Kurbağalar ve Salamanderler Yaşayan Oositlerinin Dev Lampbrush Kromozomların İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, dev çekirdeği veya germinal vezikülü bir amfibi oositten izole etmek ve lamba fırçası kromozomlarını ve diğer nükleer organelleri, situ hibridizasyonunda ve diğer moleküler tekniklerde immün boyama için bir mikroskop lamı üzerine yaymaktır. Bu yöntem, kromozomların, nükleollerin ve diğer nükleer organellerin temel yapısının yanı sıra transkripsiyon, birleştirme ve RNA dışa aktarımının moleküler ayrıntıları hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, kromozom yapısının ve transkripsiyonun, situ hibridizasyonunda ve diğer moleküler tekniklerde immünofloresan kullanılarak geleneksel bir ışık mikroskobu ile incelenebilme kolaylığıdır.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Dr.Zehra Nizami olacak. Gerekli tüm çözeltileri hazırladıktan sonra, metin protokolünde tartışıldığı gibi, plastik kuyucukların parafin ile tutturulduğu altyazılı, cam slaytlardan oluşan kuyu slaytlarını birleştirin. Daha sonra daha önce bir yetişkin, dişi kurbağa veya bir semenderden toplanan yumurtalık dokusunu toplayın ve küçük bir Petri kabını oosit kültürü ortamı ile doldurun.

İzole edilmiş dokunun bir kısmını, biri yaklaşık 10 ila 20 oosit içeren, bu plakaya yerleştirmeye devam edin. Daha sonra, tek bir oosit tanımlayın ve onu yumurtalık duvarına bağlayan sapı kesmek için iki çift kuyumcu forseps kullanın. Serbest bırakıldıktan sonra, oositi germinal vezikül veya GV, izolasyon ortamı içeren yeni bir Petri kabına aktarın.

Düşük büyütme altında, koyu renklenmesiyle tanımlanabilen oositin hayvan kutbunu bulun. Ardından, hayvan direğinin yakınında büyük bir delik açmak için forseps kullanın ve GV olarak da adlandırılan şeffaf oosit çekirdeğini nazikçe sıkmaya devam edin. Daha sonra, GV'yi aynı zamanda ekstrüde edilmiş herhangi bir yumurta sarısından uzaklaştırın. Sıkıca yapışmış kalan yumurta sarısını çıkarmak için, çekirdeği, GV'ninkinden biraz daha büyük bir çapa sahip bir ucu olan bir pipetin içine ve dışına çekin. Bir kurbağa GV'nin toplanmasını takiben, sonraki adımlara müdahale edebilecek nükleer sertleşmeyi önlemek için hemen dağıtma ortamına aktarın.

Daha sonra, iki çift forseps ile, aşağı bastırmamaya dikkat ederek nükleer zarfı GV'nin üst kısmına yakın bir yerde kavrayın. Zarfı tutmaya devam ederken, iki forsepsi birbirinden ayırmaya devam edin ve çekirdeğin içeriğinin dışarı çıkmasını bekleyin. Bu içerikleri toplamak için, önce metin protokolünde açıklandığı gibi kesilmiş uçlu ayarlanabilir 20 mikrolitrelik bir pipet hazırlayın.

Daha sonra, çanaktan beş mikrolitre dispersal sıvı ve ardından GV içerikli beş mikrolitre çözelti çekmeye devam edin. Bu içerikler toplandıktan sonra, bunları dispersiyon çözeltisi ile doldurulmuş bir kuyu slaytına aktarın. Sonraki adımlarda kabarcıkların sıkışmasını önlemek için slayttaki sıvının dışbükey bir yüzeye sahip olduğundan emin olun.

Daha sonra, kuyu üzerine 18 milimetrelik bir kapak kızağı yerleştirin ve monte edilmiş sürgüyü 10 ila 60 dakika boyunca nemli bir odaya yerleştirin. Bu süre zarfında, nükleer jelin yavaşça dağılmasını bekleyin, böylece kromozomlar ve nükleer organeller camın yüzeyinde uzanır. Bir semender oositinden bir çekirdeği çıkardıktan sonra, onu izolasyon ortamında bırakın.

Semender GV'lerinin, burada kullanılan kurbağa türlerinin aksine, bu çözeltide gereğinden fazla sertleşmeyeceğini unutmayın. Kurbağalar için tarif edilenle aynı forseps tabanlı tekniği kullanarak nükleer zarfı semender GV'den çıkarın. Daha sonra, hafifçe jelleşmiş nükleer içeriği kesilmiş bir ucu olan bir pipetle alın ve jeli dispersiyon çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın.

Pipeti dispersiyon çözeltisinde hızlı bir şekilde durulayın ve nükleer jeli toplamak için kullanın. Daha sonra jeli bir kuyu slaytına sokun, bir kapak fişi ekleyin ve jelin daha önce tarif edildiği gibi dağılmasına izin verin. Daha sonra nükleer içeriği görüntülemek için faz kontrastını kullanın ve LBC'ler olarak kısaltılan lamba fırçası kromozomlarını büyük boyutları ve eşleştirilmiş, yanal halkaları ile tanımlayın.

LBC'lerin kırılmadığını onayladıktan sonra, kapak fişinin üzerine bir parça filtre kağıdı yerleştirerek slaydı santrifüjleme için hazırlayın. Ardından haznedeki fazla sıvıyı çıkarmak için aşağı bastırın. Ardından, kapak fişinin her bir kenarına vazelin ekleyin.

Metal bir çubuğu yaklaşık 70 ila 80 santigrat dereceye ısıtın ve jöleyi eritmek ve kapak kızağını alttaki plastiğin üzerine kapatmak için kullanın. İyi kalitede LBC'lere sahip diğer slaytlar için bu prosedürü tekrarlayın. Tüm kapak fişleri yapıştırıldıktan sonra, kızakları santrifüjleme için taşıyıcılara yerleştirin ve zıt taşıyıcıların dengelendiğinden emin olun.

Yavaş başlatma işlevini kullanarak, özel yapım taşıyıcıları kullanarak slaytları metinde açıklandığı gibi santrifüjleyin. Alternatif olarak, slaytların bir plakaya bantlandığı ve döndürüldüğü standart bir masa üstü santrifüj kullanılabilir. Nükleer içeriği immün boyama veya citu hibridizasyon için hazırlamak için, önce geçici Vazelin contasını bir tıraş bıçağıyla silin ve ardından slaytı standart bir slayt boyama kabının rafına yerleştirin.

Ardından, slaytları kaplayacak kadar paraformaldehit ekleyin. Suya batırıldıktan sonra, her bir kapak fişini çıkarmak ve atmak için künt forseps kullanın. Slaytları 15 ila 30 dakika sabitleyici olarak bırakın.

Sabitlemeyi takiben, buz gibi soğuk PBS içeren bir boyama kabına bir slayt yerleştirin. Ardından plastik karenin kenarına keskin bir tıraş bıçağı yerleştirin ve bu plastiği iyice gevşetin. Bu işlem tüm slaytlar için tekrarlandıktan sonra, metin protokolünde tartışıldığı gibi boyama işlemine devam edin.

Bu karanlık alan aydınlatma görüntüsünde, açıklanan protokol kullanılarak toplanan ve hazırlanan, birinci mayotik bölünmenin fazındaki tek bir aksolotl GV'den gelen nükleer içerikler gösterilmektedir. 14 büyük, eşleştirilmiş LBC, amplifiye nükleoller gibi belirgindir. Bu preparatın, burada yeşil renkle gösterilen fosporillenmiş RNA polimeraz II'ye karşı bir antikor ile ek boyanması, histon lokus cisimciklerinin yerlerini ortaya çıkarır ve ayrıca bu oosit kromozomlarının sağlam, transkripsiyonel aktivitesi hakkında fikir verir.

Tek bir aksolotl LBC'nin, bu örnekte RNA polimeraz için yeşile ve DNA için maviye boyanmış olanın daha yüksek büyütmesi, bu kromozomların en benzersiz morfolojik özelliğini gösterir. Her biri RNA'yı aktif olarak sentezleyen en az bir transkripsiyon birimini temsil eden yüzlerce eşleştirilmiş yanal döngü. Aynı büyütme oranında görüntülenen benzer şekilde lekelenmiş bir kurbağa LBC ile karşılaştırma, kurbağa ve semender kromozomları arasındaki muazzam boyut farkını, kullanılan türlerin genomlarının toplam DNA içeriği ile ilişkili bir farkı vurgulamaktadır.

Bununla birlikte, kurbağa kromozomunda bile, bireysel transkripsiyon birimleri, bu daha yüksek büyütme görüntüsünde gösterildiği gibi, kromozom ekseninden yanal olarak çıkıntı yapan kromatin halkaları olarak görülebilir. Balıkların, kuşların, sürüngenlerin ve bazı omurgasızların oositleri de dev lamba fırçası kromozomları içerir. Dikkat çekici bir şekilde, lamba fırçası kromozomları, insanlar da dahil olmak üzere diğer organizmalardan gelen sperm kafaları amfibi germinal vezikülüne enjekte edildiğinde üretilir.

Tekniğe hakim olduktan sonra, bir saat içinde bir grup AGV yayılımı hazırlanabilir ve daha sonra bir ila iki saat içinde santrifüjlenebilir ve sabitlenebilir. Bu videoyu izledikten sonra, moleküler problar kullanarak daha fazla çalışma için bir GV'yi nasıl izole edeceğinizi ve lamba fırçası kromozomlarını nasıl yayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.