Çizgili Deneyi Disosiye Hipokampal Nöronlar kullanarak Protein Substrat çekici veya itici Aktivite Eğitim için

Şerit deneyinin genel amacı, rehberlik molekülleri gibi spesifik proteinlerin nöronları çekme veya itme yeteneğini değerlendirmektir. Bu yöntem, nöronların dış hücresel ortama yanıt olarak nasıl göç edebileceği veya aksonlarını nasıl uzatabileceği gibi, akson rehberliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir deneyde çok sayıda nöronun görselleştirilebilmesi ve birçok büyüme konisinin eş zamanlı olarak analiz edilebilmesidir.

Hazırlık aşamasında, dört ila sekiz adet silikon matriksi su içerisinde beş dakika boyunca kaynatın. Bunların, çizgili kısımları yukarı bakacak şekilde bir laminer akışlı kabin altında tamamen hava ile kurumasını sağlayın. Bu işlem yaklaşık bir saat sürer.

Çeker ocak altında çalışmaya devam edin. Matrislerin çizgili tarafındaki tozları temizlemek için basınçlı hava veya yapışkan bant kullanın. Ardından, her bir matrisi çizgili tarafı aşağı gelecek şekilde ayrı bir altı santimetrelik plastik kaba dikkatlice yerleştirin.

Bir parmağınızla her bir matrise sıkıca bastırın. Matris ile kap arasında hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Matris yapışmazsa işlemi tekrarlayın.

Yapışma sağlandıktan sonra, kültür kabının alt tarafında şeritlerin konumunu işaretleyin. Floresan işaretli rekombinant proteinleri PBS içinde hazırlayın. Her şeritli kap için 25 microliter hazırlayın.

Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, her bir kap için, 22 gauge bir şırıngaya 25 µL seyreltilmiş protein yükleyin ve bunu matrisin yan tarafındaki küçük delikten enjekte edin. Proteinlerin kaplara bağlanmasını bozacağı için matrislere hava kabarcığı enjekte etmekten kaçının.

Şimdi, plakları bir hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her matrisin üst yarık kısmına 300 µL PBS ekleyin. Daha sonra, bağlanmamış tüm rekombinant proteinleri uzaklaştırmak için PBS'yi her matrisin yan tarafında bulunan küçük bir delikten aspire edin.

Proteinlerin kurumasını önlemek için PBS'yi tamamen aspire etmeyin. Bu PBS durulama işlemini toplam üç kez gerçekleştirin. Ardından, her bir kapta bulunan matrisi dikkatlice çıkarın.

Ardından, her kapta dönüşümlü bir kaplama oluşturacak şekilde, çizgili alanın tamamına hemen yaklaşık 100 µL kontrol proteini ekleyin. Sonrasında, kapları 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu sırada, buz üzerinde laminin ve PBS'yi 20 µg/mL konsantrasyonda çözün.

30 dakika sonra, kapları üç kez PBS ile yıkayın. Ardından her kabı yaklaşık 100 µL soğuk laminin ile kaplayın ve kapları bir saat daha inkübatöre geri yerleştirin. Bir saat sonra, kapları tekrar üç kez PBS kullanarak yıkayın.

Üçüncü yıkamadan sonra, her bir kaba yaklaşık 150 µL kültür medyumu ekleyin. Ardından, kapları bir sonraki kullanım aşamasına kadar %5 CO2 içeren inkübatörde 37 °C'de inkübe edin. Donör E15.5 farenin ötanazisini yaptıktan sonra, deri ve kafatasını cerrahi makasla başın orta hattından sagital olarak kesin ve beyni bir mikro spatula yardımıyla çıkarın.

Beyni, üç mililitre HBSS içeren 60 mililitrelik bir petri kabına dikkatlice aktarın. Kap içerisinde, korteks, hipokampus ve striatumu içerecek şekilde hemisferleri bir skalpel yardımıyla kesin. Ardından, meningeleri dikkatlice uzaklaştırarak hipokampal bölgeleri diseke edin.

Diseke edilmiş hipokampal dokuları, buz üzerinde iki mililitre HBSS çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Sekiz kapta nöron kültürü yapmak için üç embriyodan alınan altı hipokamp yeterlidir. Tüm hipokamp dokuları toplandıktan sonra, HBSS'yi aspire edin ve yerine iki mililitre tripsin-EDTA ekleyin.

Ardından tüpü 37 °C'lik bir su banyosunda 15 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, 500 µL fetal bovine serum ekleyerek tripsin aktivitesini nötralize edin. Ardından karışımı 100 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatanı uzaklaştırın ve peleti iki mililitre kültür besiyeri ile yıkayın. Ardından karışımı tekrar santrifüjleyin ve besiyerini taze besiyeri ile değiştirin. Şimdi, ucu kesilmiş bir mililitrelik bir pipet ucu kullanarak dokuyu nazikçe tritürasyonla disosiye edin.

Dokuları pipet ucunun içinde yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı hareket ettirerek akıtın. Ardından, kesilmemiş bir mililitrelik uç kullanarak, tek hücre süspansiyonu elde etmek için tritürasyonu tekrarlayın. Şimdi süspansiyonu 80 ila 100 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek tek hücreleri izole edin.

Ardından, filtrelenmiş süspansiyonu 150 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı aspire edin ve peleti iki mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın ve hazırlanan her çizgili plakadaki 150 mikrolitre kültür ortamına 10.000 nöron ekleyin. Tüm çizgili bölgeyi kaplayacak şekilde süspansiyonu dikkatlice yerleştirin.

E15.5 farelerden elde edilen disosiye hipokampal nöronlar, floresan işaretli kontrol protein FC şeritleri üzerinde veya FLRT2 FC şeritleri ile işaretlenmemiş kontrol FC şeritlerinin ardışık olduğu yüzeylerde ekilerek 24 saat boyunca kültüre edilmiştir. Her iki durumda da nöronlar kümelenmiş ve aksonlarını demetler halinde uzatmıştır. FC kontrolünde nöronlar eşit şekilde dağılmış ve aksonlarını rastgele yönlere doğru uzatmıştır. Buna karşın, FLRT2 FC şeritleri ile kültüre edildiklerinde, aksonların FLRT2 FC bölgelerinde büyümediği görülmüştür.

Böylece, uzayan aksonlar temel olarak FC şeritleri üzerinde büyümüştür. Daha yüksek büyütme, aksonların FLRT2 FC şeritlerinin sınırı boyunca büyüdüğünü ancak FLRT2 bölgesine doğru uzanmadığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, önerilen proteinlerin şeritli halısını nasıl hazırlayacağınız ve disosiye hipokampal nöronları kullanarak çekici veya itici aktiviteyi nasıl değerlendireceğiniz konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde beş saat içinde tamamlanabilir.