Name: Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 20 min 16 s
Description: Öğrenin, CaspaseTracker biyoalgılayıcı sistemi kullanarak Drosophila melanogaster modelinde canlı hayvanlarda anastazisi tespit ve izleme yöntemlerini. Bu teknik, kaspaz aktivasyonundan sonra hücre ölümünün geri dönüşümünü incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Drosophila görüntü şekil 3 c ve video el yazması için Darren Obbard teşekkür ederim; J. Marie Hardwick, Wade Gibson ve Heather M. kuzu bu el yazması değerli tartışılması için. Bu eser bir efendim Edward Youde Memorial Bursu (H.L.T. tarafından), Dr. Walter Szeto'yu Memorial Bursu (H.L.T.), desteklenen Fulbright hibe yaşam Bilim Araştırma Vakfı Bursu (H.L.T.) ve ncı K22 CA204458 (H.L.T.) 007-2009 (H.L.T.), verin. Ho Tang Lam bir Shurl ve Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı (2014-2017) Kay Curci Vakfı üyesi oldu.

1) CaspaseTracker Biyoalgılayıcı hazırlanması uçar
<ol><li>CO2sinekli anestezi ve sinek yiyecek ve taze Maya yapıştır ile aynı şişe içinde 7 ila 10 caspase duyarlı Gal4 (DQVD)19 bakire kadın ve 7 10 G-izleme53 Gal4 muhabir genç erkek sinek (veya tersi) aktarmak için bir fırça kullanın. Not: Çapraz Caspase duyarlı (DQVD) Gal4 ve G-izleme Sineklerin Tanrısı CaspaseTracker döl sinekler üretecek. Caspase - duyarlı (DQVA)'19 Gal4 çapraz ve G-izleme sinekler (konuya bakın) negatif kontrol uçar sağlayacaktır. Taze Maya Yapıştır o döl sayısı artar bu yüzden yumurta üretimi, geliştirmek için protein kaynağı olarak hizmet vermektedir. Bakire kadın ve genç erkek sinek onların fenotipleri54göre seçin.</li>
	<li>Sinekler, 18 santigrat derece (oC) sırasında çapraz için 3-7 gün kuluçkaya ve sonra yeni bir çapraz 18 ° C'de ayarlamak için yeni bir şişe için sinekler aktarın Döl eclose uçar kadar 18 ° C'de orijinal şişe kuluçkaya devam'i tıklatın. Not: Üst sinek özgün flakon, döl, aşırı kalabalık önlemek için yeni şişeleri aktarın. Üst sinek döl taze yiyecek ve Maya salçası ilk 2-3 anahtarları oluşturabilir ve sonra verimliliği önemli ölçüde zamanla azalacak. Sinekler yükselterek 18 ° C CaspaseTracker Biyoalgılayıcı non-spesifik sinyal azaltabilir (konuya bakın).</li>
	<li>Seçme döl ile doğru fenotipleri54 aşağıdaki deneyler için uçar. Not: Burada transgenes caspase duyarlı Gal4 ve G-izleme CyO dengeleyici ile dengeli ikinci kromozom bulunur. Her iki transgenes caspase duyarlı Gal4 ve G-izleme olan kıvırcık kanat döl (olmadan CyO) seçin.</li>
</ol>2) uygulama geçici hücre ölüm indüksiyon CaspaseTracker Biyoalgılayıcı uçar
<ol><li>10 eclosed erkek taze uçmak gıda ve taze Maya yapıştır ile yeni bir şişe için 1 gün için 18 ° C'de yumurta odası üretimi oogenesis tarafından izin vermek için uçar-20 yeni transfer. Not: Dişi erkek sinek ile tutmak yumurta odası üretimini artırmak.</li>
	<li>Soğuk şok Apoptosis geçmesi yumurta Chambers'ı ikna etmek için dişi sinekler sonra-7 ° C için 1 h yerleştirilmiş olması yeni boş şişe aktarın. Not: soğuk şok kişi yaralandı hücreler plazma zarı yırtılması55,56inducing tarafından.</li>
	<li>Apoptozis protein açlık tarafından geçmesi yumurta Chambers'ı ikna etmek için dişi sinekler 18 ° C'de % 8 sukroz ve %1 agar gıda ile yeni bir şişe 3 gün boyunca aktarın. Not: Protein açlık (protein olmayan gıda) yumurta chambers apoptosis57,58,59 ve autophagy60,61geçmesi tetikleyebilir. Sinekler sinek gıda Sükroz en iyi durumu tutmak için her gün % 8 sukroz ve %1 agar gıda ile yeni bir şişe geçin.</li>
	<li>Stresli sinekler geri yeni bir şişe taze uçmak gıda ve taze Maya yapıştır ile onları kurtarmak izin vermek için 18 ° c 3 gündür aktarın. Aç ve yumurtalıkların yumurta odalarından açıklanan62elde etmek için açlıktan kurtarılan sinekler incelemek. Not: Kopyalayabilmek Drosophila yumurtalık elde etmek için sinekler CO2, anestezi ve forseps 2 Çift sinek baş kaldırmak için kullanın ve forseps Bankası yumurtalık "Sineklerin Tanrısı" kaldırmak için karın çekmek için kullanın.</li>
</ol>3) fiksasyon ve disseke yumurta odalarının görüntüleme için boyama
<ol><li>0.5 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) çevresinde disseke yumurta chambers ile birlikte 1 mL santrifüj tüpleri için transfer. Yumurta yerleşmek izin verir. Not: Plastik pipet ipuçları %1 sığır serum su veya yumurta odaları ipuçları plastik yüzeyde sopa önlemek için PBS çözünmüş albumin (BSA) ile kat. Karanlıkta photobleaching kırmızı floresan protein (RFP, DsRed olarak da bilinir) önlemek için aşağıdaki yordamları gerçekleştirin ve yeşil flüoresan protein (GFP) yumurta odalarında.</li>
	<li>Pipetting tarafından PBS kaldırın ve sonra 0.5 mL % 4 paraformaldehyde 20-30 dk için karanlık oda sıcaklığında yumurta chambers düzeltmek için PBS içinde geçerlidir. Not: Bu ve aşağıdaki kuluçka adımları nazik döndürme uygulama.</li>
	<li>Pipetting tarafından paraformaldehyde kaldırın ve sonra yumurta odası 0.5 mL PBST ile yıkanmış (PBS + %0,1 Triton X-100) için 3 kere. Not: Uzun süreli fiksasyon RFP ve GFP sinyalleri azaltmak olabilir.</li>
	<li>PBST ile yumurta salonları, oda sıcaklığında 1-2 h için kuluçkaya veya bir yumurta Chambers'ı permeabilize için nazik döndürme ile 4 ° C'de gece. Not: PBST Ayrıca BSA sigara kaplı plastik yüzey sopa yumurta chambers kaçının.</li>
	<li>Pipetting tarafından PBST kaldırın ve daha sonra mavi nükleer Höchst boya PBST 10 μg/mL 0.5 mL yumurta salonları çekirdeği için leke için oda sıcaklığında 1-2 h için geçerli. NOTE1: Bu non-spesifik sinyal artacak gibi nükleer boya ile uzun süreli kuluçka kaçının. NOT2: Çekirdeği Höchst olmadan leke için alternatif yaklaşımdır 200 eklemek μL anti-beyazlatma DAPI montaj aracıyla (malzemeleri görmek) ve protokol 3.8 açıklandığı gibi cam kapak fişinde dokular Montaj önce gecede63, kuluçkaya. NOTE3: photobleaching önlemek için karanlıkta boyama ve aşağıdaki yordamları gerçekleştirin.</li>
	<li>Pipetting tarafından nükleer boya kaldırmak ve 0.5 mL için 10-20 dk kuluçka her yıkama adım arasında nazik rotasyon ile ile 3 kere 1 mL santrifüj tüpleri yumurta odasında yıkamayı PBST uygulayın.</li>
	<li>İyi pipet ile tüm PBST kaldırmak ve sonra uygulamak 200 μL anti-beyazlatma montaj ajan (tüp altına yumurta chambers lavabo kadar yumurta odaları 3 h için oda sıcaklığında veya gecede 4 ° C'de kuluçkaya için bkz: belgeleri). Not: tam montaj Ajan absorbe doku tüpün dibine lavabo.</li>
	<li>200 μL anti-beyazlatma ile aktarmadan tarafından lekeli yumurta chambers mount Ajan pipetting tarafından görüntüleme için önceden temizlenmiş cam slayt üzerindeki montaj yumurta Odaları bir 20 x 20 mm önceden temizlenmiş cam kapak notu ile kapak ve koyarak cam kaymak kapak fişinde mühür tırnak cilası kapak notu kenarında. NOTE1: Cam slayt ve kapak kayma su ya da % 70ini etanol ile önceden temiz. NOT2: Vazelin cam slayt ve yumurta chambers tarafından overcompression yok önlemek için kapak Not arasında geçerlidir.</li>
	<li>Floresan veya 20 x NA 0,8 kullanarak confocal mikroskop kullanarak yumurta chambers görüntü planı-Apochromat amacı, nükleer boyama için uyarma ışık dalga boyu 405 nm ile (emisyon ~ 461 nm algılama), 561 nm RFP (devam eden veya son caspase aktivite) sinyal () için emisyon ~ 590 nm algılama) ve 488 nm GFP (geçmiş caspase aktivite) sinyal için (emisyon tespit ~ 518nm). Not: Yayımlanmış protokolümüze mikroskobu20,64için bkz.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

CaspaseTracker çift Biyoalgılayıcı bir roman ve son olarak algılanmasını sağlayan benzersiz araç veya devam eden caspase etkinliği ve hücre ölümü ters hücre izleme işlemek ve caspase etkinlik içinde vivoettikten sonra hayatta kalmak. Caspase aktivite geleneksel apoptosis damgasını kabul ederken, apoptotik sigara caspase etkinlik düzenleme nöronal aktivite79, , gibi çeşitli normal hücre fonksiyonları potansiyel rolleri oynar büyüyen çalışmalar or...

Programlanmış hücre ölümü Apoptozis gibi çok hücreli organizmalar1,2,3, yaralı, istenmeyen veya tehlikeli hücrelerde ortadan kaldırarak embriyonik geliştirme ve normal homeostazı önemli bir rol oynar. Hücre ölüm ve yaşam arasında denge kaybı kanser, kalp yetmezliği, otoimmünite ve dejenerasyon4,5,6,7,8gibi ölümcül sonuçlara yol açabilir. Caspases geleneksel olarak "dönüş yok" apoptoz9,10,11, olarak kabul edilmiştir Cellat aktivasyonu hızlı ve büyük hücresel yıkım12tetikler, 13,14,15,16. Bu genel dogma zorlu, kültürlü ölmekte olan Primer hücre ve kanser hücrelerinin değil sadece caspase harekete geçirmek, ama aynı zamanda aşağıdaki önemli hücre sonra plazma zarı blebbing, hücre büzülme de dahil olmak üzere ölüm işaretlerinden kurtarabilirsiniz gösterdi, Mitokondrial parçalanma, mitokondrial sitokrom c yayın sitozol, nükleer ve Kromatin yoğunlaşma, DNA hasarı, nükleer parçalanma, içine hücre yüzey teshir edilmesi Fosfatidilserin (PS) ve apoptotik organları oluşumu 17 , 18 , 19 , 20 , 21. ölen hücreleri hücre ölüm uyaranlara17,18,19,20, kaldırdıktan sonra kurtarabilirsiniz olarak önerdiğimiz bu anastasis bir iç hücre kurtarma olgu olduğunu 21. dönem "Anastasis" (Αναστάσης)18"için Yunanca olarak hayata yükselen" anlamına gelir, icat bu beklenmedik hücre kurtarma fenomeni açıklamak. Anastasis bizim gözlem daha sonra Fosfatidilserin dışa22,23,24, mitokondrial sınırlı da kurtarma hücre ortaya son bağımsız çalışmalar tarafından desteklenen dış membran permeabilization25, karışık soy kinaz benzeri aktivasyon (MLKL) ve hücre büzülme26.
Anastasis düzenleyen mekanizmalar karakterize paradigma kayması fizyolojik, patolojik ve tedavi edici etkileri olacaktır. Anastasis kurtarmak ya da ventrikül sol ventrikül kaldırarak önemli postmitotic hücreleri ve değiştirmek zor olan doku ve muhtemelen kalp yetmezliği tersine çevirme için hesabı korumak için daha önce bilinmeyen cytoprotective mekanizma temsil edebilir aygıtlar (LVADs)27,28, kurtarma sonra aşırı ışık29,30,31geçici pozlama veya onarım nöronların photoreceptor hücrelerinin beyin yaralanması32sonra yardımcı. Öyleyse Anastasis teşvik hücre ve doku kurtarma geliştirmek. Diğer taraftan, anastasis kanser nüks17,18neden terapi, hücre ölüm neden hayatta kalmak için kanser hücreleri tarafından kullanılan bir beklenmeyen kaçış taktik olabilir. Bu nedenle, anastasis kanser hücrelerinin sırasında ölüyor ve kanser tedavisi yanında onların nüks önleme kanser tedavisi için yeni bir tedavi stratejisi olabilir sonra bastırmak.
Anastasis işlemi sırasında biz bulduk kurtarılan bazı hücreler kalıcı genetik değişiklikler satın aldı ve oncogenic dönüşüm uygulandı, DNA hasar nedeniyle büyük olasılıkla apoptosis18,20sırasında,21 tahakkuk . DNA zarar görmüş hücreleri ölüm sürecinin tersine tumorigenesis bir mekanizma olabilir, özofagus kronik termal yaralanma indüklenen gibi potansiyel olarak doku yaralanması tekrarlanan gözlem altında yatan dokuları, çeşitli kanser riskini artırır çok sıcak içecekler33,34,35, alkolizm36,37nedeniyle karaciğer hasarı, tümör evrim tüketimi ise kanser terapisi38, sonra tarafından 39,40ve anti-kanser tedavisi41,42,43,44 döngüleri arasındaki aralıkları sırasında ortaya çıkan normal dokuların üzerinden yeni kanser gelişimi . TRUE ise, anastasis hedefleme önlemek ya da kanser gelişme ve ilerleme tutuklandı. Biz ölmekte olan germ hücreleri açlıktan kaynaklı anastasis yeniden beslenen Drosophila19geçmesi bulduk.  Germ hücreleri DNA hasarı Anastasis ortaya çıkarsa, hesap çevresel stres uzun süreli gözlem için genetik hastalıklar gelişimini destekler olabilir. Örneğin, kıtlıklar diyabet ve Koroner kalp hastalıkları45gibi transgenerational devralınabilir hastalıkların gelişmesine katkıda bulunmak. Bu nedenle, anlayış anastasis devralınabilir hastalıklar bu potansiyel mekanizması tarafından neden geliştirme önleme stratejileri neden olabilir.
Anastasis keşfi koşum ve yenilikçi tedaviler geliştirmek için doğrudan için sebep ve sonucu anastasis Canlı hayvanlarda eğitim esastır. Ancak, bu teknik olarak tanımlamak ve anastatic hücreleri vivo içindeçünkü hücre ölüm işlemi kurtarılan hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez görünür ve hiçbir biyomarker anastasis izlemek için zordur tespit henüz17,18,21. Biz son zamanlarda yeni bir in vivo caspase Biyoalgılayıcı tanımlamak ve sonra caspase harekete geçirmek19,46, Apoptozis hayatta hücreleri izlemek için "CaspaseTracker"19, Özel Sigara İçilir bu sorunları çözmek için geliştirilen Hallmark apoptosis10,14. SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 ve iCasper52 gibi "gerçek zamanlı" caspase biyosensörler dan ayırt devam caspase aktivite algılayan, CaspaseTracker Biyoalgılayıcı, ayrıca kalıcı olarak hücreleri bu hızlı caspase etkinliği bile geçici etiket yeteneği sahiptir. Bu nedenle, caspase-aracılı ters hücre sonra ölüm süreci içinde vivoCaspaseTracker Biyoalgılayıcı anastasis uzun vadeli izlenmesini sağlar.

<table><tbody><tr><td><güçlü > SARF MALZEMELERİ VE REAKTİFLER< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield montaj ortamı</td><td>Vektör Ürünleri</td><td>H-1000</td><td>Antifade montaj ortamı</td></tr><tr><td>Vectashield montaj ortamı (DAPI ile)</td><td>Vektör Ürünleri</td><td>H-1200</td><td>DAPI Forsepsli Antifade montaj ortamı</td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella</td> <td># 505 (110mm, # 5)</td> <td>Dumont cımbız biyoloji sınıfı, paslanmaz çelik</td></tr><tr><td>Asılı Damla Slaytlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Cam slaytlar</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Moleküler Problar</td><td>H1399</td><td>DNA lekesi</td></tr><tr><td>Mitotracker Kırmızı CMXRos&nbsp;</td><td>Moleküler Problar</td><td>M-7512</td><td>Mitokondri boyası</td></tr><tr><td>Parçalanmış kaspaz-3 (Asp175) antikoru</td><td>Hücre Sinyalleme Teknolojisi</td> <td># 9661</td><td>Kaspaz-3</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BAS)</td> aktif parçası için boya <td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td>İmmün boyama için bloke edici ajan</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin&nbsp;</td><td>VWR</td><td>114-056-101</td><td>Triton & trade'i yıkamak ve immün boyamak için ortam</td></tr><tr><td>; Hücre</td><td>geçirgenliği için</td> X-100 <td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td> Deterjan</tr><tr><td><güçlü>Adı< / strong</td><td>>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780 konfokal mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Görüntüleme</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomikroskop Stemi 2000&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila diseksiyon</td></tr><tr><td>AmScope Fiber Optik Çift Deveboynu Mikroskop Aydınlatıcı, 150W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316&nbsp;</td><td>ışık kaynağı</td></tr></tbody></table>

anastasis vivo içinde caspasetracker biyoalgılayıcı tarafından tespit

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Yunanca "hayat yükselen" için) sayede hücreler ölüyor genellikle özünde geri dönüşümsüz olarak kabul edilir son aşama hücre ölüm işlemleri tersine çevirebilirsiniz bir yeni keşfedilen hücre kurtarma olgudur. Anastasis teşvik ilke kurtarma yaralı ya da koru içinde cardiomyocytes veya nöronlar, böylece doku kurtarma kolaylaştırmak gibi değiştirmek zor olan hücreler. Diğer taraftan, kanser hücre ölümü emin olun ve nüks olasılığını azaltmak sonra anti-kanser tedavileri, Apoptozis geçiren anastasis kanser hücrelerinde bastırmak. Ancak, bu çalışmalar anastasis Canlı hayvanlarda tabi hücre kaderi izleme araçları eksikliği ile engel olmuştur. Morfolojik normal görünümlerini kurtarma sonra rağmen hücre ölüm süreci tersine çevirdin mi hücreleri tanımlamak için mücadeledir. Bu zorluk üstesinden gelmek için biz Drosophila ve tanımlamak ve kalıcı olarak anastatic hücreleri içinde vitro veya vivo içindeizlemek memeli CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemleri geliştirdik. Burada, üretimi ve CaspaseTracker çift Biyoalgılayıcı sistemini algılamak ve hücre ölüm bizi canlı tutan geçici maruz kaldıktan sonra anastasis Drosophila melanogaster içinde izlemek için in vivo protokolleri mevcut. Geleneksel biyosensörler ve protokolleri hücreleri aktif olarak geçiren apoptotik hücre ölümü etiketleyebilirsiniz iken, CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sonra caspase etkinleştirme - son aşama apoptosis, damgasını iyileşti hücreleri kalıcı olarak etiketleyebilirsiniz ve aynı anda etkin apoptotik süreçleri tanımlamak. Bu Biyoalgılayıcı da diğer formları doğrudan veya dolaylı olarak caspase etkinliği söz konusu hücre ölümü çalıştı hücre kurtarma izleyebilirsiniz. Bu nedenle, bu iletişim kuralı sürekli bu hücreler ve biyolojik işlevleri, moleküler mekanizmaları, fizyolojik ve patolojik sonuçları ve tedavi edici etkileri gelecekteki çalışmaları kolaylaştırmak onların döl kaderi takip etmemizi sağlar Anastasis. Biz de bu apoptotik sigara caspase aktivite içinde vivogörüntüleyen anastasis geçmesi hücreleri ayırt etmek için uygun kontrollerin tartışıyorlar.

Hızlandırılmış canlı cep mikroskobu yolu anastasis kültürlü hücreleri20için güvenilir bir yöntem olmakla birlikte, kurtarılan hücreleri morfolojik ayırt edilemez görüntülendiðinden hangi hücrelerin anastasis hayvanlarda, uğramıştır tanımlamak zordur hücre ölümü teşebbüs değil normal sağlıklı hücreler. Örneğin, yanıt olarak hücre ölümü Apoptozis1,2,14, hücre büzülme, nükleer yoğunlaşma ve plazma zarı blebb...

Anastasis teknik olarak hücre ölüm süreci tersine çevirdin mi hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez olabilir çünkü vivo içinde tespit etmek zordur. Burada tarif biz tespit ve yeni geliştirilen vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemimizi kullanarak canlı hayvanlarda anastasis geçmesi hücreleri izleme için kullanılan protokol.

Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Bu prosedürün genel amacı, Drosophila melanogaster'i model olarak kullanan canlı hayvanlarda kaspaz aktivasyonundan sonra hücre ölüm sürecinin tersine çevrilmesini tespit etmek ve izlemektir. Ölüm uyaranına yanıt olarak, hücreler, geleneksel olarak hücre ölümüne yol açan geri dönüşü olmayan bir kaskad olarak kabul edilen apoptoz gibi programlanmış hücre ölümüne uğrarlar. Bununla birlikte, ilginç bir şekilde, ölüm uyaranının çıkarılmasından sonra, ölmekte olan bazı hücreler, geç aşamada bile hücre ölüm sürecini tersine çevirebilir.Anastaz adı verilen yeni keşfedilen bir hücre kurtarma fenomeni aracılığıyla. Canlı hücre mikroskobu, apoptotik ölmekte olan hücrelerin, plazmit zarı kanaması, nükleer yoğunlaşma ve hücre büzülmesi gibi benzersiz morfolojik özellikler gösterdiğini gösterir. Genel olarak bu hücrelerin ölmesi beklenir.Bununla birlikte, ölmekte olan hücreleri taze ortamla yıkadıktan ve inkübe ettikten sonra, anastaz geçirirler, iyileşirler ve daha sonra bölünebilirler. Canlı hayvanlarda anastazı tespit etmek ve izlemek zordur, çünkü geri kazanılan hücreler morfolojik olarak çevredeki sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez. Bu sorunu çözmek için, memeli CaspaseTracker biyosensör

detecting-anastasis-in-vivo-by-caspasetracker-biosensor

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Alternatif ekleme düzenlemesinin, çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde önemli bir hücresel program olan epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Burada, EMT sırasında alternatif eklemenin tespiti için indüklenebilir bir EMT modeli kullanan bir yöntemi açıklıyoruz.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

Anastaz terimi, ölmekte olan hücrelerin geç bir aşamada hücre intihar sürecini tersine çevirdiği, kendilerini onardığı ve nihayetinde hayatta kaldığı fenomeni ifade eder. Burada, anastaz geçiren hücreleri tespit etmek ve izlemek için protokoller gösteriyoruz.

Takip inişi, Apoptosisi tersine Cep Survival Fenomeni için Stratejiler

Endoplazmik retikulum kalsiyum homeostazı çeşitli patolojilerde bozulur.  ER kalsiyum deposundaki bozulmaları tespit etmek için salgılanan bir ER kalsiyum izleme proteini (SERCaMP) raportörü kullanılabilir.   Bu protokol, ER kalsiyum homeostazını in vitro ve in vivo olarak incelemek için bir Gaussia lusiferaz SERCaMP'nin kullanımını açıklar.

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

Kaspaz aktivitesi düşük seviyelerini ihtiva Tüm hayvanlarda sağlıklı hücreleri saptamak için, CaspaseTracker belirlenen son derece hassas biyosensör Drosophila için hazırlandı. Kaspaz bağımlı biyosensör aktivitesi ölüm uyarımının olmaması durumunda optimum koşullar altında yetiştirilen yetişkin hayvan iç organlar içinde uzun ömürlü, sağlıklı hücrelerde tespit edilir.

In Vivo Biyosensör Drosophila olmayan apoptotik Kaspaz Aktivite Tracks

Bu iletişim kuralı açıklar caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC); Başlatan caspases, indüklenen yakınlığı hangi onların harekete geçirmek için ilk adımdır görselleştirmek için kullanılan bir görüntüleme tabanlı yöntemi.

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Bu protokol, insan kan örneklerinden monosit türevi makrofajlar (MDM) elde etmek için iş akışını, enflamatuar kaspaz Bimoleküler Floresan Kompleman (BiFC) muhabirlerini hücre canlılığı ve davranışından ödün vermeden insan MDM'sine verimli bir şekilde tanıtmak için basit bir yöntemi ve canlı hücrelerde enflamatuar kaspaz aktivasyonunu ölçmek için görüntüleme tabanlı bir yaklaşımı açıklamaktadır.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Kaspazların İndüklenen Yakınlığının Görselleştirilmesi

Bu protokol, piroptoz, apoptoz, nekroptoz ve PANoptoz gibi hücre ölüm yollarının başlatılmasını belirlemek için hem in vitro hem de in vivo (in fareler) enfeksiyon, steril hakaretler ve kanser modellerine yanıt olarak kaspaz aktivasyonunu (kaspaz-1, kaspaz-3, kaspaz-7, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-11) değerlendirmek için kapsamlı bir yöntemi açıklamaktadır.

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Bu protokol, tümörle ilişkili proteaz aktivitelerinin ex vivo analizi yoluyla bakım noktası kanser teşhisini mümkün kılan bir CRISPR-Cas aracılı, multianalit sentetik idrar biyobelirteç testini açıklar.

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

Bu çalışmada sunulan protokol, cAMP Fark Dedektörünün In Situ  olarak cAMP ölçümündeki etkinliğini iki yöntemle göstermektedir. Bir yöntem, HEK-293 hücreli 96 oyuklu bir plaka okuma spektrofotometresi kullanır. Diğer yöntem, bir floresan mikroskobu altında tek tek HASM hücrelerini gösterir.

Floresan cAMP Fark Dedektörünü Yerinde Kullanarak Canlı Hücrelerde Gerçek Zamanlı cAMP Dinamikleri

Öğrenin, CaspaseTracker biyoalgılayıcı sistemi kullanarak Drosophila melanogaster modelinde canlı hayvanlarda anastazisi tespit ve izleme yöntemlerini. Bu teknik, kaspaz aktivasyonundan sonra hücre ölümünün geri dönüşümünü incelemeyi sağlar.

Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit

Daha fazla video keşfet