Kullanımı Çevre Örneklerinde Yeni Faustoviruses İzolasyonunda bir Hızlı Stratejisi

Bu yeni izolasyon stratejisinin genel amacı, bu yeni viral familyanın pan-genomunu incelemek, ekosistemlerini ve insanlara yönelik potansiyel patojenitelerini daha iyi anlamak için yeni virüs izolatlarının sayısını artırmaktır. Bu yöntem, özellikle dev virüslerin ve Faustovirüslerin aranmasıyla ilgilenen dünya genelindeki virologlara yardımcı olarak viroloji alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin temel avantajı; antibiyotik ve antifungal karışımı, amiplere uyarlanmış yeni açlık besiyeri ve daha hızlı ve daha hassas lizis tespiti için akış sitometrisi kullanımı gibi birçok aşamada yeni iyileştirmeler sunmasıdır. Metin protokolüne uygun olarak kirli su örnekleri toplandıktan sonra, amipleri 30 mL proteaz pepton maya özütü glukoz (PYG besiyeri) içeren 75 cm²'lik bir hücre kültürü flaskına ekleyerek konak hücre olan V. vermiformis'i hazırlayın ve 28 °C'de 48 saat inkübe edin. Amipleri saymak için sayım lamları kullanın ve hücreler mL başına 5 × 10⁵ ile 10⁶ konsantrasyonuna ulaştığında, hücreleri 720 ×g'de 10 dakika santrifüj ederek hasat edin.

Süpernatantı aspire edin ve amip peletini yeniden süspanse etmek için 30 mililitre steril Page amip salini veya PAS kullanın. Peleti ikinci kez duruladıktan sonra, hücreleri mililitre başına yaklaşık 10⁶ amip olacak şekilde yeniden süspanse etmek için antibiyotik ve antifungal içeren 30 mililitre açlık medyumu kullanın. Açlık medyumu, amiplerin kistleşme veya çoğalma olmadan hayatta kalmasını sağlar.

Ardından, 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakadaki kuyucuklara 200 µL amip ekleyin ve 30 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Sonra, su örneklerini oda sıcaklığında bir dakika boyunca vorteksledikten sonra, her bir örnekten 25 µL'yi amip hücrelerinin üzerine inoküle edin; negatif kontrol olarak iki kuyucuğu numunesiz bırakın. Buharlaşmayı önlemek için, primer kültürü içeren plağı ıslak bir kompresle birlikte bir torbaya yerleştirin ve plakla birlikte nemlendirilmiş hazneyi 30 °C'deki bir inkübatöre koyun.

İlk inokülasyondan üç gün sonra, herhangi bir mikroskobik gözlem yapmadan, primo-kültür plağını az önce gösterildiği gibi amip içeren taze bir 96 kuyucuklu plağa alt kültürle aktarın. 30 °C'de üç gün boyunca inkübe edin. Ardından, alt kültürü kullanarak az önce açıklanan şekilde üçüncü bir plağı inoküle edin ve iki gün boyunca inkübe edin.

Son ko-kültür plağındaki lizisi tespit etmek için sitometreyi açın ve arka plan gürültüsünü azaltmak amacıyla üretici protokolüne uygun olarak temizleme ve durulama işlemini gerçekleştirin. 40 dakikalık tamamen otomatik bir veri toplama işlemi yürütmek için, numuneleri 96 kuyucuklu plaktan üretici protokolüne göre otomatik olarak yükleyecek olan yüksek kapasiteli örnekleyiciyi (high throughput sampler veya HTS) başlatın. HTS ayarlarını; 150 µL numune hacmi, 50 µL karıştırma hacmi, 180 karıştırma hızı, 5 karıştırma sayısı, numuneler arası 400 µL yıkama hacmi, saniyede 2,5 µL akış hızı ve 10.000 kayıtlı olay sayısı olacak şekilde burada listelendiği gibi programlayın. HTS'nin plağı belirlemesi veya konumlandırması için "home" seçeneğine tıklayın. Ardından, amip popülasyonunu kapılamak (gate) ve hücre yüzdesini fiziksel özelliklerine göre belirlemek için öncelikle konak amip hücrelerini içeren negatif kontrol kuyucuklarını değerlendirin. Homojen bir amip popülasyonu ve debris ile gürültüye karşılık gelen, daha düşük olay sayılı ikinci bir popülasyon olduğundan emin olun. Sonrasında, "acquire sample" seçeneğine tıklayarak kapılama işlemine başlayın.

Ardından, kapıları (gates) belirleyen oku kullanarak ilgilenilen amip popülasyonunu lokalize edin. En az 10.000 olayla (event) kapılama yaptıktan sonra, HTS'nin tüm plağı otomatik olarak çalıştırması için "run" seçeneğine tıklayın. Veri toplama ve analiz işlemlerini, boyut parametresi olan forward scatter ve yapı parametresi olan side scatter'a göre gerçekleştirin. Ek detaylar için metne başvurun.

Akış sitometrisi ile lizis tespiti yapıldıktan sonra, kalan amipleri süspansiyon haline getirmek için lizis olmuş ko-kültürleri pipetleyin. Her örnekten 50 µL'yi lamların üzerine pipetledikten sonra, süspansiyonu doğrudan 800 ×g'de 10 dakika boyunca sitosantrifüjleyin.

Ardından, lamları sabitlemek için saf metanol kullanın ve ardından lamları oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Sabitleme işleminden sonra, lamları altı saniye boyunca blue-azur içine yerleştirmeden önce, her biri dört saniye sürecek şekilde üç kez ESN çözeltisine daldırın. Son olarak, lamları 45 saniye boyunca PBS içine daldırın.

Gözleme geçmeden önce lamların oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Yeni fikse edilmiş lamları DAPI ile boyamak için, kuru lamların üzerine 15 µL DAPI pipetleyin. Virüs fabrikalarının varlığını kontrol etmek için lamları ışık mikroskobunda 1000x büyütmede gözlemleyin.

Elektron mikroskobisi gerçekleştirmek için, pozitif numuneden beş mikrolitreyi glow-discharge uygulanmış bir ızgaraya damlatın ve yaklaşık 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Izgarayı dikkatlice kurutun, ardından küçük bir miktar %1 amonyum molibdat ekleyip 10 saniye boyunca inkübe edin. Damlayı dikkatlice uzaklaştırdıktan sonra, ızgarayı beş dakika boyunca kurumaya bırakın. Ardından, elektron mikroskobunu 200 kiloelektron volt seviyesine ayarlayın. Daha sonra ızgarayı tutucuya yerleştirin ve tutucuyu mikroskoba yerleştirin. Vakum genel bakış simgesine tıklayarak vakumu kontrol edin. Ardından valfleri kapatın ve gözleme başlamadan önce spot boyutunu beş, büyütmeyi ise 25.000 olarak ayarlayın. Görüntüleme ekranında dev bir virüs tespit ettikten sonra, virüsü ölçmek için ölçüm aracını kullanın.

Metin protokolüne uygun olarak moleküler biyoloji ve viral genom dizileme işlemlerini gerçekleştirin.

Bu şekil, iki Faustovirus'un tespitinden elde edilen sonuçları güvenilir negatif kontrollerle karşılaştırmalı olarak göstermektedir. Liz için kullanılan negatif kontrol %86 ameba popülasyonu içeriyordu. Buna karşılık, pozitif örneklerde en yüksek debris yüzdesi görülürken, amebaların %60'ından fazlası liz olmuştur.

Burada görüldüğü üzere, ESN ve blue-azur boyamaları, enfekte olmamış ve enfekte olmuş amip hücrelerinin çekirdeklerini ve enfekte hücrelerin içindeki virüs fabrikalarının varlığını boyamaktadır. DAPI boyaması da amiplerin içindeki virüs fabrikalarının varlığını doğrulamaktadır. Bu görüntülerde, elektron mikroskobu; fibril içermeyen ikosahedral bir kapsid ve 200 nanometer boyuta sahip olan, mega-virüsün tipik görünümünü sergileyen Faustovirus varlığını ortaya çıkarmaktadır.

Uzmanlaşıldığında ve ko-kültür işleminin ardından, lizis tespiti ve virüs karakterizasyonu tekniği, uygun şekilde uygulandığı takdirde bir saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, amip canlılığının kontrol edilmesinin ve olası kontaminasyonların denetlenmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, virüs ailesi ve/veya genotipi gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, dev virüsleri hedefleyen moleküler biyoloji yöntemleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Geliştirilmesinin ardından bu teknik, viroloji alanındaki araştırmacıların bu viral familyayı, spesifik konakçılarını ve potansiyel patojenitelelerini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, örnek sayısını ve türlerini artırarak, en uygun konakçı hücreyi ve en iyi kültür koşullarını seçerek dev virüslerin nasıl kolayca izole edileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız. İnsanlar için potansiyel olarak patojenik olan virüslerle çalışmanın, özellikle kanalizasyon örnekleri söz konusu olduğunda, son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Bu nedenle, bu prosedür uygulanırken güvenli koşullara sahip SB2 laboratuvarlarında çalışmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.