Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit

Bu prosedürün genel amacı, Drosophila melanogaster'i model olarak kullanan canlı hayvanlarda kaspaz aktivasyonundan sonra hücre ölüm sürecinin tersine çevrilmesini tespit etmek ve izlemektir. Ölüm uyaranına yanıt olarak, hücreler, geleneksel olarak hücre ölümüne yol açan geri dönüşü olmayan bir kaskad olarak kabul edilen apoptoz gibi programlanmış hücre ölümüne uğrarlar. Bununla birlikte, ilginç bir şekilde, ölüm uyaranının çıkarılmasından sonra, ölmekte olan bazı hücreler, geç aşamada bile hücre ölüm sürecini tersine çevirebilir.

Anastaz adı verilen yeni keşfedilen bir hücre kurtarma fenomeni aracılığıyla. Canlı hücre mikroskobu, apoptotik ölmekte olan hücrelerin, plazmit zarı kanaması, nükleer yoğunlaşma ve hücre büzülmesi gibi benzersiz morfolojik özellikler gösterdiğini gösterir. Genel olarak bu hücrelerin ölmesi beklenir.

Bununla birlikte, ölmekte olan hücreleri taze ortamla yıkadıktan ve inkübe ettikten sonra, anastaz geçirirler, iyileşirler ve daha sonra bölünebilirler. Canlı hayvanlarda anastazı tespit etmek ve izlemek zordur, çünkü geri kazanılan hücreler morfolojik olarak çevredeki sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez. Bu sorunu çözmek için, memeli CaspaseTracker biyosensör sistemi, apoptozun ayırt edici özelliği olan yürütme veya kaspaz aktivasyonundan sonra hücre ölüm sürecini tersine çeviren hücreleri tanımlamak ve izlemek için geliştirilmiştir.

Bu biyosensör sistemi iki bileşenden oluşur: kaspaz aktive edilebilir transaktivatör, rtTA ve Cre LoxP tabanlı rtTA aktivite raporlayıcısı. Kaspaz aktivitesi olmayan sağlıklı hücrelerde, rtTA, kaspaz parçalanabilir DEVD bağlayıcısı aracılığıyla bir plazma zarı ankrajına bağlanır. Bağlı rtTA sitozolden çekirdeğe yer değiştiremediğinden, rtTA raportörü inaktif kalır.

Bununla birlikte, hücre ölümü indüksiyonuna yanıt olarak aktivasyon üzerine, kaspazlar DEVD bağlayıcısını parçalayarak rtTA'nın rtTA raportörünü aktive etmek için çekirdeğe translokasyonunu serbest bırakır. Çekirdeğe girdikten sonra, rtTA tet yanıt elemanına veya TRE'ye bağlanır ve Cre rekombinazın geçici ekspresyonunu tetikleyerek, CAG promotörü ile kırmızı floresan proteini DsRed için kodlama dizileri arasındaki durdurma kodon kasetini kaldıran geri dönüşü olmayan bir rekombinasyon olayına yol açar. Bu, kaspaz aktivitesi ve soyları yaşadıktan sonra canlı kalabilen hücreler için kalıcı floresan markör görevi gören DsRed'in kalıcı ekspresyonu ile sonuçlanır.

Canlı hücre konfokal mikroskobu, geçici hücre ölümü indüksiyonundan sonra, CaspaseTracker biyosensör hücrelerinin iyileşmeleri sırasında ve sonrasında DsRed'i eksprese ettiğini ve bu nedenle onları beyaz oklarla gösterilen kurtarılmamış hücrelerden ve ayrıca hücre ölümü uyaranına maruz kalmayan kontrol biyosensör hücrelerinden ayırt ettiğini göstermektedir. Apoptoz gibi programlanmış hücre ölümünün genellikle geri döndürülemez olduğu varsayılır, çünkü yaygın ve büyük bir hücresel yıkım ile gerçekleştirilir. Bununla birlikte, ölmekte olan hücrenin, sitokrom c salınımı, kaspaz-3 aktivasyonu, DNA hasarı, plazma zarı kanaması, hücre büzülmesi ve apoptotik cisimlerin oluşumu gibi geri dönüşü olmayan nokta olarak kabul edilen geç aşamada bile iyileşebileceğini bulduk.

Yunanca'da hayata yükselmek anlamına gelen hücre ölümü sürecinin tersine çevrilmesine anastaz adını verdik. Canlı hücre mikroskobu kullanarak, kültürlenmiş hücrelerde anastazı gözlemleyebiliriz. Bununla birlikte, canlı hayvanlarda anastazı gözlemlemek teknik olarak zordur, çünkü kurtarılan ölüm hücresi, hücre ölümüne hiç teşebbüs etmeyen normal sağlıklı hücreler gibi görünebilir.

Bu nedenle, canlı hayvanlarda anastazı tespit etmek ve izlemek için bir CaspaseTracker biyosensör sistemi geliştirdik. CaspaseTracker sisteminin Drosophila versiyonu, iki bileşenden oluşan çift bir biyosensördür: kaspazla aktive edilebilir kullanım transkripsiyon faktörü, GAL4 ve G-TRACE olarak bilinen GAL4 aktivite raporlayıcısı. Kaspaz aktivitesi olmayan hücrelerde, maya transkripsiyon faktörü, GAL4, kaspaz ile bölünebilir bir DQVD bağlayıcı vasıtasıyla bir plazma zarı ankraj alanına bağlanır.

Kaspazın aktivasyonu üzerine, aktive edilmiş kaspazlar, GAL4'ü serbest bırakmak için DQVD bağlayıcısını parçalar, bu daha sonra G-TRACE raportörünü aktive etmek için çekirdeğe yer değiştirir. Nükleer GAL4, kaspaz ve GAL4 aktivitesi durana ve RFP proteini bozulana kadar son veya mevcut kaspaz aktivitesinin raportörü olarak görev yapan RFP'nin geçici ekspresyonunu tetiklemek için UAS olarak kısaltılmış spesifik yukarı akış aktivasyon dizilerine bağlanır. GAL4 ayrıca FLP rekombinazının ekspresyonunu tetikler, bu da ubikitin, kısaltılmış Ubi, promotör ve nükleer hedefli GFP için kaplama dizileri arasındaki durdurma kasetini kaldıran bir rekombinasyon olayına yol açar.

Bu, kaspaz aktivitesi yaşamış ancak canlı kalan hücreler ve soyları için kalıcı bir belirteç görevi gören nükleer GFP'nin kalıcı ekspresyonu ile sonuçlanır. Bu nedenle, bu sistem, geçici RFP sinyali ile devam eden veya yakın zamanda kaspaz aktivitesine sahip hücreleri ve kalıcı GFP sinyali ile geçmiş kaspaz aktivitesine sahip hücreleri tanımlayabilir. Bir kontrol biyosensörü, kaspaz bölünme bölgesinde kaspaz aktivitesine duyarsız olan DQVA mutasyonuna sahiptir.

Kaspazmaya duyarlı GAL4 bakire dişi sinekleri, CaspaseTracker sineklerini oluşturmak için G-TRACE genç erkek sineklerle çaprazlandı veya tam tersi. Kaspaz aktivasyonundan sonra hücre ölümü sürecinin geri dönüşümlülüğünü test etmek için, sinekler önce soğuk şok veya protein açlığı gibi geçici, hücre ölümüne neden olan çevresel strese maruz bırakılır. Daha sonra strese giren sinekler iyileşme için normal kültür koşullarına geri aktarılır.

Kontrol, strese girmiş veya iyileşmiş sineklerden yumurtalıklardaki yumurta odacıklarından dokular elde edildi. Numuneler, CaspaseTracker biyosensörünün floresan sinyallerini tespit etmek için konfokal mikroskopiye tabi tutuldu. Başlamak için, anestezi uygulanmış, yakın zamanda kapatılmış kaspaza duyarlı DQVD GAL4, karbondioksit kullanarak uçar ve bir boya fırçası ile 7 ila 10 bakire dişiyi küçük bir parça maya macunu ile taze bir gıda şişesine aktarır.

Dişileri 7 ila 10 genç, G-TRACE GAL4 muhabir erkekle çiftleştirin. Yeni kapatılmış bakire sinekler, larva yeminin kalıntıları olan oklarla gösterilen koyu yeşil mekonyumu gösterir. Yeni kapatılan sinekler, olgun sineklerden daha büyük olma eğilimindedir.

Erkeklerin dairelerle gösterilen daha koyu bir karnı vardır ve dişilerden daha küçük olma eğilimindedir. GAL18 aktivitesi sıcaklıkla arttığından, döldeki CaspaseTracker biyosensöründen gelen spesifik olmayan sinyalleri azaltmak için çaprazı 4 santigrat dereceye ayarlayın. Her üç ila yedi günde bir, yetişkinleri üretkenlikleri azalana kadar maya macunu ile yeni bir şişeye taşıyın.

Döl kapandığında, sinekleri, CaspaseTracker döl sinekleri olarak işlev görecek olan kaspaz-duyarlı GAL4 ve G-TRACE'in her iki transgeni ile bağlayın. Her iki ekleme de Curly-O ile dengelenir. Yani Kıvırcık olmayan kanatlı sinekler her iki transgene de sahip olacaktır.

Negatif bir kontrol için, kaspaz-duyarsız DQVA GAL4 dişileri ile G-TRACE GAL4 muhabir erkekleri arasındaki bir çaprazlamadan çift transgen dölleri toplayın veya bunun tersi de geçerlidir. Deneysel melezlerden, 10 ila 20 yeni kapatılmış dişi sinek kohortlarını maya macunu ile yeni şişelere aktarın. Bazı erkeklerin eklenmesi dişilerin yumurta üretimine yardımcı olacaktır.

İyi beslenmiş sinekleri bir gün boyunca 18 santigrat dereceye aktarın, böylece yumurtalıkları OO-genesis yoluyla yumurta odaları üretir. Daha sonra yumurta odalarını apoptoza maruz bırakmaya teşvik etmek için soğuk şok kullanın. Sinekleri yiyeceksiz yeni bir şişeye aktarın ve bir saat boyunca 7 santigrat derecede dondurun.

Yumurta odası apoptozunu indüklemek için alternatif bir yöntem, sinekleri üç gün boyunca 18 santigrat derecede yüzde 8 sakaroz, yüzde 1 agar yemi üzerinde barındırarak protein açlığını kullanmaktır. Bu yöntemi kullanırken protein içermeyen gıda şişelerini günlük olarak değiştirin. Sinekleri her iki yöntemle de strese soktuktan sonra, iyileşmelerini sağlamak için üç gün boyunca normal barınma durumuna ve yiyeceklere maya macunu ile geri getirin.

Daha sonra yumurta odalarını ve yumurtalıklarını izole etmek için bu sinekleri inceleyin. Onları uyuşturduktan sonra, kafalarını çıkarmak için iki çift forseps kullanın. Sonra yumurtalıklarını çıkarmak için sinekleri karın tabanından çekin.

Plastik pipet uçlarını suda veya PBS'de çözünmüş yüzde 1 BSA ile kaplayarak yumurtalıkları toplamaya hazırlanın, böylece yumurta hazneleri pipet uçlarına yapışmaz. Yumurta odalarını inceledikten sonra, yaklaşık yarım mililitre PBS ile hazırlanmış uçlarda toplayın. Daha sonra bunları bir mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve yumurtaların çökmesine izin verin.

Floresan etiketlerin foto ağartılmasını önlemek için işleme düşük ışık veya tamamen karanlık koşullar altında devam edin. PBS'yi aspire edin ve PBS'de 500 mikrolitre yüzde dört paraformaldehit santrifüj tüpüne yükleyin. Yumurtaların oda sıcaklığında hafifçe döndürerek 20 ila 30 dakika sabitlenmesine izin verin.

Yumurta odalarındaki floresan proteinlerin sinyalini tüketeceği için uzun süreli fiksasyondan kaçının. Sabitlendikten sonra PFA'yı çıkarın ve yumurta odalarını 500 mikrolitre PBS-T ile üç kez yıkayın. Daha sonra yumurta odalarını PBS-T ile gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin, yumurta odalarını geçirgen hale getirmek için hafif bir dönüşle inkübe edin.

Ertesi sabah, yumurta odalarına Hoechst gibi 5 mikrogram mavi nükleer boya içeren 500 mikrolitre PBS-T ekleyin. Oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca hafif bir rotasyonla inkübe etmelerine izin verin, ancak daha fazla değil, aksi takdirde sinyaller spesifik olmayacaktır. Daha sonra, yumurta haznesini PBS-T ile yıkama başına 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Ardından, ince bir pipet kullanarak tüm PBS-T'yi aspire edin ve 200 mikrolitre ağartma önleyici montaj maddesi uygulayın. Dokular, montaj maddesini tamamen emmeden önce üstte yüzer. Ajandaki yumurta odasını 4 santigrat derecede üç saat ila gece boyunca inkübe edin.

Montaj ajanı tamamen emildikten sonra, dokular tüplerin dibine çöker ve monte edilmeye hazır hale gelir. Başlamak için, yumurta odalarını aşırı sıkıştırma nedeniyle tahrip etmekten kaçınmak için cam kaydırağa veya kapak kızağına vazelin uygulayın. Vitray yumurta odalarını monte etmek için 200 mikrolitre montaj maddesi ile bir cam kızağa aktarın ve üzerlerini 20 milimetre karelik bir cam kapak sürgüsü ile örtün.

Kapak fişini oje ile kapatın ve konfokal mikroskopi kullanmaya devam edin. Sağlıklı CaspaseTracker sineklerinde yumurtalığın yumurta odalarında, yeşil ve kırmızı floresan eksikliği ile gösterilen CaspaseTracker biyosensör aktivitesi yoktu. Bununla birlikte, sinekleri üç gün boyunca protein açlığı gibi hücre ölümüne neden olan çevresel strese maruz bıraktıktan sonra, yumurta odaları, RFP ve GFP biyosensör sinyallerini indükleyen kaspaz aktivasyonu ile hücre ölüm sürecine tabi tutuldu.

Buna karşılık, kontrol kaspazına duyarsız DQVA sineklerindeki kaspaz bölünme bölgesinin mutasyonu, biyosensör duyarlılığını ortadan kaldırır, bu da biyosensör sinyallerinin kaspaz aktivitesine bağlı olduğunu gösterir. Daha sonra açlıktan ölen, kaspaza duyarlı biyosensör sineklerine üç gün boyunca proteinli yiyecekler verildi. Kurtarılan sineklerin yumurta odaları, RFP geçici kaspaz raportörünü ifade etmedi, bu da yakın zamanda veya devam eden kaspaz aktivitesi olmadığını gösteriyordu.

Daha da önemlisi, geri kazanılan yumurta odaları sadece GFP'yi ifade etti, bu da kaspaz aktivasyonundan sonra hücre ölüm sürecini tersine çevirdiklerini gösteriyor. Anastaz ayrıca gözlenir in vivo geçici hücre ölümüne neden olan sıcaklık stresinden sonra. Soğuk şoka yanıt olarak, ölmekte olan yumurta odaları, RFP sinyali ile temsil edilen son veya devam eden kaspaz aktivitesini ve GFP sinyali ile temsil edilen geçmiş kaspaz aktivitesini gösteren RFP ve GFP biyosensör belirteçlerini ifade eder.

Bununla birlikte, üç gün boyunca normal kültür durumuna dönerek stresi azalttıktan sonra, kurtarılan sineklerdeki yumurta odaları sadece GFP kaspaz raportörünü gösterdi, bu da bu yumurta odalarındaki hücrelerin kaspaz aktivasyonundan sonra bir noktada anastaz geçirdiğini gösterdi. Özellikle, GFP CaspaseTracker sinyali, yumurta odalarındaki çoklu hücre tiplerinin, hücre ölüm sürecini tersine çevirebildiğini ve oositler ve hemşire hücreleri gibi germ hattı hücreleri ve somatik folikül hücreleri dahil olmak üzere kaspazlardan kaynaklanan hasarı onarabildiğini ortaya koymaktadır. İlginç bir şekilde, GFP ayrıca kök hücreler içeren germaryumdaki hücreleri, aynı yumurtalık zincirindeki ilişkili yumurta odalarıyla birlikte etiketledi.

Bu nedenle, bu GFP pozitif yumurta odaları, anastaz geçiren kök hücrelerden türetilmiş olabilir. İşte çevresel strese maruz kalmadan CaspaseTracker biyosensör aktivitesini gösteren dokuları gösteren resimler. Bunlar ağız kısımları, ön bağırsak, ekin, orta bağırsak, arka bağırsak, Malpighian tübülleri, anüs, yumurta kanalı ve disseke edilmiş, yeni kapatılmış, Gün 0 dişi sineğin yumurtalıklarıdır.

Konfokal mikroskopi, RFP ile gösterildiği gibi son kaspaz aktivitesini ve GFP ile gösterilen geçmiş kaspaz aktivitesini ortaya çıkarır. Büyütülmüş görüntüler, optik lob, kardia, Malpighian tübülleri, arka bağırsak ve F-aktin boyası ile birlikte lokalize olan yumurta odalarındaki kas duvarlarında yakın zamanda veya devam eden ve geçmiş kaspaz aktivitesini göstermektedir. Yumurta kanalı gibi bazı dokular sadece geçmiş kaspaz aktivitesini gösterir.

Bu biyosensör aktiviteleri, embriyonik gelişim veya normal homeostaz sırasında potansiyel anestezik aktiviteyi düşündürür. Ayrıca mevcut veya geçmiş apoptotik olmayan kaspaz aktivitesini de gösterebilir. Daha fazla ayrıntı için lütfen el yazmasına bakın.

İn vivo CaspaseTracker biyosensörü, kaspaz bölünmez dizisi DQVA'nın biyosensör aktivitesine sahip olmadığı için kaspaz aktivitesini özellikle bildirir. Buradaki tek sinyal, pigmentlerden, kütiküllerden ve yağ cisimlerinden gelen spesifik olmayan otomatik floresan sinyalidir. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hayvanlarda anastazı tespit etmek ve izlemek için CaspaseTracker biyosensör sistemini nasıl kullanabileceğimize dair genel bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu biyosensörler, anastazın para birimi ve bilinen işlevi ile ilgili çalışmaları kolaylaştırabilir. Erişimin tanımlanması çok çeşitli fizyolojik, patolojik ve terapötik uygulamalara sahiptir. Bu biyosensörler, kaspaz aktivasyonundan sonra apoptozun tersine çevrilmesini tespit edebilirken, aynı zamanda hücrelerin doğrudan veya dolaylı olarak kaspaz aktivitelerini içeren diğer hücre ölümü formlarını denedikten sonra iyileşmesini de tespit edebilir.

Bir deney tasarlarken, anestezik hücreleri izleyen floresan biyosensör sinyalini, devam eden kaspaz aktivitelerine sahip ölmekte olan hücrelerden ayırt etmek için karşılıklı kontrollerin dahil edilmesi çok önemlidir. Mevcut veya geçmişte bilinen apoptotik kaspaz aktivitelerine ve pigment, yağ ve kritikten spesifik olmayan otomatik floresan sinyaline sahip sağlıklı hücreler. Lütfen ayrıntılı tartışmayı bu el yazmasının PDF versiyonunda bulabilirsiniz.