RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

Bu testin genel amacı, yeni nesil dizileme için hedef transkriptleri zenginleştirmektir. Bu hedefli RNA dizileme testi, toplam RNA'dan ribozomal RNA'nın tükenmesi ile başlayan, ardından tamamlayıcı DNA'nın kimyasal parçalanması ve sentezi, barkodlu kütüphanelerin hazırlanması, hibridizasyon ve hedeflenen transkriptlerin yakalanması, çoğullanmış dizileme ve veri analizi ile sona eren çok aşamalı bir prosedürdür. Bu video, dört numune için hibridizasyon, hedef yakalama ve yakalama sonrası PCR amplifikasyonu prosedürlerini gösterecektir.

Dolayısıyla bu yöntem, gen füzyonlarının tanımlanması, tek nükleotid varyasyonları, göreceli gen ekspresyonu ve hedeflenen transkriptleri içeren alternatif birleştirme gibi moleküler biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgilenilen herhangi bir gen için özelleştirilebilir olmasıdır. Hibridizasyon prosedürüne başlamak için, 20 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve aşağıdakileri buz üzerinde çözdürün: özel hidratlı problar, Cot-1 DNA, evrensel bloke edici oligolar ve adaptöre özel bloke edici oligolar.

Düşük bağlayıcı 1.5 mililitrelik bir tüpte, 500 nanogram DNA örneğini, 5 mikrolitre Cot-1 DNA'sını, bir mikrolitre üniversal bloke edici oligoları, 0.5 mikrolitre altı nükleotid adaptöre özgü bloke edici oligoları ve 0.5 mikrolitre sekiz nükleotid adaptöre özgü bloke edici oligoları birleştirin. Numune tüpünü, kapağı açık ve ters dönüş yönüne bakacak şekilde bir vakum konsantresine yerleştirin. İçeriği 45 santigrat derecede 20 dakika veya sıvının tamamen buharlaşmasına kadar kurutun.

Daha sonra, kurutulmuş içeriği 8.5 mikrolitre 2x hibridizasyon tamponu, 3.4 mikrolitre hibridizasyon bileşeni A ve 1.1 mikrolitre nükleaz içermeyen su ile yeniden süspanse edin. Yeniden süspansiyon için 10 dakika bekleyin, her 2,5 dakikada bir girdap yapın. Yeniden süspanse edilmiş malzemeyi 0,2 mililitrelik bir PCR tüpüne aktarın ve 95 santigrat derecede bir termal döngüleyicide 10 dakika inkübe edin.

Hibridizasyon numune tüpünü termal döngüleyiciden çıkarın ve mikrolitre başına 1.5 pikomol konsantrasyonunda yeniden süspanse edilmiş iki mikrolitre özel prob ekleyin. Hibridizasyon reaksiyonunu gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Çoğullanmış hibridizasyondan sonraki adım, streptavidin bağlı paramanyetik boncuklar kullanılarak hedeflenen RNA'nın yakalanmasıdır.

Dört santigrat dereceden bir şişe boncuğu çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika dengeleyin. Gerekli tüm tamponların 1x çalışma çözeltisini hazırlayın. Aliquot 140 mikrolitre 1x yıkama tamponu, birini 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe koyun.

Bu alikotik tamponu ve 1x sıkı tamponun tamamını 65 santigrat derecede bir ısı bloğunda en az iki saat ısıtın. Uygun miktarda boncuğu 1,5 mililitrelik bir tüpe koyun. Manyetik ayırma rafına yerleştirin ve süpernatanı atın.

Boncuk yıkama tamponu ekleyin ve 10 saniye boyunca girdap yapın. Tüpü manyetik ayırma rafına iki ila beş dakika veya süpernatan temizlenene kadar yerleştirin. Süpernatanı atın.

Toplam iki yıkama için tekrarlayın. Boncuk yıkama tamponunun çıkarılmasından sonra, ilk başlangıç hacmi olarak eşit hacimde boncuk yıkama tamponu ekleyin. Yeniden askıya alın ve 0.2 mililitrelik bir PCR tüpüne aktarın.

Tüpü manyetik rafa iki ila beş dakika veya süpernatan temizlenene kadar yerleştirin. Süpernatanı atın. Boncuklu tüpü 65 santigrat derecede mini bir ısı bloğuna yerleştirin.

Hibridizasyon örneğini boncuklarla tüpe aktarın, karıştırmak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve 65 santigrat derecede 45 dakika inkübe edin. Her 15 dakikada bir, numuneyi girdaplayın ve sabit hızlı bir masa üstü mini santrifüj kullanarak dört saniye boyunca döndürün. 45 dakikalık inkübasyon tamamlandığında, yakalama tüpünü ısı bloğundan çıkarın.

Tüpe 100 mikrolitre önceden ısıtılmış 1x yıkama tamponu ekleyin, ardından karıştırmak için 10 saniye girdap yapın. Karışımı taze, düşük bağlayıcı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü manyetik rafa yerleştirin ve ayırma için iki ila beş dakika veya süpernatan berraklaşana kadar bekleyin.

Süpernatanı atın. 200 mikrolitre önceden ısıtılmış 1x sıkı yıkama tamponu ekleyin ve karıştırmak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 65 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Tüpü manyetik rafa yerleştirin ve ayrılması için iki ila üç dakika bekleyin. Süpernatanı atın. Toplam iki yıkama için sıkı yıkamayı bir kez tekrarlayın.

200 mikrolitre oda sıcaklığında 1x yıkama tamponu ekleyin ve karıştırmak için iki dakika vorteks yapın. Tüpü manyetik rafa yerleştirin, ayrılması için iki ila beş dakika bekleyin ve süpernatanı atın. 200 mikrolitre oda sıcaklığında 1x yıkama tamponu iki ekleyin ve karıştırmak için bir dakika vorteks yapın.

Tüpü iki ila beş dakika boyunca manyetik ayırma rafına yerleştirin ve ardından süpernatanı atın. 200 mikrolitre oda sıcaklığında 1x yıkama tamponu üç ekleyin ve karıştırmak için 30 saniye girdap yapın. Tüpü iki ila beş dakika boyunca manyetik ayırma rafına yerleştirin ve ardından süpernatanı atın.

Son olarak, tüpü manyetik ayırma rafından çıkarın ve boncukları yeniden süspanse etmek için 20 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Yakalama sonrası PCR amplifikasyonunu ayarlamadan önce, paramanyetik boncukları dört santigrat dereceden çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika dengeleyin.

2x sıcak başlangıçlı PCR hazır karışımını ve PCR astar karışımını 20 santigrat derece dondurucudan çıkarın, oda sıcaklığında çözdürün ve ardından buzun üzerine koyun. 27,5 mikrolitre 2x sıcak başlangıçlı PCR hazır karışımı, 2,75 mikrolitre PCR primer bir ve 2,75 mikrolitre PCR primer ikisini birleştirerek bir kütüphane amplifikasyon ana karışımı hazırlayın. 20 mikrolitre boncuk ve 30 mikrolitre kütüphane amplifikasyon ana karışımı ile yakalanan DNA ekleyerek reaksiyonu bir PCR tüpünde ayarlayın.

Tüpü düzgün bir şekilde kapatın ve karıştırmak için girdap yapın. Altı kez G'de sabit hızlı bir mini masa üstü santrifüj kullanarak tüpü dört saniye santrifüjleyin. Tüpü termal döngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki PCR programını kullanarak PCR amplifikasyonunu başlatın. 45 saniye boyunca 98 santigrat derecede bir ilk denatürasyon, 15 saniye boyunca 98 santigrat derecede 10 ila 12 döngü denatürasyon, 30 saniye boyunca 65 santigrat derecede tavlama ve 60 saniye boyunca 72 santigrat derecede uzatma.

60 saniye boyunca 75 santigrat derecede son bir uzatma döngüsü ve dört santigrat derecede tutun. PCR tamamlandığında, amptermal döngüleyiciden. 75 mikrolitre paramanyetik boncuk ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Tüpü oda sıcaklığında iki ila üç dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin ve ardından süpernatanı çıkarın. 200 mikrolitre yüzde 80 etanol ekleyerek, 30 saniye inkübe ederek ve ardından süpernatanı çıkararak mıknatıs üzerindeki boncukları yıkayın. Toplam iki yıkama için tekrarlayın.

Süpernatanı ikinci etanol yıkamasından çıkardıktan sonra, boncukların kurumasını sağlamak için oda sıcaklığında beş ila on dakika inkübe edin, ancak çatlamaya kadar aşırı kurumayın. Boncukları 22 mikrolitre Tris-EDTA pH 8.0 içinde yeniden süspanse edin ve elüsyon için üç dakika bekleyin. Numuneyi üç ila beş dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin.

Son olarak, ayrıştırılmış ürünün 20 mikrolitresini taze, düşük bağlayıcı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hiçbir boncuk taşınmadığından emin olun. Yakalama yöntemi ile dört kanser hücresi hattında hedeflenmemiş RNA dizilimi arasındaki bir gen ekspresyonu karşılaştırması, yakalama yönteminin mavi ile gösterilen hedeflenen genleri, gri ile gösterilen hedeflenmemiş genlere göre 10 ila 1000 kat zenginleştirdiğini ortaya koydu. Ek olarak, hedeflenen bölgelere eşleme okuma yüzdesi, hedeflenmemiş RNA dizileme kitaplıklarına kıyasla yakalamada artırıldı.

Kalite kontrol önlemlerinin bir değerlendirmesi, yakalama ve hedeflenmemiş RNA diziliminin, transkriptom ve ana ek boyutuna hizalama açısından eşit performans gösterdiğini gösterdi. Yakalama yöntemi kullanılarak, ekzonik bölgelerin daha yüksek bir yüzdesi ve daha düşük bir tronik bölge yüzdesi sıralandı. Beklendiği gibi, hedeflenmemiş RNA dizilimi, numune başına yakalamaya göre 50 kat daha fazla toplam dizileme okuması üretti.

Yakalama yöntemini kullanarak, her örnekte bulunan ribozomal RNA dizilerinin yüzdesi daha düşüktü. Son olarak, dört hücre hattının her biri için örtüşen yakalama ve RNA dizilimi bölgelerinde çağrılan tek nükleotid varyantlarının karşılaştırmaları, hedef bölge içinde yakalama ve RNA dizilimi arasında yüksek bir varyans uyumu olduğunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç ila dört gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, hibritleştirilmiş hedeflerin yakalanması sırasında hızlı çalışmayı ve reaksiyonun 65 santigrat derecede kalmasını sağlamayı unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, moleküler biyoloji alanındaki araştırmacıların, ilgilenilen transkriptleri yüksek verimli ve uygun maliyetli bir şekilde incelemelerinin yolunu açtı.