmektir. Bu hedefli RNA dizileme analizi; toplam RNA'dan ribozomal RNA'nın uzaklaştırılmasıyla başlayan, ardından kimyasal fragmantasyon ve komplementer DNA sentezi, barkodlu kütüphanelerin hazırlanması, hedef transkriptlerin hibridizasyonu ve yakalanması, çoklu dizileme ile devam eden ve veri analizi ile sona eren çok aşamalı bir prosedürdür. Bu video; dört örnek için hibridizasyon, hedef yakalama ve yakalama sonrası PCR amplifikasyonu prosedürlerini gösterecektir.Bu yöntem; gen füzyonlarının belirlenmesi, tek nükleotid varyasyonları, bağıl gen ekspresyonu ve hedeflenen transkriptleri içeren alternatif ekleme gibi moleküler biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgilenilen her türlü gen için özelleştirilebilir olmasıdır. Hibridizasyon prosedürüne başlamak için şunları 20 °C'lik dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde çözdürün: özel hidratlanmış problar, Cot-1 DNA, evrensel bloklama oligoları ve adaptöre özgü bloklama oligoları.Düşük bağlanma özellikli 1,5 mililitrelik bir tüp içerisinde 500 nanogram DNA örneği, 5 mikrolitre Cot-1 DNA, bir mikrolitre evrensel bloklama oligoları, 0,5 mikrolitre altı nükleotitli adaptöre özgü bloklama oligoları ve 0,5 mikrolitre sekiz nükleotitli adaptöre özgü bloklama oligolarını birleştirin. Örnek tüpünü, kapağı açık ve dönüş yönünün tersine bakacak şekilde bir vakumlu konsantratöre yerleştirin. İçeriği 45 °C'de 20 dakika boyunca veya sıvı tamamen buharlaşana kadar kurutun.Ardından, kurutulmuş içeriği 8.5 µL 2x hibridizasyon tamponu, 3.4 µL hibridizasyon bileşeni A ve 1.1 µL nükleaz içermeyen su ile yeniden süspande edin. Her 2.5 dakikada bir vorteksleyerek, yeniden süspandasyon için 10 dakika bekleyin. Yeniden süspande edilen materyali 0.2 mL'lik bir PCR tüpüne aktarın ve bir termal döngüleyici cihazda 95 °C'de 10 dakika inkübe edin.Hibridizasyon örnek tüpünü termal döngüleyici cihazdan çıkarın ve mikrolitre başına 1,5 pikomol konsantrasyonda yeniden süspande edilmiş iki mikrolitre özel prob ekleyin. Hibridizasyon reaksiyonunu 65 °C'de gece boyunca inkübe edin. Çoklu hibridizasyondan sonraki adım, streptavidine bağlı paramanyetik boncuklar kullanılarak hedeflenen RNA'nın yakalanmasıdır.Boncukların bulunduğu bir şişeyi 4 °C'den çıkarın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında dengeleyin. Gerekli tüm tamponların 1x çalışma çözeltilerini hazırlayın. Taze bir 1,5 mL tüpe 140 µL 1x yıkama tamponu bir ekleyin.Bu alikot tamponu ve 1x stringent tamponun tamamını bir ısıtıcı blokta 65 °C'de en az iki saat boyunca ısıtın. Uygun miktarda boncuğu 1,5 mL'lik bir tüpe alikotlayın. Manyetik ayırma rafına yerleştirin ve süpernatantı atın.Boncuk yıkama tamponu ekleyin ve 10 saniye boyunca vorteksleyin. Tüpü, süpernatan berraklaşana kadar veya iki ila beş dakika boyunca manyetik ayırma rafına yerleştirin. Süpernatanı atın.Toplam iki yıkama olacak şekilde işlemi tekrarlayın. Boncuk yıkama tamponu uzaklaştırıldıktan sonra, başlangıç hacmine eşit miktarda boncuk yıkama tamponu ekleyin. Yeniden süspande edin ve 0.2 mililitrelik bir PCR tüpüne aktarın.Tüpü, süpernatan berraklaşana kadar veya iki ila beş dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin. Süpernatanı atın. Boncukların bulunduğu tüpü 65 °C sıcaklıktaki bir mini ısıtıcı bloğa yerleştirin.Hibridizasyon örneğini boncukların bulunduğu tüpe aktarın, karıştırmak için pipetle 10 kez çekip boşaltın ve 65 °C'de 45 dakika inkübe edin. Her 15 dakikada bir, örneği vorteksleyin ve sabit hızlı masaüstü mini santrifüj kullanarak dört saniye boyunca çöktürün. 45 dakikalık inkübasyon tamamlandığında, yakalama tüpünü ısıtıcı bloktan çıkarın.Tüpe önceden ısıtılmış 100 µL 1x yıkama tamponu bir ekleyin, ardından karıştırmak için 10 saniye boyunca vorteksleyin. Karışımı yeni, düşük bağlanma özellikli 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Tüpü manyetik rafa yerleştirin ve ayrışma için iki ila beş dakika veya süpernatan berraklaşana kadar bekleyin.Süpernatanı atın. Önceden ısıtılmış 1x stringent yıkama tamponundan 200 µL ekleyin ve karıştırmak için pipetle 10 kez yukarı aşağı çekin. 65 °C'de beş dakika inkübe edin.Tüpü manyetik rafa yerleştirin ve ayrışma için iki ila üç dakika bekleyin. Süpernatantı atın. Toplamda iki yıkama olacak şekilde, stringent yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın.Oda sıcaklığındaki 1x yıkama tamponu birinden 200 microliters ekleyin ve karıştırmak için iki dakika boyunca vorteksleyin. Tüpü manyetik rafa yerleştirin, ayrışma için iki ila beş dakika bekleyin ve süpernatanı uzaklaştırın. Oda sıcaklığındaki 1x yıkama tamponu ikisinden 200 microliters ekleyin ve karıştırmak için bir dakika boyunca vorteksleyin.Tüpü iki ila beş dakika boyunca manyetik ayırma rafında bekletin ve ardından süpernatanı atın. 200 µL oda sıcaklığında 1x yıkama tamponu üç ekleyin ve karıştırmak için 30 saniye boyunca vorteksleyin. Tüpü iki ila beş dakika boyunca manyetik ayırma rafında bekletin ve ardından süpernatanı atın.Son olarak, tüpü manyetik ayırma rafından çıkarın ve boncukları yeniden süspand etmek için 20 µL nükleaz içermeyen su ekleyin. Pipetle 10 kez yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın. Yakalama sonrası PCR amplifikasyonuna başlamadan önce, paramanyetik boncukları 4 °C'den çıkarın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında dengeleyin.2x hot start PCR hazır karışımını ve PCR primer karışımını 20 °C'lik dondurucudan çıkarın, oda sıcaklığında çözdürün ve ardından buz üzerine yerleştirin. 27,5 µL 2x hot start PCR hazır karışımı, 2,75 µL PCR primeri bir ve 2,75 µL PCR primeri ikisini birleştirerek bir kütüphane amplifikasyon ana karışımı hazırlayın. 20 µL boncuk artı yakalanmış DNA'yı 30 µL kütüphane amplifikasyon ana karışımı ile birleştirerek reaksiyonu bir PCR tüpünde kurun.Tüpü düzgünce kapatın ve karıştırmak için vortekslereyin. Tüpü, 6×g hızındaki sabit hızlı mini masaüstü santrifüj kullanarak dört saniye boyunca santrifüjleyin. Tüpü termal döngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki PCR programını kullanarak PCR amplifikasyonunu başlatın: 98 °C'de 45 saniye boyunca başlangıç denatürasyonu; 98 °C'de 15 saniye denatürasyon, 65 °C'de 30 saniye bağlanma (annealing) ve 72 °C'de 60 saniye uzama (extension) şeklinde 10 ila 12 döngü.75 °C'de 60 saniye süren son bir uzama döngüsü gerçekleştirin ve 4 °C'de bekletin. PCR tamamlandığında, örneği termal döngüleyici cihazdan çıkarın. 75 µL paramanyetik boncuk ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.Tüpü oda sıcaklığında iki ila üç dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin ve ardından süpernatantı uzaklaştırın. Manyetik raf üzerindeki boncukları 200 µL %80 etanol ekleyip 30 saniye inkübe ederek ve ardından süpernatantı uzaklaştırarak yıkayın. Toplam iki yıkama olacak şekilde işlemi tekrarlayın.İkinci etanol yıkamasından sonra süpernatantı uzaklaştırın ve boncukların kuruması için oda sıcaklığında beş ila on dakika inkübe edin, ancak çatlayacak kadar fazla kurutmayın. Boncukları 22 µL Tris-EDTA pH 8.0 içerisinde yeniden süspande edin ve elüsyon için üç dakika bekleyin. Numuneyi üç ila beş dakika boyunca mıknatıs üzerine yerleştirin.Son olarak, boncukların taşınmadığından emin olarak, elüe edilen ürünün 20 µL'sini yeni ve düşük bağlanma özelliğine sahip 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Dört kanser hücre hattında yakalama yöntemi ile hedeflenmemiş RNA dizileme arasındaki gen ekspresyon karşılaştırması, yakalama yönteminin mavi ile gösterilen hedef genleri, gri ile gösterilen hedeflenmemiş genlere kıyasla 10 ila 1000 kat zenginleştirdiğini ortaya koymuştur. Ayrıca, yakalama yöntemiyle hazırlanan RNA dizileme kütüphanelerinde, hedef bölgelere eşleşen okuma yüzdesi hedeflenmemiş kütüphanelere göre artış göstermiştir.Kalite kontrol önlemlerinin bir değerlendirmesi, yakalama ve hedeflenmemiş RNA dizilemenin, transkriptoma hizalanma ve ana ekleme boyutu açısından eşit performans gösterdiğini ortaya koymuştur. Yakalama yöntemi kullanıldığında, ekzonik bölgelerin daha yüksek bir yüzdesi ve intronik bölgelerin daha düşük bir yüzdesi dizilenmiştir. Beklendiği gibi, hedeflenmemiş RNA dizileme, örnek başına yakalama yöntemine kıyasla 50 kattan fazla toplam dizileme okuması üretmiştir.Yakalama yöntemi kullanıldığında, her bir örnekte bulunan ribozomal RNA dizilerinin yüzdesi daha düşükdü. Son olarak, dört hücre hattının her biri için yakalama ve RNA dizilemenin örtüşen bölgelerinde belirlenen tek nükleotid varyantlarının karşılaştırılması, hedef bölge içinde yakalama ve RNA dizileme arasında varyans açısından yüksek bir uyum olduğunu göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde üç ila dört günde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, hibridize edilmiş hedeflerin yakalanması sırasında hızlı çalışmaya özen göstermek ve reaksiyonun 65 °C'de kaldığından emin olmak önemlidir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, moleküler biyoloji alanındaki araştırmacıların ilgilenilen transkriptleri yüksek kapasiteli ve maliyet etkin bir şekilde incelemesinin önünü açmıştır.

targeted-rna-sequencing-assay-to-characterize-gene-expression-genomic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz Barkodlanan DNA kütüphaneleri ve büyük ölçüde paralel "yeni nesil" dizisi ile klinik tümör numunelerinde önemli kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için olan hibridizasyon-bazlı sonraki ekson yakalama hazırlanmasını tarif etmektedir. Hedefli ekson dizileme nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık verimli, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama avantajlar sunmaktadır.

Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

RNA-sıralama ve biyoinformatik analizler fare EMLcells Lin-CD34 + ve Lin-CD34 alt gruplarda anlamlı ve farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu transkripsiyon faktörleri kendini sürekli yenileyen Lin-CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-CD34 hücreleri arasındaki geçiş belirlenmesinde önemli rol oynayabileceğine.

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Onkoloji örneklerinin hedeflenen yeni nesil dizilimi için entegre bir sistem tanımlanmıştır. Bu çapraz platform sistemi, düşük kaliteli ve düşük miktarlı tümör biyopsileri için optimize edilmiştir, düşük DNA girdilerini barındırır, iyi karakterize edilmiş çok varyantlı kontroller içerir ve kantitatif pre-analitik kalite kontrol önlemleriyle bilgilendirilen yeni bir varyant arayan içerir.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Burada katı tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran amaçlayan bir protokol açıklar. Bu hedefe, biz RNA seq ile ebeveyn ve in vitro dirençli modellerin transkriptomik profillerini analiz ve aday genler doğrulamak için bir QRT-PCR tabanlı bir yöntem kurdu.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Burada, hassas ve belirli algılama dizileri gibi tek hücre düzeyinde tek nükleotid çözünürlük ile 50 nukleotid kısa sağlayan bir in situ hibridizasyon tahlil açıklayın. El ile veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir, tahlil splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar doku çerçevede görselleştirme etkinleştirebilirsiniz.

Genetik varyantların, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar bir RNA In Situ hibridizasyon tahlil ile morfolojik doku bağlamda görüntülenmesi

miRNA tedavi kanser ilerleme düzenlenmesinde önemli potansiyele sahip. Aşağıda gösterildiği analitik yaklaşımlar hücre döngüsü ve anjiogenezi durdurma içinde bir birleşimsel miRNA tedavi faaliyetinin tanımlaması için kullanılır.

Kombinatorik miRNA düzenleyen hücre döngüsü ve anjiogenezi tedavilere analizi

Burada, yazarlar fenotipleme için MULTI-seq'in ve daha sonra retinadaki transkriptomik ve kromatin erişilebilirlik profillerini karakterize etmede eşleştirilmiş scRNA-seq ve scATAC-seq'in faydasını göstermektedir.

scRNA-Seq ve scATAC-Seq Kullanarak Retinal Gen Ekspresyonu ve Kromatin Erişilebilirliğinin Multipleks Analizi

Burada, genetiği değiştirilmiş fare modeli kaynaklı tümörlerde in vivo embriyonik öldürücü olan gen nakavtlarını gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz ve daha sonra nakavtın tümör büyümesi, proliferasyon, sağkalım, göç, invazyon ve transkriptom in vitro ve in vivo üzerindeki etkisini değerlendiriyoruz.

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümör Hücrelerinde Floks Alellerinin Ex vivo Ablasyonu ile Tümörigenezde Gen Fonksiyonlarının Tanımlanması

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Bu prosedür, birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri kurmak ve transfeksiyon Gene Verici MXCell elektroporasyon sistemini kullanarak takip nasıl açıklamaktadır.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

Öğrenin, hedeflenen RNA sıralama yöntemiyle gen ifadesi, mutasyonlar ve gen füzyonlarını analiz etmeyi. Bu maliyet etkin teknik, moleküler biyolojide önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olur.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

Daha fazla video keşfet